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自然医学。作者手稿；2017年1月1日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
Nat Med.2016年1月；22(1): 78–83.
2015年12月14日在线发布。 数字对象标识：2010年10月18日
预防性维修识别码：项目经理4762215
NIHMSID公司：NIHMS759518
PMID：26657143

ABT263清除衰老细胞对小鼠衰老造血干细胞的再生作用

张建辉,1,2,9 王莹莹,1,2,三，9 邵立坚,1,2 雷米·马丁·拉贝奇,4 马可·德马里亚,4 朱迪斯·坎皮西,4,5 克里希那穆尔蒂·贾纳基拉曼,6 诺曼·夏普莱斯,6 盛鼎,7 魏峰,1,2 伊洛,1,2 王晓燕,1,2 Nukhet Aykin-Burns公司,1,2 金伯利·克拉格,1,2 乌沙·波纳潘,8 马丁·豪尔·延森,1,2 孟爱民,三和周道红1,2
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补充资料

摘要

衰老细胞（SC）随着年龄的增长和基因毒性应激后的积累，如全身照射（TBI）1–6.使用转基因方法在进展期小鼠模型中清除SCs可延缓几种与年龄相关的疾病7这表明SC在某些与年龄相关的病理中起着致病作用。因此，一种可以选择性杀死SC的“衰老”药物有望使组织干细胞恢复活力并延长健康寿命。为了验证这一想法，我们筛选了一组化合物，并将ABT263（抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-xL的特异性抑制剂）鉴定为一种有效的衰老药物。我们发现，ABT263通过诱导凋亡，以细胞类型和物种依赖的方式选择性地杀死培养中的SC。将ABT263口服给亚致死剂量照射或正常年龄的小鼠，可有效地耗尽SCs，包括衰老骨髓造血干细胞（HSC）和衰老肌肉干细胞（MuSCs）。值得注意的是，这种耗竭减轻了TBI诱导的造血系统过早衰老，并使正常衰老小鼠的衰老HSC和MuSC恢复活力。我们的结果表明，药物对SCs的选择性清除在一定程度上是有益的，因为它可以使老化的组织干细胞恢复活力。因此，抗衰老药物可能代表一类新的辐射缓解剂和抗衰老剂。

以往识别选择性杀伤SC的小分子的工作只产生了两种非特异性和细胞类型的选择性衰老药物8为了确定更具特异性和广谱活性的衰老药物，我们采取了一种有针对性的方法，即分别滴定少数小分子的细胞毒性，这些小分子参与了被预测对SC生存能力或维持其表型很重要的途径(补充表1和2). 我们研究了这些化合物对人WI-38成纤维细胞的影响，因为该细胞系已被广泛用于研究培养中复制和应激诱导的过早衰老9,10在与化合物孵育后，我们评估了非基因或通过电离辐射（IR）、复制衰竭或致癌治疗诱导衰老的WI-38细胞的存活率Ras公司表达式。使用这种方法，我们确定ABT263是一种有效的衰老药物，可以选择性、有效和快速地杀死SCs，无论SCs是如何诱导的(图1a、b和补充图1). 此外，ABT263治疗以细胞类型和物种依赖的方式对SCs具有细胞毒性：衰老的人成纤维细胞（IMR-90）、人肾上皮细胞（RECs）和小鼠胚胎成纤维细胞对ABT263的治疗比非新生细胞更敏感(图1c).

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ABT263在细胞培养和小鼠中具有衰老活性。(一)用ABT263浓度增加的药物治疗72 h后，活WI-38非基因细胞（NC）、IR-诱导衰老细胞（IR-SC）、复制衰竭衰老细胞（Rep-SC）或Ras-诱导衰老细胞(n个=3–6（对于NC和IR-SC）；n个=代表SC为3；n个=4（对于Ras-SC）。(b条)在用1.25µM ABT263（左）处理IR-SC后的指定时间内，或在细胞用1.25μM ABT263-孵育指定时间后，去除药物并再培养72小时（右），对存活的IR-SC进行定量(n个= 3). (c（c）)在用增加浓度的ABT263治疗72 h后，定量活的非基因（NC）和IR诱导的衰老（IR-SC）人IMR-90成纤维细胞（IMR-90）、人肾上皮细胞（REC）和小鼠胚胎成纤维细胞(n个=每组3人）。(d日)实验设计e–g给假辐射（Ctl）和TBI治疗的年轻雄性p16-3MR小鼠注射载体（Veh）、更昔洛韦（GCV）或ABT263（ABT），并按指示进行分析。腹腔注射；口服。(e（电子）)左图为Ctl和TBI小鼠经溶媒、GCV或ABT263治疗后的典型发光图像。右，全身发光的定量（以任意单位a.u.计）（Ctl小鼠：载体处理，n个= 6; GCV处理，n个= 4; ABT263处理后，n个= 6; TBI小鼠：车辆处理，n个= 8; GCV处理，n个= 4; ABT263处理，n个= 7). 纳入野生型C57BL/6小鼠（WT）作为阴性对照。垂直颜色条指示发光强度。比例尺，15毫米(如果)根据指示治疗的Ctl或TBI小鼠肺部发光的定量(n个=每组5人）。(克)mRNA表达定量Cdkn2a、Il1a、Tnfa、Ccl5和Cxcl10公司按照指示治疗的Ctl或TBI小鼠的肺部(n个=每组4人）。自始至终，数据均为平均值±标准偏差**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001和****P（P）<0.0001与无ABT263相比一（单因素方差分析）；与用相同浓度ABT263处理的NC相比c（c）; 与Ctl相比e–g; 双向方差分析c–g.

确定ABT263是否具有衰老作用体内，我们使用亚致死剂量照射的p16-MR转基因小鼠。这些小鼠携带一个由细胞周期素依赖性激酶抑制剂2a控制的三峰报告蛋白（3MR）(Cdkn2a公司; 也称为第16页)发起人(补充图2a)11p16是一种广泛使用的SC生物标记物和干细胞老化调节剂12–14。3MR编码的转基因编码一种融合蛋白，包括雷尼利亚荧光素酶（用于生物发光成像）、单体红色荧光蛋白（mRFP，用于分类和荧光显微镜）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），可将更昔洛韦（GCV）转化为有毒的DNA链终止剂，选择性地杀死表达HSV-TK-的SC11). 因此，p16-3MR小鼠可用于识别、追踪和选择性杀伤p16+SC公司体内通过全身发光成像，年轻（2个月大）p16-3MR小鼠暴露于亚致死剂量（6 Gy）的TBI诱导SC丰度的时间依赖性增加(补充图2b、c). 未经辐照的p16-3MR小鼠在8个月大时显示出少量SC积累（根据发光测定）（数据未显示）。这些发现与观察结果一致，即SC在40周龄之前的正常小鼠中很罕见，但在暴露于基因毒性损伤后迅速积累12,13TBI后，肺SCs增加最多，骨骼肌和大脑次之；肝脏和心脏出现轻微增加(补充图2d，e). 两个GCV治疗周期有效清除了p16-3MR小鼠TBI诱导的SCs；值得注意的是，ABT263治疗也有类似的效果(图1d，e). 通过分析肺部证实SC清除率，其中GCV或ABT263治疗不仅降低了IR诱导的SC(图1f)而且还抑制了几种衰老相关分泌表型（SASP）因子的表达15(图1g). 因此，ABT263治疗在清除受照射的p16-3MR小鼠的IR诱导的SCs方面与GCV治疗一样有效。

ABT263是多种肿瘤细胞凋亡的有效诱导剂16为了确定ABT263是否诱导SCs凋亡，我们在有无泛酶抑制剂Q-VD-OPh（QVD）的情况下，检测了载体或ABT263治疗后IR诱导的WI-38 SCs的凋亡17在QVD存在的情况下，ABT263治疗对SCs的选择性杀伤被废除(图2a、b)表明ABT263的杀伤依赖于细胞凋亡的诱导。QVD治疗还能保护IR诱导的衰老IMR-90成纤维细胞和RECs抵抗ABT263细胞毒性(补充图3a、b). 根据衰老相关β-半乳糖苷酶（SA–β-gal）的表达，照射后的WI-38细胞只有在完全衰老后才对ABT263敏感(图2c). 这个结果表明衰老，而不是DNA损伤就其本身而言，使细胞对ABT263敏感。ABT263可能通过内在凋亡途径杀死SCs18,19，因为处理后的SCs显示激活的caspase-3水平增加，但caspase-8或受体相互作用蛋白（RIP）1水平没有增加(图2d，e).

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ABT263通过凋亡杀死SCs。(一)用于测量凋亡（左）和活细胞百分比定量的代表性流式细胞术图（门II：PI−膜联蛋白V−)和凋亡（闸门III和IV：PI−膜联蛋白V+和PI+膜联蛋白V+)用载体（Veh）、1.25µM ABT263、20µM Q-VD-Oph（QVD）或ABT263和QVD的组合处理24小时后的WI-38 IR-SC（右）细胞。(b条)量化使用载体或ABT263±QVD治疗72小时后存活IR-SC的百分比一(c（c）)SA–β-gal的定量+细胞（白色条）暴露于增加剂量的IR后10天（左）或用10 Gy IR治疗后增加时间后10天，以及用1.25µM ABT263额外孵育72小时后受照细胞在这些条件下的生存能力（灰色条）。(d日)与载体或1.25µM ABT263（ABT）孵育24小时后，对NC和IR-SC中的procaspase-8（Procasp-8）、裂解caspase-9（cCasp-8）、RIP1、裂解RIP1（cRIP1）和β-actin进行代表性的western blot分析。(e（电子）)顶部，NC和IR-SC中原胱天冬酶-3（原胱天冬酶-3）、裂解的胱天冬酶-3（c胱天冬酶-3）和β-肌动蛋白的代表性蛋白质印迹分析d日底部，NC和IR-SC中Procasp-3和cCasp-3的规范化表达d、 e（电子）相同的情况下，将相同的β-actin印迹作为两个面板的对照。用足叶乙甙或细胞色素c处理的Jurkat细胞的细胞裂解液混合物作为阳性对照（Ctl），检测cCasp-3和cCasp-8。(如果)IR（10 Gy）处理后，western blot分析显示WI-38细胞中BCL-2、BCL-xL、BAK和BAX的正常表达增加倍。(克)与载体、2.5µM ABT199、0.625µM WEHI539或ABT199和WEHI539.的组合孵育72小时后，对NC（左）和IR-SC（右）存活率进行量化。(小时)用特异性对照shRNA（Ctl）或shRNAs转染72小时后NC和IR-SC活性的量化BCL2、BCL2L1或两者兼而有之BCL2级和BCL2L1型在整个过程中，数据是三个实验的平均值±s.e.m.，除了小时(n个= 5). *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001和****P（P）< 0.0001; 单向方差分析c、 （f）; 双向方差分析b、 e、g、h.

如先前的研究所建议的，确定SCs是否由于抗或促凋亡蛋白的差异表达而对ABT263比非基因细胞更敏感19,20，我们测量了SCs中这些蛋白质的水平。ABT263敏感性与抗凋亡BCL-xL和促凋亡BAK的表达增加相关，但与抗凋亡BCL-2或促凋亡BAX、BAD、BID、BIM或NOXA蛋白的表达增加无关(图2f和补充图3c、d). 用ABT199处理细胞，单独抑制BCL-2或BCL-xL功能（参考。21)或WEHI539（参考。22)分别没有选择性地杀死SC；然而，ABT199和WEHI539联合治疗确实起到了作用(图2g和补充图3e、f). 这一发现表明，BCL-2和BCL-xL以冗余方式保护SC免于凋亡死亡，因此需要同时抑制BCL-2与BCL-xL活性才能选择性诱导SC凋亡。与这个想法一致，下调BCL2级或BCL2L1型（分别编码BCL-2和BCL-xL）通过使用这些转录物特有的短发夹RNA（shR-NAs）表达对SC生存的影响最小，但两者都下调BCL2级和BCL2L1型表达选择性降低SC活性(图2h).

我们之前的研究4显示亚致死剂量TBI可导致长期骨髓损伤，表现为HSC自我更新和造血功能持续下降。这种作用可能是通过诱导HSC衰老介导的，因为TBI治疗小鼠的HSC的mRNA表达增加Cdkn1a型（另一种常用的SC生物标志物）和Cdkn2a公司SA–β-半乳糖染色增加，克隆形成活性降低(补充图4). IR治疗诱导的衰老HSC表现出与衰老动物HSC相似的表型，包括自我更新能力、克隆形成能力和长期重新繁殖能力的降低，以及髓样细胞倾斜4,23–26因此，IR诱导的长期骨髓损伤可被视为造血系统过早老化的模型4,23–29此外，长期照射患者的骨髓损伤会随着时间的推移或在额外的造血应激后，促进低增生性贫血、骨髓增生异常综合征或白血病的发生30–32.

使用我们的亚致死TBI C57BL/6小鼠模型4，我们询问ABT263治疗是否能有效清除SC，包括IR治疗诱导的衰老HSC，以及SC清除是否能恢复过早老化的造血系统和/或减轻IR诱导的长期骨髓损伤。受辐射对照（车用治疗）小鼠的骨髓造血干细胞在Cdkn2a公司mRNA和SA–β-gal水平与sham-照射（Ctl）小鼠HSC的比较(图3a，b)表明亚致死TBI诱导HSC衰老。根据这些标记物的评估，ABT263治疗有效清除了衰老的HSC。ABT263治疗对衰老HSC的清除并没有定量降低骨髓中HSC和造血祖细胞（HPC）的百分比和数量(补充图5). 相反，ABT263治疗显著改善了克隆原性(图3c)照射后HSC移植到主要和次要受体后的长期植入能力(图3d–f和补充图6). 此外，ABT263治疗（i）减轻了TBI诱导的HSC髓系倾斜(图3e、f和补充图6)，显著的衰老表型；（ii）减弱HSC静止的破坏（根据细胞周期G0期HSC的百分比评估），这可能导致HSC过早衰竭；（iii）减少持续DNA损伤的HSC数量(补充图7). 髓系偏斜的减弱可能部分归因于淋巴生成增加(补充图8).

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通过ABT263或GCV治疗清除SC可使TBI后HSC恢复活力(一)实验设计b–f给假辐射（Ctl）和TBI处理的年轻雄性C57BL/6小鼠注射载体（Veh）或ABT263（ABT），并按指示进行分析。(b、 c（c）)量化Cdkn2a公司mRNA水平(b条，左；n个=3个生物重复）和SA–β-gal的百分比+单元格(b条，对；n个=每组4只小鼠），以及骨髓细胞（BMC）中第35天鹅卵石区域形成细胞（CAFC）的数量；c（c）;n个=每组4只小鼠）。#P（P）与Ctl小鼠相比<0.05；&P（P）与媒介物处理的TBI小鼠相比<0.05；双向方差分析；未注明，无法检测。(d日)竞争性和系列骨髓移植方案（BMT；详见在线方法）。(e、 （f）)代表性流式细胞仪图(e（电子）)和量化(如果)供者衍生的总白细胞（CD45.2+;e（电子），顶部；如果，左上角）和T细胞（T；CD45.2+胸腺1.2+)，B细胞（B；CD45.2+B220型+)和髓细胞（M细胞；CD45.2+CD11b/等级-1+) (e（电子），底部；如果)初次BMT后受体小鼠的外周血（PB）(n个=每组6个收件人）。二级受体PB中的供体细胞移植如图所示补充图6. (克)实验设计h–j小时用载体或GCV治疗假辐射（Ctl）和TBI暴露的年轻雄性p16–3MR小鼠，并按指示进行分析。(小时)SA–β-gal百分比的量化+按照以下步骤处理的小鼠分选HSC中的细胞克（Ctl小鼠：车辆处理，n个= 7; GCV处理，n个= 7; TBI小鼠：车辆处理，n个= 11; GCV处理，n个= 12). (我)BMC中第35天CAFC数量的量化（Ctl小鼠：车辆治疗，n个= 3; GCV处理，n个= 3; TBI小鼠：车辆处理，n个= 7; GCV处理，n个=6）。(j个)主要受者PB中供体或衍生的总细胞、T细胞、B细胞和M细胞百分比的量化（Ctl供体：载体处理，n个=3个收件人；GCV处理，n个=5个收件人；TBI捐赠者：车辆处理，n个=7个收件人；GCV处理，n个=9个收件人）。自始至终，数据均为平均值±s.e.m.Inf、 j个,#P（P）与Ctl小鼠供体衍生细胞受体相比<0.05；&P（P）与接受车用TBI小鼠供体衍生细胞的受体相比，<0.05；在里面h、 我,#P（P）与Ctl小鼠相比<0.05；&P（P）与车用TBI小鼠相比，<0.05；双向方差分析；未注明，无法检测。

ABT263使受照小鼠过早老化的造血系统恢复活力的机制似乎主要是通过ABT263对衰老HSC的选择性细胞毒性，因为ABT263治疗在培养中对TBI治疗小鼠分离的HSC具有选择性细胞毒作用，但对非辐射对照小鼠的HSC没有影响(补充图9a). 我们认为，通过ABT263治疗清除衰老的HSC可以促进正常HSC克隆的扩张，这些克隆可以避免或修复IR诱导的损伤，从而能够扩展到空出的HSC生态位。ABT263治疗还消除了IR诱导的HSC和骨基质细胞SASP反应(补充图9b，c)15,33; 这种对SASP反应的影响也可能通过改善骨髓微环境，促进TBI后HSC的再生。为了更严格地验证ABT263治疗对受照小鼠造血系统的恢复是通过SC清除介导的这一观点，我们使用GCV治疗，在p16-3MR小鼠暴露于6 Gy TBI后，特异性地耗尽SCs，以类似于对接受TBI治疗的C57BL/6小鼠给予ABT263的方式(图3a，g). GCV对受照p16-3MR小鼠SCs的耗竭作用(图3g–j)ABT263处理的TBI暴露C57BL/6小鼠的研究结果(图3b–f、h–j)支持ABT263对TBI治疗诱导的早产造血系统的有益作用主要是因为SCs的杀伤。

与TBI治疗小鼠的效果类似，ABT263治疗清除了正常衰老小鼠的SCs(图4a). ABT263治疗还显著降低了与年龄相关的Cdkn2a、Tnfa（编码肿瘤坏死因子（TNF）-α）和抄送5（编码趋化因子CCL5）在肺部(图4b). 在小鼠中，衰老与包括HSC和MuSC在内的组织干细胞的定性而非定量减少有关，这在一定程度上归因于干细胞衰老25,34尽管HSC是否随着年龄的增长而衰老取决于p16的上调，仍存在激烈的争论，但来自老龄小鼠的HSC在单细胞克隆原性、长期再生能力和平衡的多系分化方面始终存在缺陷24,25所有这些与年龄相关的HSC改变都通过ABT263治疗而减弱，因为与车辆治疗的老年小鼠相比，来自ATB263治疗的老年鼠的HSC在培养中的克隆生成活性有了显著提高，并且能够在骨髓移植后进行长期和多系移植(图4c、d和补充图10). 此外，我们研究了ABT263治疗对正常衰老小鼠后肢骨骼肌中分离的MuSCs的影响。ABT263治疗正常衰老小鼠与从车用治疗衰老小鼠分离的MuSCs相比，提高了培养中分离的MuSC的克隆原性(图4e–g). 这种改善与p16阳性、磷酸化p38（p-p38）的MuSC数量显著减少有关+衰老MuSCs的生物标志物）和DNA损伤标志物γ-H2AX(图4e–j和补充图11)被认为是衰老的MuSC34这些发现表明，对正常衰老小鼠的ABT263治疗清除了骨髓中衰老的HSC和骨骼肌中的MuSC，并使剩余的HSC和MuSC的功能恢复活力。

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ABT263治疗清除SC可使正常衰老小鼠的HSC和MuSCs恢复活力。(一)21至22个月大的雄性p16-3MR小鼠（老年）接受载体（Veh；n个=7）或ABT263（ABT；n个=8），根据图3a.2个月大的雄性p16-3MR小鼠（年轻；n个=5）未经治疗，使用WT C57BL/6小鼠作为对照。垂直颜色条指示发光强度。#P（P）<0.05，与幼鼠相比，&P（P）<0.05，与车辆处理的老龄小鼠相比；未成对学生的t吨-测试。比例尺，15 mm(b–j)年龄（21至22个月大）的雄性C57BL/6小鼠根据所示方案接受载剂（Veh）或ABT263（ABT）图3a治疗1周后进行分析；未经治疗的2月龄雄性C57BL/6小鼠（幼年）作为对照。(b条)mRNA水平变化的量化Cdkn2a、Tnfa和抄送5在老年人的肺部（Veh，n个= 11; ABT、，n个=10）和年轻(n个=9）小鼠。(c（c）)使用分类长期HSC（LT-HSC；CD34）的竞争性和系列BMT方案−CD48型−CD150型+林−Sca1类+c试剂盒+). (d日)主要受者（供体细胞的受者来自：年轻、，n个= 11; 车辆处理老化，n个= 15; ABT263-处理过的老化，n个= 13; 来自两个独立的BMT实验）。供体细胞在二级受体PB中的移植如图所示补充图10c. (e（电子）)通过流式细胞术分析和分离MuSCs的门控策略（顶部）和显示肌源性转录因子Pax7（MuSCs生物标记物）免疫染色的代表性显微照片（底部）。IF，免疫荧光；MCFC，肌源性克隆形成细胞。比例尺，20µm。(如果)肌肉组织中MuSCs的定量。(克)分类MuSC中初级（左）和次级（右）MCFC的量化。(h、 我)p16的量化+单元格(小时)和磷酸化p38+（第38页+) (我)MuSC中的细胞。(j个)MuSC中γ-H2AX病灶平均数量的量化。n个=Young、Aged+Veh和Aged+ABT各组分别为5、6和6只小鼠f、 h、i、j; 每组8、12和13只小鼠克自始至终，数据均为平均值±s.e.m.Ind日,#P（P）与幼年小鼠供体细胞受体相比<0.05，&P（P）与车用老龄小鼠供体细胞受体相比，<0.05；在里面g–j,#P（P）<0.05，与幼鼠相比，&P（P）<0.05，与车辆处理的老龄小鼠相比；未成对学生的t吨-测试。

总之，我们的结果表明，ABT263是一种有效的广谱衰老药物，具有缓解辐射损伤的潜在活性，尤其是与SC丰度增加相关的IR的晚期效应，如IR诱导的长期骨髓损伤。然而，ABT263有一些毒副作用35; 特别是，短暂性血小板减少和中性粒细胞减少是ABT263治疗患者常见的毒性反应。药物不良反应是抗衰老疗法的障碍，需要长时间的治疗间隔5,36因此，ABT263治疗是否可用于延缓正常年龄实验动物或人类的衰老或与年龄相关的疾病，尚待确定。

在线方法

细胞

人WI-38（WI-38，目录号CCL-75）和IMR-90成纤维细胞（IMR-90，目录号CCL-186）以及人肾上皮细胞（RECs，目录号PCS-400-012）最初从美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA，USA）获得。如前所述，从小鼠胚胎中分离出小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）37将所有细胞培养在37°C和5%CO的加湿培养箱中的完整细胞培养基（CM）中（Dulbecco’s Modified Eagle medium补充10%FBS、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素（均来自美国佐治亚州诺克罗斯市亚特兰大生物制品公司））2为了避免细胞发生复制性衰老，低流量WI-38（<25代）、IMR-90（<25届）、RECs（<25次）和MEFs（<3届）细胞被用作正常对照或诱导衰老。为了诱导复制性衰老，在大约38代或60倍群体倍增后，WI-38细胞定期进行继代培养，直到它们停止分裂并衰老(补充图1a)38为了通过电离辐射（IR）诱导细胞衰老，在J.L.Shepherd模型Mark I中，约70%汇合处的细胞暴露于10 Gy的IR137铯γ辐照器（J.L.Shepherd，Glendale，CA，USA），剂量率为1.080 Gy/min。照射后第三天，细胞以1:3稀释度传代一次，照射后第7天细胞完全衰老，如图所示补充图1a（参考。38). 通过异位表达Ras公司，WI-38细胞感染含有pBabe-H的逆转录病毒-Ras公司或pBabe-puro控制载体（Addgene，Cambridge，MA，USA）10,38.病毒感染后两天，通过用嘌呤霉素（2µg/ml）（Invitrogen，Grand Island，NY，USA）孵育5 d来选择转染细胞；Ras公司-转染细胞而非对照载体-转染细胞随后衰老(补充图1a). 在将其用于实验之前，每隔3天更换一次培养基，将SCs培养几天（但<7天）。

细胞活力测定

将细胞接种到24或48周板的孔中。隔夜培养后，用载体（0.1%DMSO或PBS）或化合物（列于补充表1和2)浓度不断增加，持续不同的时间。细胞用0.25%胰蛋白酶和1 mM EDTA消化，并在含有2%FBS的PBS中收获。在室温下与PBS中的碘化丙啶（PI，100 ng/ml）孵育1分钟后，细胞在1200转/分离心6分钟以去除PI，然后再悬浮在含有2%FBS的PBS中，以使用BD LSR II流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）进行分析。活细胞（PI−细胞）以恒定流速通过流式细胞仪进行分析，并使用以下公式计算用载体处理的对照细胞的百分比：对照百分比=(N个药物/N个c（c）)×100，其中N个药物和N个c（c）表示PI的绝对数−药物处理细胞和载体处理细胞的活细胞。

EC的计算50值

生成了每种受试化合物的剂量-反应曲线和半最大抑制浓度（EC50值）通过Probit分析计算39.

SA–β-半乳糖苷酶染色、BrdU掺入试验和凋亡试验

根据制造商的说明，使用SA–β-gal染色试剂盒（目录号9860；Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）进行SA–β-gal染色。在光学显微镜下，SCs被鉴定为蓝色染色细胞。在载玻片上的20个随机场中对总共1000个细胞进行计数，以确定SA–β-gal的百分比+细胞38使用ImaGene Green C通过流式细胞术进行流式SA–β-gal染色分析12根据制造商的说明和之前报告的协议，来自Molecular Probes（加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命技术公司）的FDG lacZ基因表达试剂盒40.

如前所述，使用BrdU掺入试验测定细胞衰老41如前所述，通过流式细胞术测定细胞凋亡4.

显微镜

使用配备100W汞光源的Axioplan研究显微镜（德国耶拿卡尔蔡司公司）观察和拍摄细胞。使用Dage CCD100集成相机（美国密歇根州Dage-MTI）和Flashpoint 128捕获板（美国印第安纳州印第安纳波利斯Integral Technologies）拍摄图像。使用Image Pro Plus软件（美国马里兰州Rockville的Media Cybernetics）处理捕获的图像，并使用Adobe Photoshop V6.0进行显示。

蛋白质印迹分析

电池（1×106)在100µl裂解缓冲液中进行裂解（20 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，10%甘油，1%NP-40，0.1 M NaF，1mM DTT，1mM PMSF，1 M M钒酸钠和2µg/ml亮氨酸蛋白酶和抑肽酶）。在12%的SDS-PAGE凝胶上溶解来自每个细胞提取物的等量蛋白质（25-50µg/条）。蛋白质通过电泳印迹到NOVEX NC膜（生命技术）。用依托泊苷处理的Jurkat细胞（由作者制备）和细胞色素c处理的Jurgat细胞（取自美国马萨诸塞州丹弗斯市cell Signaling）的细胞裂解液混合物作为阳性对照，以检测图2d，e用TBS-T封闭缓冲液（5%脱脂牛奶，25 mM Tris-HCl，pH 7.4，3 mM KCl，140 mM NaCl和0.05%吐温）封闭膜，然后在4°C下过夜或在室温下用预定最佳浓度的一级抗体探测1 h。用TBS-T进行大量清洗后，在室温下用适当的过氧化物酶结合二级抗体（Jackson Immuno-Research Europe，Suffolk，UK）培养膜1小时。用TBS-T进行三次洗涤后，使用ECL Western Blotting检测试剂（目录号WBKLS0100，EMD Millipore，Newmarket，Suffolk，UK）检测感兴趣的蛋白质，并通过X射线胶片（Pierce Biotech，Rockford，IL，USA）曝光印迹进行记录。western blot分析中使用的所有抗体信息列于补充表3.

击倒BCL2级和/或BCL2L1型带有短发夹RNA（shRNAs）

控制慢病毒pLKO.1载体和含有人类特异shRNAs的pLKO-1载体BCL2级（RHS4533–EG596）和BCL2L1型（RHS4533–EG598）从赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）获得。如上所述产生病毒颗粒。建立稳定BCL2级-和/或BCL2L1型-击倒WI-38细胞系，在离心（900克)用嘌呤霉素（2 mg/ml）在32℃下培养30分钟。BCL2级和/或BCL2L1型在将细胞用于实验之前，通过westernblot确认敲除。

老鼠

年轻（约2个月大）雄性C57BL/6J（CD45.2）小鼠和B6.SJL–Ptprc公司一百事可乐b条/BoyJ（CD45.1）（作为BMT受体的C57BL/6同源小鼠株；Ptprc公司，蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型；百事可乐，肽酶C）小鼠购自Jackson实验室（美国马萨诸塞州巴尔港）。p16-3MR转基因小鼠是在阿肯色大学医学科学（UAMS）国际实验动物护理协会（AAALAC）认证的动物设施中培育的，如前所述11小鼠被随机分配到每个笼子4或5只小鼠，被安置在UAMS AAALAC认证的动物设施中，并接受食物和水随意.老龄雄性C57BL/6J小鼠（约20个月大）取自国家老龄研究所的老龄啮齿动物群落(https://www.nia.nih.gov/research/sciencefic-resources#啮齿动物). 这些小鼠被安置在北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC）屏障设施内，以标准饮食喂养，并与一组年轻雄性C57BL/6小鼠作为对照。用于所有实验的小鼠被随机分配到一个治疗组。对于动物研究，样本大小是根据我们以前的经验估计的。患有肿瘤和/或白血病的小鼠被排除在实验和分析之外。所有动物工作都是按照UAMS和UNC机构动物护理和使用委员会的要求批准和完成的。

全身照射（TBI）和ABT263和更昔洛韦（GCV）治疗

将2–3个月龄的雄性C57BL/6J和p16-3MR转基因小鼠作为对照，或在J.L.Shepherd模型Mark I中暴露亚致死剂量（6 Gy）的TBI137铯γ射线辐射器（J.L.Shepherd）在TBI后8周或16周以1.080 Gy/min的剂量率对小鼠进行治疗（PBS或乙醇：聚乙二醇400:Phosal 50 PG（含至少50%PC和丙二醇的标准化磷脂（PC）浓缩物，德国科隆磷脂Gmbh），10:30:60），ABT263（乙醇：聚乙二醇400：磷50 PG）或GCV（PBS）。ABT263以50 mg/kg体重/天（mg/kg/d）的剂量灌胃给小鼠，每周期7天，共两个周期，周期间隔为2周。通过腹腔（i.p.）注射25 mg/kg/d GCV给小鼠，每周期5 d，连续两个周期，周期间隔为2周。在最后一次使用载体ABT263或GCV治疗1天后，对p16-MR小鼠进行荧光成像，如下所述。成像后第二天，小鼠被一氧化碳杀死2窒息后颈椎脱位。采集各种组织用于立即组织发光成像，如下所述，或用于RNA提取以分析SASP。在载体、ABT263或GCV治疗后5周处死幼年C57BL/6和p16-3MR转基因小鼠组，以获取骨髓细胞（BMC），进行以下各种检测。此外，用载体或ABT263处理年轻（2至3个月大）和老年（21至22个月大的）雄性C57BL/6和p16-3MR转基因小鼠组，并如上所述进行分析。

生物发光分析

用于测量体内发光时，小鼠腹腔注射250µl氙灯RediJect Coelenterazine h（100µg/ml，PerkinElmer，Waltham，MA，USA）。注射5分钟后，用4%异氟烷气体以1升/分钟的氧气流量麻醉小鼠。使用Xenogen IVIS-200 Optical获取发光图像体内成像系统配备活图像4.3.1版软件（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA）。所有图像扫描均在注射后15–20分钟在E视野下进行；将小鼠置于1.5%异氟醚气体中，氧气流量为1升/分钟。

为了进行组织发光成像，将从安乐死小鼠身上采集的组织立即浸泡在预热（37°C）的PBS中，PBS中含有2%的FBS和1:10稀释的氙灯再切割-柯来特嗪h溶液中10分钟。然后将组织转移到一个新的35毫米培养皿中，并使用氙气IVIS-200光学成像仪获取发光图像体内将组织浸泡在基质溶液中12–15分钟后的成像系统。

分离骨髓单个核细胞（BM-MNCs）、血统阴性造血细胞（Lin−细胞）、HSC和LT-HSC

采集骨髓细胞、骨髓单个核细胞（BM-MNCs）和血统阴性造血细胞（Lin−)分离细胞，并将HSC（CD150+CD48型−林−Sca1类+c试剂盒+，也称为CD150+CD48型−LSK，细胞）和LT-HSC（CD34−CD48型−CD155型+LSK细胞）通过Aria II细胞分选机（BD Biosciences）进行分选，如前所述4。细胞分离和分类中使用的所有抗体的信息列于补充表4.

B细胞分析

BM-MNC（1×106)在4°C下与FITC-标记的抗CD93、APC-标记的抗IgM和PE标记的抗B220孵育30分钟，然后用含有0.25µg/ml PI的PBS洗涤。使用BD-LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）分析各种B细胞群。

HSC液体培养中的集落形成细胞检测

按照前面所述进行分析4简单地说，单个HSC被直接分拣到96个底板的圆形井中。它们在补充有10%FCS、50ng/ml mSCF、mFlt-3、mTPO和mGM-CSF、20ng/ml小鼠白细胞介素（IL）3和5U/ml mEPO的RPMI 1640培养基中培养(补充表2)在不存在或存在1.25µM ABT263的情况下。每隔3天添加一次新制备的培养基。培养14天后，计算每个HSC产生的细胞数。产生10000个以上细胞的细胞被评为集落形成细胞。

鹅卵石区域形成细胞（CAFC）分析

BMC的CAFC分析如前所述4,42在单HSC CAFC分析中，将用载体或ABT263处理的年轻和老年C57BL/6小鼠的单个LT-HSC直接分选到含有FBMD-1基质细胞的96个圆底板孔中。如前所述，在培养5-8周后，通过明亮视野显微镜对CAFC进行评分24.

竞争性再生试验（CRA）和连续骨髓移植（BMT）

CD45.2小鼠暴露于亚致死剂量（6.0 Gy）的TBI或假辐射，然后用载体或ABT263治疗，如图3a，g.分离BMC并与2×10混合5竞争性BMC来自三只CD45.1小鼠。然后通过静脉窦逆行注射，将细胞混合物移植到致命照射（9.5Gy TBI）的CD45.1受体中。在正常衰老研究中，用载体或ABT263处理来自年轻和老年C57BL/6小鼠的50个新鲜分选的LT-HSC与3×10混合5竞争性骨髓细胞来自三只CD45.1小鼠，然后通过静脉窦逆行注射将细胞混合物移植到致命照射的CD45.1受体。如前所述，在移植后的不同时间对受体的供体细胞植入进行分析4,42.对于二次BMT，1×106在初次BMT后4个月，从每个主要受者身上获取BMC，然后将其移植到如上所述的致命照射受者体内。如前所述，对初级和次级受体外周血中的供体细胞移植进行分析4,42.

细胞周期和DNA损伤分析

林−用针对各种HSC细胞表面标记物的抗体对细胞进行染色，然后用固定-渗透溶液（加利福尼亚州圣地亚哥BD-Pharmingen）固定并渗透。随后，用抗Ki67-FITC、抗磷酸组蛋白H2AX（γ-H2AX）（Ser139）、Alexa Fluor 647和7-氨基放线菌素D（7-AAD）对细胞进行染色，然后如前所述通过流式细胞术进行分析4.

骨基质细胞的分离

从被安乐死的小鼠身上采集股骨、胫骨和骨盆骨，通过清除周围组织和清除骨髓细胞进行清洁。使用剪刀将骨头切成小块（<1mm长），然后用0.1%胶原酶I和15µg/ml脱氧核糖核酸酶I（Sigma，St.Louis，MO，USA）在含有15%FBS的PBS中在37°C下消化1小时。在去除骨碎片并通过40µm过滤器过滤后收集细胞。CD45型−林−圆周率−经APC-结合抗CD45、生物素结合抗CD11b、CD3ε、Gr-1、B220和Ter119、FITC-结合链霉亲和素和PI染色后，通过细胞分选获得骨基质细胞。

肌肉干细胞的分离

用镊子将安乐死后从小鼠后腿上切下的骨骼肌撕成小块，然后在37°C下用0.2%II型胶原酶在含有10%马血清的F10培养基（Thermo Fisher Scientific）中消化90分钟。用PBS洗涤三次后，用0.1%II型胶原酶和0.05%dispase（Thermo Fisher Scientific）在PBS中在37°C下进一步消化单个肌纤维30分钟，以从肌纤维中分离出肌纤维相关细胞（含有MuSC）。通过70µm细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific）过滤肌纤维相关细胞，通过离心（500克，8分钟），并用CD45、Mac1、Sca1、CXCR4和β1-整合素抗体染色，以进行细胞分类和分析，如前所述43,44中提供了用于染色的所有抗体的信息补充表4.

肌源性巨噬细胞集落形成细胞检测

如前所述，通过Aria II细胞分选仪（BD Biosciences）将单个MuSC以每孔1个细胞的速度沉积到胶原蛋白和层粘连蛋白重涂96 well板（Corning Inc.，NY，USA）的微孔中43,44将细胞培养在补充有20%马血清和5µg/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；Thermo Fisher Scientific）的F10培养基中，并每天喂食新鲜制备的bFGF。培养6d后，通过明亮视野显微镜对含有肌源性集落的微孔进行评分，以确定原代肌源性克隆形成细胞（MCFC）的数量43,44从含有肌源性集落的单个孔中采集细胞，用添加20%马血清和5µg/ml bFGF的F10培养基以1:5的比例稀释，然后重新接种到胶原和层粘连蛋白涂层的五个孔96-well板中，以与初级MCFC类似的方式定量次级MCFC。

p38磷酸流分析法分析衰老MuSC

使用针对各种MuSC表面标记物的抗体对肌纤维相关细胞进行染色，并使用固定-渗透溶液（BD-Pharmingen）进行固定和渗透，如图4e随后，用抗p-p38（#4551；Cell Signaling，Danvers，MA，USA）对细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析。

免疫染色法分析MuSCs中Pax7、p16和g-H2AX的表达

大约2000个新分选的MuSC在玻片上旋转，以通过胞浆进行免疫染色。在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定15分钟后，细胞在室温下0.1%Triton X-100中培养半小时。在用PBS洗涤并用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育60分钟后，将细胞与p16、γ-H2AX或Pax7抗体在4°C下孵育过夜(补充表4)然后与相应的二级抗体孵育，每一步之间进行大量清洗。用DAPI（Sigma，St.Louis，MO，USA）对细胞的核DNA进行复染。如上所述，使用Axioplan研究显微镜观察和拍摄细胞。在玻片上的30多个随机字段中，每个玻片总共统计100多个细胞，以确定p16的百分比+细胞和γ-H2AX焦点的数量，用于计算γ-H2AX-焦点/细胞的平均数量。

定量PCR（qPCR）

提取细胞总RNA，并按照前面所述进行逆转录4.测量CDKN2A型和Cdkn2a公司分别在WI-38细胞和小鼠组织中表达mRNA，用TaqMan qPCR试剂和引物进行qPCR(补充表5)来自Applied Biosystems。人类GAPDH公司和鼠标Hprt（小时）被用作内部控制。简单地说，将1µl cDNA与10µl TaqMan Universal Mastermix（Invitrogen）和1µl TaqMan-引物混合。将样品添加到8µl水中（总体积为20µl），并用于qPCR（50°C 2 min，95°C 10 min，40×（95°C 15 s，60°C 1 min））。所有反应均在ABI StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行三次。

测量CDKN1A公司和GAPDH公司WI-38细胞和Cdkn1a型和SASP基因表达（包括Il1a、Il1b、Il6、Tgfb1、Tnfa、Ccl5和Cxcl10型mRNA）在小鼠组织、骨髓HSC和骨髓基质细胞中，使用SYBR检测试剂盒（应用生物系统）。简单地说，将1µl cDNA与7.5µl SYBR Green PCR Master Mix和0.2µl引物混合(补充表5). 然后将样品添加到6.30µl水中（总体积为15µl）。qPCR条件为：95℃10 min，40×（95℃15 s，60℃1 min），95℃15 min，60℃60 min，95℃15min。所有反应在ABI StepOnePlus实时PCR系统上进行三次。

统计分析

数据显示为正态方差。没有使用统计方法预先确定样本量。除了体内如上所述对小鼠进行的动物研究。在实验和结果评估过程中，研究人员并没有对分配视而不见。使用GraphPad软件（加利福尼亚州圣地亚哥）的GraphPad-Prism通过方差分析（ANOVA）对数据进行分析。如果方差分析证明组平均数之间的事后比较是合理的，则使用Neuman-Keuls或Tukey的多重比较测试进行。P（P）<0.05被认为是显著的。

补充材料

补充信息

单击此处查看。（210万，pdf）

致谢

我们感谢G.van Zant（肯塔基大学）提供的FBMD-1基质细胞。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助R01 CA122023（D.Z.）、R01 AI080421（D.Z.:）、P20 GM109005（M.H.-J.和D.Z:）和R37 AG009909（J.Campisi）；爱德华·P·埃文斯基金会（D.Z.和M.H.-J.）的拨款；国家自然科学基金项目81129020（D.Z.）；国家重点基础研究项目2011CB964800-G（A.M.）；以及阿肯色州科学技术局（D.Z.）颁发的阿肯色研究联盟奖学金。

脚注

注：任何补充信息和源数据文件都可以在论文的在线版本.

作者贡献

J.Chang和Y.W.设计、执行和分析了大多数实验；L.S.、R.-M.L.和M.D.设计、执行和分析了一些实验；W.F.、Y.L.、X.W.、N.A.-B.、K.K.和K.J.进行了实验；N.E.S.解释数据并修改手稿；J.Campisi提供小鼠，设计研究，分析和解释数据，并修改手稿；U.P.和M.H.-J.解释了数据并修改了手稿；S.D.和A.M.设计了研究，分析和解释了数据，并修订了手稿；D.Z.构思、设计和监督研究，分析和解释数据，并撰写手稿。所有作者都对结果进行了讨论，并对手稿进行了评论。

竞争性金融利益

作者声明了相互竞争的财务利益：详情可参见论文的在线版本.

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