蛋白激酶CαC2结构域的静电和疏水相互作用差异调节膜结合动力学^*

克隆、诱变和纯化

大鼠PKCαDNA是Y.Nishizuka和Y.Ono（日本神户神户大学）赠送的礼物。对C2结构域（残基179-283）进行PCR扩增，并使用EcoRI和XhoI限制性位点将其亚克隆到pGEX-4T3-GST质粒中。使用定点突变创建C2域突变R216A、R249A、R252A、K268A、W245A、W247A、L191A和W274A。大鼠PKCα的C2结构域表达为谷胱甘肽S公司-如前所述，BL21-pLysS细胞中的转移酶（GST）融合蛋白(29). 使用凝血酶从谷胱甘肽-Sepharose 4B结合的融合蛋白中分离出C2结构域。使用摩尔消光系数通过紫外吸收测定各种C2结构域的浓度(20). 人类PKCα是T.Hunter（索尔克研究所）赠送的，是Gateway（Gateway克隆技术）克隆到pcDNA3-YFP中的。突变R249A和W247A是使用定点突变产生的。最大现金流量(13)和GolgiCFP(11)之前已经描述过。

脂质囊的制备

对于停流荧光光谱法，将氯仿中的磷脂在氮气下干燥，然后真空干燥2 h。将脂质重新悬浮在不同NaCl浓度（150–200 m）的缓冲液中米)和20米米HEPES，pH 7.4。将再悬浮的脂质冷冻/解冻五次，并通过两个0.1μm聚碳酸酯过滤器挤压，以制备直径为100nm的磷脂囊泡。如前所述，对磷浓度进行分析，以确定磷脂浓度(42).

停流荧光光谱法

如前所述，使用应用光物理pi*-180停流荧光分光光度计测定与脂质囊泡结合的动力学(4). 对于关联实验，纯化C2域蛋白（0.2–1.0μ米)在指定的钙浓度下与等量增加浓度的丹磺酰标记阴离子磷脂囊泡（PS/PC/dPE，35:60:5 mol比）快速混合²⁺如前所述，监测NaCl浓度和蛋白-膜荧光共振能量转移（FRET）(4). 对于解离实验，纯化C2域蛋白（0.2–1.0μ米)用丹磺酰标记的磷脂囊泡（PS/PC/dPE，35:60:5摩尔比）预孵育15–30分钟，然后在指定的钙浓度下与等量的10倍过量的未标记阴离子磷脂囊泡快速混合（PS/PC，40:60摩尔比）²⁺和NaCl浓度，如前所述(20). 根据指数方程，使用KaleidaGraph将轨迹拟合到非线性最小二乘曲线拟合中，

哪里F类(吨)等于观察到的荧光时间吨,F类₀是表示最终荧光的荧光偏移量，A类_{光突发事件(我)}等于振幅k个_{操作系统(我)}是观察到的速率常数我第个，共个n个阶段。实验是在伪一阶条件下进行的；将观察到的速率常数绘制为脂泡浓度的函数，并用线性方程进行拟合，

哪里k个_在表示表观二阶关联速率常数，以及k个_远离的表示表观离解速率常数。比率k个_远离的（根据FRET关联实验确定）至k个_在（由FRET捕获实验确定）提供了计算的表观囊泡解离常数(K（K）_天^计算).

荧光光谱法测定稳态钙²⁺结合

C2域的固有Trp发射（0.5μ米)如前所述，在Jobin Yvon-SPEX FluoroMax-2荧光分光光度计上使用280 nm激发光并记录25°C下345 nm的发射(20). 观察到的荧光变化（ΔF类_{光突发事件})绘制为游离钙的函数²⁺浓度(x个)并拟合到以下修正的希尔方程，

式中ΔF类_最大表示计算的最大荧光变化，n个_H（H）表示表观希尔常数，以及[Ca²⁺]½代表Ca²⁺滴定中点的浓度，平均Ca的近似值²⁺离解常数。因为[Ca²⁺]½远远大于蛋白质浓度，即总钙的浓度²⁺作为自由浓度。

PKCαC2结构域突变体的膜结合动力学

评估静电的个人贡献对在C2结构域结合和解离速率常数中的疏水相互作用，我们使用停流荧光光谱测量C2结构域突变体的结合动力学。具体来说，我们测量了丹磺酰标记的脂质小泡与C2结构域中四种固有色氨酸之间的FRET，以获得结合速率常数(k个_在). Ca中三种带电残基的任何一种突变²⁺Ala循环（R216A、R249A和R252A）对k个_在(图2A类和表1). 相反，Ca中疏水残基的突变²⁺与野生型结构域相比，环（W245A和W247A）显著降低了关联速率常数(图2A类和表1). 钙远端两个残基的突变²⁺回路（K268A和W274A）导致k个_在注意，尽管单个Trp残基的突变降低了FRET最大变化的幅度(例如～W247A突变体的2倍），这不影响动力学分析，并且数据具有高度重复性（S.E.<2%）。与碱性残基相比，去除疏水残基对降低缔合速率常数的作用更强，这表明Ca内残基的疏水作用而非静电作用²⁺-结合环是C2结构域向膜募集的主要驱动力。

在单独的窗口中打开

图2。

C2结构域上的碱性或疏水性到中性突变影响其在脂质泡上的补充和保留。 A类用FRET缔合停流荧光光谱法测定纯化C2结构域（野生型、R216A、R249A、R252A、K268A、W245A、W247A、L191A或W274A）与阴离子磷脂囊泡的结合。C2结构域蛋白（0.2–0.5μ米)在200μ米钙²⁺和150米米NaCl，如“实验程序”所述。丹磺酰基排放量随时间变化而测量k个_{光突发事件}采用单相拟合确定。这个k个_在根据线性图的斜率计算k个_{光突发事件} 对囊泡浓度。数据表示加权平均值±S.E(误差线)3-7个独立实验。B类，纯化的C2结构域（野生型、R216A、R249A、R252A、K268A、W245A、W247A、L191A或W274A）与阴离子磷脂囊泡的结合通过FRET解离-停止流动分析来测量。C2域蛋白（0.2–0.5μ米)用丹磺酰标记的磷脂囊泡（PS/PC/dPE，35:60:5摩尔比）孵育至少15分钟。然后将蛋白质和标记的脂质与等体积的高10倍浓度的未标记阴离子磷脂囊泡（PS/PC，40:60 mol比）在200μ米钙²⁺和150米米氯化钠。丹酰排放量作为时间的函数进行测量k个_远离的采用单相拟合确定。数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。

为了测量膜上各种突变体的离解速率常数，我们用丹磺酰标记的脂质囊泡平衡C2结构域，然后使用FRET监测添加10倍多余的未标记囊泡后从标记囊泡的离解。Ca中三种带电残基的任何一种突变²⁺对Ala的循环显著增加了k个_远离的与野生型C2结构域的值相比：R216A、R249A和R252Ak个_远离的数值分别高出6倍、16倍和6倍(图2B类和表1). 注意，Arg-249突变为Leu使解离速率常数改变了8倍（相比之下，Ala突变为16倍）（数据未显示）。这个k个_远离的与野生型结构域相比，W245A和W247A突变体也分别增加了4倍和9倍。这个k个_远离的L191A与野生型域相似(表1). 远端残基Lys-268和Trp-274突变为Ala导致k个_远离的稍微减少(表1). 这些结果表明，Ca中特定残基产生的静电和疏水相互作用²⁺-结合环对于保留膜上的C2结构域至关重要，而Arg-249在保留阴离子膜上C2结构域方面发挥着特别重要的作用。

C2结构域突变对膜平衡结合常数的影响

使用实验确定的值k个_在和k个_远离的，我们计算了K（K）_天^计算针对每个C2域突变体。中的数据表1揭示出K（K）_天^计算Ca中碱性残基所在C2域的值²⁺环被突变为Ala比野生型C2结构域至少高6倍；这个K（K）_天^计算与野生型相比，R216A、R249A和R252A的值分别增加了8倍、21倍和6倍。疏水残基的突变导致平衡解离常数更大的增加；K（K）_天^计算与野生型C2结构域相比，W245A和W247A突变体的值分别增加了21倍和20倍。无重大变化K（K）_天^计算在Leu-191突变为Ala时观察到。同样K（K）_天^计算K268A和W274A突变体。这些结果与先前的研究一致，即Ca²⁺-结合环决定C2结构域与阴离子膜的平衡结合。在这里，通过对单个动力学常数的分析，我们确定了碱性对疏水残基在膜的补充和保留中的作用。重要的是，我们已经确定了两个残基，即Arg-249和Trp-245，其对丙氨酸的个别突变导致了膜亲和力的类似整体变化（21倍），但机制相反；碱渣影响k个_远离的，疏水残基主要影响k个_在。

C2结构域突变对离子强度敏感性的影响

接下来，我们讨论了C2结构域中带电或疏水残基的突变如何影响膜募集的离子强度敏感性。将离子强度从150 m增加到175 m米NaCl导致k个_在野生型C2域；当进一步增加到200 m时，此增加被逆转米氯化钠(图3A类). 对于R216A突变体也观察到了同样的趋势。观察到的增加k个_在随着离子强度从150米增加到175米米可能反映了疏水相互作用的加强；然而，更高的离子强度可以屏蔽静电相互作用，例如阴离子磷脂头部基团和C2结构域之间的静电相互作用k个_在相反，增加离子强度显著增强k个_在Trp-245或Trp-247突变为Ala的区域。最显著的是，离子强度从150 m改变到200 m米NaCl导致k个_在W247A突变的水平与野生型结构域的水平相当(图3A类). 因此，增加离子强度可以避免k个_在主要疏水残留物的去除。与此结果一致的一种解释是，增加离子强度会增强剩余的疏水相互作用。因此，去除关键的疏水残留物(例如Trp-247）减少k个_在然而，剩余疏水相互作用的加强(例如由Trp-245介导）通过增加离子强度增加速率常数。对于L191A的缔合速率常数，仅观察到改变离子强度的微小影响(图3A类)、W274A和K268A域（未显示）。这些数据强调了疏水相互作用在驱动C2结构域与膜的结合中的关键作用。

在单独的窗口中打开

图3。

C2域突变体膜结合动力学的离子强度敏感性。 A类，纯化C2结构域（野生型、R216A、R249A、R252A、W245A、W2.47A或L191A）与阴离子磷脂囊泡的结合通过FRET关联停流分析测定，如图例所述图2A类。除所示NaCl浓度增加外，其他条件均相同。数据表示加权平均值±S.E(误差线)3-7个独立实验。B类，纯化C2结构域（野生型、R216A、R249A、R252A、K268A、W245A、W247A、L191A或W274A）与阴离子磷脂囊泡的结合通过FRET离解阻止流分析测定，如图2B类。除所示NaCl浓度增加外，其他条件均相同。数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。C类，的K（K）_天^计算值是从k个_在和k个_远离的从FRET关联和解离实验中获得A类和B类数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。

接下来我们研究了离子强度如何控制C2域突变体的膜分离速率常数。这个k个_远离的野生型C2结构域随着离子强度的增加而增加，几乎增加了3倍k个_远离的在200 m处测量米NaCl与150 m相比米氯化钠(图3B类). 增加了3倍k个_远离的200 m处米NaCl与150 m相比米除W245A外，所有突变体均观察到NaCl。对于这个域，改变离子强度对k个_远离的这表明，对于该突变体，疏水相互作用的增加弥补了静电相互作用的减少，而对于所有其他突变体和野生型结构域，静电相互作用在膜保留中占主导地位。

离子强度对C2结构域突变平衡常数的影响

接下来，我们检查了离子强度增加对K（K）_天^计算从中获得的值k个_在和k个_远离的，如上所示。规范化K（K）_天^计算150 m处获得的值米NaCl表明，R216A、R249A、R252A和L191A的相对离子强度敏感性与野生型C2结构域的相对离子密度敏感性具有相同的趋势(图3C类). 相反，W245A和W247A与脂质囊泡的结合亲和力对所检测条件下离子强度的变化不敏感(图3C类). 审查k个_在和k个_远离的到K（K）_天^计算揭示了募集和保留的变化相互抵消，因此表观脂质囊泡结合亲和力对离子强度的增加不敏感。因此，如果没有这些疏水残基，C2结构域与阴离子膜的平衡结合对离子强度变化不敏感，而野生型C2结构域和荷电-中性残基突变对离子强度增加敏感。

C2域双突变的动力学常数

为了检测带电残基是否协同促进C2结构域与阴离子膜的结合，我们在PKCα的C2结构域中引入了碱基残基的双重突变：R216A/R249A、R249A/R252A和R216A/R52A。虽然以前的研究已经检查了R249A/R252A、R216A和R249A对平衡结合的贡献，但这些残基的组合和单独贡献k个_在和k个_远离的尚未报告(24–26). 我们使用FRET结合和FRET离解实验测量了这些结构域的结合动力学。这个k个_在R216A/R252A和R249A/R252A的值与野生型C2结构域的值相当(图4A类和表2). 相反，k个_在R216A/R249A突变与野生型C2结构域相比减少了约2倍(图4A类和表2). 这些数据表明，Arg-216或Arg-249足以使C2结构域与膜的结合不受损害，但这两种电荷的损失都会损害膜的结合。

在单独的窗口中打开

图4。

C2结构域上的双电荷对中性残基突变影响其在脂质囊泡的募集和滞留。纯化的C2结构域（野生型、R216A/R249A、R216A/R252A或R249A/R252A）与阴离子磷脂囊泡的结合通过FRET缔合停流分析进行测量k个_在按照图例中的描述确定图2A类数据表示加权平均值±S.E(误差线)3-7个独立实验。B类用FRET离解阻止流分析法测定纯化C2结构域（野生型R216A/R249A、R216A/R252A或R249A/R252A）与阴离子磷脂囊泡的结合，并用荧光定量分析法测定C2结构域与阴离子磷脂的结合k个_远离的按照图例中的描述确定为图2B类数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。

与对关联速率常数的适度影响相反，k个_远离的与野生型C2结构域相比，R216A/R249A、R216A/R252A和R249A/R52A结构域增加了50倍、37倍和38倍(图4B类和表2). 这些结果证实了这些带电荷的残基在脂质囊泡保留C2结构域方面发挥的关键作用。双突变体R216A/R249A和R216A/R252A的平衡解离常数的总体增加（比野生型C2结构域高148倍和41倍）与每个残基的独立贡献一致。然而，与野生型C2结构域相比，R249A/R252A突变只导致37倍的增加，而不是～120倍，这是两个残基独立作用的结果(表2). 因此，Arg-249和Arg-216独立参与C2结构域与膜的结合，而Arg-252和Arg-248具有冗余功能。

钙的作用²⁺C2域动力学和平衡常数的浓度

令人惊讶的是，R216A、R249A和R252A的荷电中性突变在其向细胞膜的募集中仅显示出轻微的变化。然而，以前的研究表明，静电相互作用在C2结构域的膜招募中起着关键作用，包括PKCα的膜招募(4,20,31). 检查钙的作用²⁺我们测量了过饱和（低）钙和饱和（高）钙时的结合动力学²⁺浓度（20和200μ米分别）使用FRET关联和FRET分离实验。增加Ca²⁺浓度为20至200μ米导致k个_在(图5A类和表3). 然而，在150 m处未观察到关联动力学的差异米NaCl与200 m相比米氯化钠。在2μ米钙²⁺（未显示数据）。解离速率常数对钙也很敏感²⁺浓度；增加Ca²⁺浓度降低了k个_远离的野生型C2域～5倍(图5B类和表3). 因此，总平衡解离常数随着Ca的增加而增加7倍²⁺浓度降低(图5C类和表3). 增加离子强度对k个_远离的和K（K）_天^计算在低钙和高钙条件下（增加约3倍）²⁺浓度。这些结果支持了之前的一项研究，该研究表明钙²⁺结合既增加了缔合速率常数，又降低了离解速率常数(4)并揭示了测试浓度下的离子强度效应与钙无关²⁺浓度。

在单独的窗口中打开

图5。

增加Ca²⁺影响C2结构域在脂质囊泡的募集和滞留。 A类在20μ米（低）或200μ米（高）钙²⁺通过FRET关联停流分析进行测量，并且k个_在按照图例中的描述确定图2A类数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。B类在20或200μ米钙²⁺通过FRET离解阻止流分析测量，并且k个_远离的按照图例中的描述进行测量图2B类.加权平均值是根据三个或四个独立实验计算得出的。C类，的数据k个_在在中获得A类和k个_远离的在中获得B类用于计算K（K）_天^计算。

C2结构域突变对Ca的影响²⁺结合

因为Ca²⁺结合驱动C2结构域向阴离子膜的募集和保留(4)，我们接下来讨论C2结构域的突变如何影响Ca²⁺结合。为了做到这一点，我们监测了C2结构域的Trp淬灭作为Ca增加的函数²⁺阴离子脂质小泡存在或不存在时的浓度。在不含脂质的情况下，钙的半最大结合²⁺（[钙²⁺]用32±4μ米钙²⁺(表4)，如前所述(21). Arg-216突变对Ca无显著影响²⁺结合。相反，Arg-249或Arg-252突变导致Ca浓度大幅增加²⁺半最大结合所需（分别为44倍和12倍）。钙的强烈减少²⁺当阴离子脂质囊泡饱和浓度存在时，亲和力被消除(表4). 奇怪的是，Trp-245的突变对[Ca只有适度（2倍）的影响²⁺]在没有小泡的情况下为½，但在饱和脂质浓度的情况下，亲和力显著降低22倍。相反，Trp-247的突变增加了[Ca²⁺]在没有和存在脂质小泡的情况下均为½～8倍。这些数据表明，精氨酸和色氨酸残基在结合钙中起关键作用²⁺，其中一些残基在膜结合状态中起着更主要的作用(例如Trp-245），一些在无膜状态下更占优势(例如Arg-249和Arg-252），以及其他有助于独立于膜结合的结合(例如Trp-247）。