p16的实时体内成像^墨水4a揭示与p53的相声

诱导第16页^墨水4a细胞衰老和器官衰老中的表达

因为归纳第16页^墨水4a表达是细胞衰老的标志(Hara等人，1996年;Serrano等人，1997年)，我们接下来问第16页^墨水4a该基因对小鼠细胞的衰老刺激作出反应。为此，MEF由p16-luc页通过连续传代或在培养基中异位表达致癌Ras使小鼠衰老。与内源性p16水平同时发生^墨水4a在两种环境下诱导细胞衰老后，荧光素酶活性显著增加(图2)表明人类第16页^墨水4a该基因对小鼠细胞的衰老刺激也有反应。此外，由于老鼠的水平第16页^墨水4a随着年龄的增长，许多不同组织中的基因表达增加(Zindy等人，1997年;Krishnamurthy等人，2004年)，生物发光信号的水平p16-luc基因在整个身体的衰老过程中，小鼠数量急剧增加(图3，A和B). 然而，在中央腹部观察到最显著的增加，并发现其局限于小肠和脾脏(图3，A和B; 和图S2). 这些水平与外源性（人类）和内源性（小鼠）密切相关第16页^墨水4a信使核糖核酸表达(图3、C和D). 总的来说，这些结果表明人类的整体调节第16页^墨水4a基因表达与小鼠非常相似第16页^墨水4a基因表达，至少在小鼠细胞中，说明了p16-luc页分析用小鼠第16页^墨水4a体内抗致癌刺激的基因表达.

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图2。

人类的诱导第16页^墨水4a培养MEF细胞衰老开始期间的基因表达。（A和B）主要MEF来源于p16-luc页通过连续传代（A）或致癌Ras表达（逆转录病毒感染；B）使小鼠衰老。内源性水平第16页^墨水4a检测其表达和荧光素酶活性。给出了三个独立实验的代表性数据。为了证实衰老，显示了SAβ-gal活性染色的细胞的代表性照片。β-肌动蛋白作为负荷对照。显示了三个独立实验的平均值±SD。WB、Western blot。

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图3。

的动态第16页^墨水4a体内衰老过程中的基因表达.（A） 相同的p16-luc小鼠在其整个生命周期中每2周接受一次非侵入性BLI。显示了10只独立小鼠的代表性图像。（B） p16-luc页对小鼠（年轻和老年）进行无创BLI。然后在麻醉下通过口腔和肛门切开相同的小鼠。（A和B）颜色栏指示具有最小和最大阈值的光子。（C） 记录年轻（1.5个月）和老年（22.5个月）小鼠器官发出的生物发光强度（log10比例）。显示了五个独立实验的平均值±SD。（D） 外源（人类）水平第16页^墨水4a基因表达与内源性（小鼠）第16页^墨水4a用半定量RT-PCR分析年轻（Y；1.5个月）和老年（O；22.5个月）小鼠的基因表达。β-肌动蛋白作为负荷对照。给出了五个独立实验的代表性数据。

的延迟响应第16页^墨水4a体内抗肿瘤Ras信号的表达

尽管在培养的正常HDF中广泛观察到致癌Ras诱导的衰老(Serrano等人，1997年;塞拉诺和布拉斯科，2001年;坎皮西，2005年;吉尔和彼得斯，2006年;Kim和Sharpless，2006年)，新分离的HDF对致癌Ras诱导的衰老具有抵抗力，因为其水平较低第16页^墨水4a基因表达(Benanti和Galloway，2004年). 为了在更生理的环境中探索这一概念，而不是在培养细胞中使用致癌Ras的异位表达p16-luc页小鼠接受传统的化学诱导皮肤乳头状瘤方案，单剂量DMBA，然后用TPA进行多次治疗。因为该方案导致H（H）-ras（拉斯维加斯）基因(Quintanilla等人，1986年)，它似乎是研究第16页^墨水4a活体动物中抗癌Ras信号的基因表达。与之前的研究一致(Quintanilla等人，1986年;坎普，2005年)，良性皮肤乳头状瘤在治疗7周后开始出现，并在接下来的18周内继续增大(图4 A，底部，早期乳头状瘤）。尽管在此期间几乎无法检测到生物发光信号，但随着乳头状瘤停止生长，生物发光信号显著增强(图4 A，顶部，晚期乳头状瘤）。生物发光信号的水平与内源性p16的水平密切相关^墨水4a表达以及其他衰老标志物，如衰老相关（SA）β-半乳糖苷酶（β-gal）活性(Dimri等人，1995年)和pRb的去磷酸化(图4，A–C;坎皮西，2005年)表明致癌Ras信号源于内源性H-ras公司基因确实刺激p16^墨水4a伴随衰老细胞周期阻滞的体内表达.

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图4。

The dynamics of第16页^墨水4a皮肤乳头状瘤形成过程中的基因表达。（A） p16-luc页用DMBA/TPA治疗的小鼠在开始TPA治疗后的指定时间点接受无创BLI。图中显示了10个独立实验的代表性图像（顶部）。这些乳头状瘤是在暗光下拍摄的（下图）。颜色栏指示具有最小和最大阈值的光子。（B） 使用左侧所示的抗体显示了皮肤乳头状瘤或对照正常皮肤的活检样本的代表性蛋白质印迹。使用文丘林作为负荷控制。（C） 苏木精和伊红（HE）染色、SAβ-半乳糖染色和免疫组织化学检测内源性第16页^墨水4a使用皮肤乳头状瘤或对照正常皮肤的活检样本，检测Ser807处pRb的表达、Ki67的表达、组蛋白H2AX（γ-H2AX）的磷酸化和Ser18处p53的磷酸化。方框表示以下放大倍数较高的区域（p16染色）。（D） ROS水平通过皮肤乳头状瘤或对照正常皮肤的活检样本进行测量。显示了三个独立实验的平均值±SD。

注意，p16的水平^墨水4a早期乳头状瘤的表达略高于正常皮肤(图4、B和C). 然而，由于在早期乳头状瘤中观察到显著水平的pRb磷酸化和Ki67表达，这是细胞增殖的标志物(图4C)，此水平的p16^墨水4a表达似乎不足以诱导衰老细胞周期阻滞。因此，很容易推测第16页^墨水4a可能在晚期乳头状瘤中发挥更重要的作用，可能阻止良性肿瘤的恶性转化。事实上，DMBA/TPA治疗后30周，33%的患者第16页^墨水4a敲除小鼠（C57BL/6背景）至少有一种癌症，而野生型小鼠只有5%（未发表数据），这表明第16页^墨水4a在预防良性肿瘤恶性转化中起着重要作用。这些结果与之前的一项研究相一致，该研究表明，DMBA处理小鼠的无瘤生存率在第16页^墨水4a基因敲除小鼠(夏普莱斯等人，2004年).

晚期乳头状瘤组蛋白3 Lys9（H3K9）二甲基化（H3K9me2）的全球水平降低

考虑到H-ras公司已知该基因在DMBA治疗后立即发生(Quintanilla等人，1986年)确实在早期乳头状瘤中观察到(图S3)，令人困惑第16页^墨水4a晚期而非早期乳头状瘤中基因表达完全诱导(图4，A–C). 我们首先推断第16页^墨水4a基因表达可能是由Ras信号强度的自发上调引起的，因为高水平而非低水平的致癌Ras表达已被证明可诱导第16页^墨水4a携带四环素诱导物转基因小鼠的基因表达ras（拉斯维加斯）致癌基因(Sarkisian等人，2007年). 然而，出乎意料的是，早期乳头状瘤中磷酸化MEK（MAPK/ERK激酶）的水平甚至高于晚期乳头状瘤(图4 B)这意味着致癌Ras信号对第16页^墨水4a发起人(Serrano等人，1997年;Ohtani等人，2001年)可能在早期乳头状瘤中被抵消。

为了证实这一观点，我们接下来寻求了第16页^墨水4a其活性在早期乳头状瘤中增加的表达。在我们的研究过程中，我们发现DNMT1的水平，这是已知的抑制第16页^墨水4a表达式(Robert等人，2003年)，在早期乳头状瘤中显著增加，在晚期乳头状瘤则减少(图4 B). 这些结果使我们推测，DNMT1水平的增加可能抵消致癌Ras信号传导对第16页^墨水4a早期乳头状瘤中的启动子，随后DNMT1水平降低，从而使第16页^墨水4a基因启动子，可能通过改变DNA甲基化状态第16页^墨水4a晚期乳头状瘤的基因启动子。然而，出乎意料的是第16页^墨水4a早期和晚期乳头状瘤的启动子没有实质性差异(图5)，表明DNMT1可能会调节第16页^墨水4a在这种情况下，基因表达可以是间接的，也可以是通过DNMT1的不同活性进行的。

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图5。

小鼠亚硫酸氢盐序列分析第16页^墨水4a基因启动子。鼠标示意图第16页^墨水4a基因启动子显示在顶部，序列从启动Met密码子的前面向后编号（数字的位置由垂直破折号表示）。转录起始点由粗垂直线表示，转录方向由相关箭头表示。鼠标的编码区域第16页^墨水4a基因被注释并用一个封闭的方框表示。CpG二核苷酸的聚类显示为穿过启动子区域的细垂直线。甲基特异性PCR引物的位置用两个小箭头表示如下。亚硫酸氢处理的DNA是从正常皮肤或早期或晚期乳头状瘤中制备的(图4). 将甲基化特异性PCR产物亚克隆到pGEM-T载体中，并对每个样本的10个克隆进行测序。给出了三个不同实验的典型结果。

最近研究表明，DNMT1还具有通过与G9a（一种主要的H3K9单甲基和二甲基转移酶）相互作用来增强H3K8甲基化的活性(Estève等人，2006年). 因此，我们接下来检查了皮肤乳头状瘤发展过程中H3K9甲基化的水平。有趣的是，H3K9me2的全球水平在早期乳头状瘤中显著升高，在晚期乳头状瘤则降低，这与皮肤乳头状瘤发展过程中DNMT1的水平一致(图4 B). 这些结果，再加上先前的研究表明第16页^墨水4a基因表达与几个人类肿瘤细胞系中H3K9甲基化相关(Nguyen等人，2002年;巴赫曼等人，2003年)，导致我们假设DNMT1的水平可能调节第16页^墨水4a通过改变H3K9me2在第16页^墨水4aDMBA/TPA诱导的皮肤乳头状瘤发育过程中的基因启动子区。

Ras信号强度和DNMT1表达水平之间的平衡调节p16^墨水4a表达

为了验证这一假设并阐明相关的分子机制，我们接下来使用了初级HDF，因为小鼠缺乏DNMT1（DNMT1）基因对胚胎致命(Li等人，1992年)和第16页^墨水4a基因对小鼠原代细胞的组织培养应激非常敏感(Zindy等人，1997年;Parrinello等人，2003年). 值得注意的是，在培养的HDF中，DNMT1的水平最初通过致癌Ras的表达而增加，随后随着细胞达到衰老阶段而降低(图6 A). 这让人想起我们对DMBA/TPA诱导的皮肤乳头状瘤的研究结果(图4 B). 请注意，DNMT1的级别绑定到第16页^墨水4a培养HDF中致癌Ras诱导衰老的基因启动子显著减少(图S4 A). 此外，H3K9me2在第16页^墨水4a基因启动子在相同的环境下也显著减少(图6 B)，表明类似的机制可能参与第16页^墨水4a体外（培养的HDF）和体内（小鼠皮肤）致癌Ras信号转导的基因表达。

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图6。

DNMT1水平与H3K9me2水平的相关性第16页^墨水4a基因启动子。（A） 早期传代TIG-3细胞感染编码致癌Ras的逆转录病毒（+H-RasV12）。然后在指定的时间用左侧显示的抗体对细胞进行Western blot（WB）分析，并对细胞内ROS水平进行分析。（B） 早期传代TIG-3细胞被编码致癌Ras（RasV12）的逆转录病毒或对照空载体感染10 d，并用所示抗体进行Western blotting，分析细胞内ROS水平，并使用所示抗体（IP）进行ChIP分析。通过实时定量PCR（qPCR）使用特异于第16页^墨水4a上述基因启动子(Bracken等人，2007年). （C和D）早期传代TIG-3细胞感染编码shRNA的逆转录病毒DNMT1（DNMT1）用嘌呤霉素筛选后第7天从细胞中制备细胞提取物，并进行Western blotting和定量实时RT-PCR（RT-qPCR）分析第16页^墨水4a基因表达（C），并使用H3K9me2（D）抗体进行ChIP分析。（D） 使用特异于第16页^墨水4a上述基因启动子(Bracken等人，2007年). （A–D）显示了三个独立实验的平均值±SD。

值得注意的是，在增殖的早期传代HDF中观察到大量磷酸化MEK（Ras信号转导指标（阳性因子）和DNMT1（阴性因子）(图6 A)RNAi导致DNMT1水平的耗竭导致第16页^墨水4a早期传代HDF中伴随衰老样细胞周期阻滞的基因表达(图6 C以及图S4、B和C）。此外，DNMT1水平与第16页^墨水4a基因启动子和H3K9me2第16页^墨水4aDNMT1敲除细胞中的基因启动子也显著减少(图6 D和图S4 D）。因此，很可能第16页^墨水4a通过Ras信号强度（正因子）和DNMT1表达水平（负因子）之间的平衡，基因至少部分受到调控。注意正常皮肤中Ras信号的强度很低(图4 B). 这可以解释为什么第16页^墨水4a尽管正常皮肤中DNMT1的表达水平很低(图4 B). 总之，这些结果表明DNMT1水平的增加可能会抵消致癌Ras信号传导对第16页^墨水4a基因启动子，可能通过促进H3K9me2围绕第16页^墨水4a早期乳头状瘤的基因启动子。值得注意的是，致癌Ras信号被显示为激活DNMT1（DNMT1）基因启动子(MacLeod等人，1995年). 因此，DNMT1表达的诱导似乎是由致癌Ras表达的直接作用引起的。然而，尚不清楚为什么在晚期乳头状瘤和培养的HDF中致癌Ras诱导的衰老中DNMT1水平随后降低(图4 B和6安).

DDR引发第16页^墨水4a通过降低DNMT1水平表达

因为一些证据表明，由高细胞增殖触发的DDR在肿瘤诱导衰老的发病中起着关键作用(Bartkova等人，2006年;Di Micco等人，2006年;Mallette等人，2007年)接下来，我们询问由超细胞增殖引发的DDR是否与晚期乳头状瘤DNMT1水平的降低有关。事实上，在检测到γ-H2AX病灶和含有ATM（共济失调毛细血管扩张突变）/ATR（ATM和Rad3相关）底物基序的蛋白质磷酸化之前，皮肤乳头状瘤中pRb的磷酸化和Ki67的表达显著增加，这是超细胞增殖的标志(图4C和图S4 E）。此外，使用DNA损伤剂阿霉素（DXR）治疗后，DNMT1和H3K9me2修饰显著减少第16页^墨水4a基因启动子，伴随着第16页^墨水4a培养HDF中的基因表达(图S5、A和B). 总之，这些结果表明，过度细胞增殖引发的DNA损伤积累可能导致晚期乳头状瘤中DNMT1水平的降低。

为了了解DNA损伤如何导致DNMT1水平降低，我们接下来关注细胞内活性氧（ROS）水平，因为已知ROS水平会因致癌Ras表达和DNA损伤而增加（图S5A；芬克尔和霍尔布鲁克，2000年;麦克劳德，2008年)ROS水平的增加对培养的HDF中致癌Ras诱导的衰老的发生至关重要(Lee等人，1999年). 在培养的HDF中，晚期乳头状瘤和致癌Ras诱导的衰老中ROS水平显著增加(图4 D和6安). 此外，当在培养的HDF中添加过氧化氢酶减弱ROS生成时，致癌Ras表达导致的DNMT1水平降低有所减少（图S5 C）。相反，用H治疗₂O（运行）₂增加细胞内ROS水平可显著降低DNMT1（DNMT1）HDF中的基因表达（图S5 D），可能是通过阻断E2F转录因子的活性，因为已知E2F活性激活DNMT1（DNMT1）基因表达(McCabe等人，2005年)并通过H治疗减少₂O（运行）₂（未描述）。总之，这些结果提供了令人信服的证据，证明DNA损伤会引发第16页^墨水4a通过阻断DNMT1（DNMT1）ROS水平升高的基因表达。

BLI和图像采集

为了检测荧光素酶的表达，将小鼠麻醉并腹腔注射75 mg/kgd日-荧光素钠盐开始光子记录前5分钟。如前所述，从活体小鼠或分离器官中获得光子(Ohtani等人，2007年). 简言之，将小鼠放在密闭的室内，首先用暗光记录小鼠的灰度图像，然后使用冷却电荷耦合器件（CCD）相机（PIXIS 1024B；普林斯顿仪器）采集发光图像。通过2×2装箱和15分钟暴露，信噪比增加。为了在动物身上实现发光光子发射的共定位，使用Image-Pro Plus（媒体控制论）合并灰度图像和伪彩色图像。

肿瘤诱导实验

10只老鼠p16-luc页将处于毛发周期静止期的线（8周龄）剃光，并用100µl丙酮中的100µg DMBA（7,12-二甲基苯并[a]蒽）处理。DMBA治疗1周后，用12.5µg TPA（12-o-十四烷基佛波醇13-醋酸盐）和100µl丙酮每周两次治疗小鼠15周。对照组小鼠用丙酮代替DMBA/TPA治疗。

H-ras测序

使用TRIZOL试剂（Invitrogen）从皮肤乳头状瘤和对照正常组织中分离出总RNA。RNA通过寡核苷酸（dT）引物转化为cDNA，330-bp PCR片段包含H-ras公司用5′-TGGGGCAGGAGCTCCTGGAT-3′和5′-CTGTACTGATGGTCCTC-3′引物扩增该基因。使用pGEM-T Easy矢量系统（Promega）亚克隆PCR片段，并使用染料终止器和Big-Dye循环测序系统（Applied Biosystems）进行测序。

半定量RT-PCR

使用TRIZOL试剂分离总RNA，并使用2µg总RNA进行逆转录反应。PCR使用混合Taq聚合酶（丰田）和小鼠特异性引物进行第16页^墨水4a基因，人类第16页^墨水4a基因与小鼠β-肌动蛋白基因如下所示。人类第16页^墨水4a，5′-ACCAGAGGCAGTAACCATGC-3′（正向）和5′-TGTTCGTGCGGGCGCAACTG-3′（反向）；鼠标第16页^墨水4a，5′-GAACTCTTTCGGTCGTACCC-3′（正向）和5′-TGGGCGTGCTTGAGCTGA-3′（反向）；和β-肌动蛋白，5′-GTATGGAATCCTGGCATC-3′（正向）和5′-AAGCACTTGGTGCACGAT-3′（反向）。

实时RT-PCR

使用SYBER Premix EX Taq系统（TAKARA）和Prism 7900HT（ABI）进行定量实时RT-PCR。扩增信号经凝胶电泳证实为单带，并归一化为3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）水平。使用SDS2.1软件（ABI）分析数据。使用的PCR引物序列如下：GAPDH公司，5′-CAACTACATGTGTACATGTTC-3′（正向）和5′-GCCAGTGGACTCCACGAC-3′（反向）；人类第16页^墨水4a，5′-CCCAACGCACCGAATA-3′（正向）和5′-ACCAGCGTGCCAGGAAG-3′（反向）；鼠标第16页^墨水4a，5′-GACTCTTTCGGTCGTACCC-3′（正向）和5′-CGAATCTGCACCGTAGTTGA-3′（反向）；人类DNMT1（DNMT1）5′-TACTCGGACGACCCGACCTCTC-3′（正向）和5′-CGTTGGCACAAGATGGACA-3′（反向）；鼠标DNMT1（DNMT1），5′-GAGGAGGCTCTACA-3′（正向）和5′-AGTGAGAGTGTGTTCCGT-3′（反向）；转基因5′末端，5′-GCAGAAAGCCAGGAGGTG-3′（正向）和5′-GCCGCAGACAGGTGAC-3′（反向）；转基因3′端，5′-TCCTTATCCTTACCCACT-3′（正向）和5′-TGATGATCCTATGGT-3′（反向）；和GAPDH公司（人类/小鼠通用序列），5′-AGACCACAGTCCATGCCATC-3′（正向）和5′-TTGCCACACGTGGCAG-3′（反向）。

组织学和免疫组织化学

如前所述进行免疫组织化学(Ohtani等人，2007年). 所用的主要抗体为小鼠p16（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、γ-H2AX（Millipore）、磷酸化pRb（Ser807/811；细胞信号技术）、Ki67（RTU-Ki67-MM1；Novocastra）和磷酸化（Ser/Thr）-ATM/ATR底物（细胞信号技术）。使用的荧光色素为DAPI（Dojindo）和Alexa Fluor 546（Invitrogen）。使用荧光显微镜（AxioImager.A1；Carl Zeiss，Inc.），通过使用AxioVision软件（Carl Zeiss，Inc.）的EC Plan-Neofluar 10×NA 0.3 Ph1、40×NA 0.75 Ph2或63×NA 1.25 oil Ph3物镜，与CCD相机（Axio CamMRc5；Carl蔡司，Inc.）连接，在RT时获得显微图像。

细胞和细胞培养实验

早期传代（45个PDL）HDFs（TIG-3细胞）、MEFs、293T细胞和U20S细胞在37°C添加10%FBS的DME中培养。如前所述进行逆转录病毒感染(Takahashi等人，2006年). 在RNAi实验中，HDF感染了编码短发夹RNA（shRNA）的逆转录病毒，如前所述(前原诚司等人，2005年). 使用的RNAi序列如下：scramb，5′-CATTGCTATAGAGGCAGAT-3′；人类DNMT1（DNMT1），5′-TGGTCCGCATGGGCTATCAGT-3′；和人类第53页，5′-GACTCAGTGGTTAATCTAC-3′。

如前所述进行SAβ-gal染色(Dimri等人，1995年). 使用倒置显微镜（AxioVert 135；Carl Zeiss，Inc.），通过AxioVision软件的Achrostigmat 10×NA 0.25 Ph1物镜连接AxioCamMRc5 CCD相机，在RT下获得显微图像。如前所述，使用DAPI进行SA异色病灶分析(Narita等人，2003年). 显微图像是在RT时使用AxioImager获得的。A1荧光显微镜通过使用AxioVision软件的EC Plan-Neofluar 63×NA 1.25油Ph3物镜与AxioCamMRc5 CCD相机相连。

蛋白质印迹分析

如前所述进行免疫印迹(Takahashi等人，2006年). 使用的主要抗体包括人类p16（EMD）、Ras（EMD，pRb（BD）、vinculin（hVIN-1；Sigma-Aldrich）、小鼠p16（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、DNMT1（Santa Cruz Bintechnologies，Inc.），H3K9me2（Abcam）、磷酸化-MEK1/2（Ser217/221；细胞信号技术）、MEK1/2（细胞信号技术，和磷酸-p53（细胞信号技术）。

亚硫酸氢盐序列分析

如前所述进行亚硫酸氢盐测序分析(铃木等人，2006年).

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

使用EZ-ChIP（Millipore）进行ChIP分析。使用的抗体为抗H3K9me2（Abcam）、抗RNA聚合酶II（Millipore）和抗IgG（Millipore）作为阴性对照。如实时RT-PCR所述，通过实时定量PCR对免疫沉淀DNA进行定量。PCR引物的序列如前所述(Bracken等人，2007年).

我们感谢N.E.Sharpless博士提供的第16页^墨水4a敲除小鼠，R.Agami和R.Bernards（荷兰阿姆斯特丹荷兰癌症研究所）用于RNAi载体，M.Serrano（西班牙马德里西班牙国家癌症研究中心）用于编码H-RasV12的逆转录病毒载体。我们还感谢Y.Shinkai博士（日本京都京都大学）对H3K9me2的分析提出了宝贵建议，并感谢C.Sugita女士（日本东京都京都日本癌症研究基金会）和S.Chiba女士（日本德岛县栗本町德岛大学）对小鼠实验的协助。

这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部、细胞科学研究基金会、三菱基金会、奈藤基金会、高松公主癌症研究基金、武田科学基金会和赛车纪念基金会的资助。