美国生理学杂志《细胞生理学》。2012年10月15日；303（8）：C843–C853。
柯萨奇病毒和腺病毒受体对血睾屏障的调节
纽约人口委员会生物医学研究中心
通讯作者。2012年6月28日收到；2012年8月7日验收。
摘要
血睾屏障（BTB）将生精上皮分为基底隔室和管腔隔室。它限制支持细胞之间分子的细胞旁扩散，赋予细胞极性，并在精子细胞发育的腔室内创造独特的微环境。然而，它在上皮周期中发生重组，因此，与基底室中的B型精原细胞分化的前精蛋白精母细胞可以在周期的第八阶段穿过BTB，同时保持免疫屏障。其中，柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）是睾丸、多上皮和内皮细胞中的紧密连接（TJ）整体膜蛋白，除作为结构粘附蛋白外，还作为BTB的调节蛋白发挥作用。RNAi介导的CAR在支持细胞上皮中的敲除，该支持细胞上皮具有已建立的模拟体内BTB的TJ通透性屏障，导致TJ屏障的破坏和TJ蛋白封闭蛋白的内吞作用增加。此外，闭塞素内吞作用的增强伴随着闭塞素中Thr-磷酸化的下调，以及内吞闭塞素与早期内体抗原-1的相关性增加。这些发现通过在支持细胞中过度表达CAR得到证实，发现CAR可以“拉紧”支持细胞TJ屏障，促进BTB功能。这些发现支持了一个新的概念，即CAR不仅是一种结构蛋白，它还可能通过与非受体蛋白激酶的结构相互作用介导BTB处其他粘附蛋白（如闭塞素）的磷酸化状态，从而调节内吞小泡介导的蛋白运输。
关键词：睾丸、精子发生、生精上皮周期、CAR、支持细胞、血睾丸屏障、紧密连接、胞浆特化
柯萨奇病毒与腺病毒受体（CAR）是一种46-kDa的完整膜蛋白，1997年首次被报道为柯萨奇病毒B组和腺病毒2、5组的常见受体(2). CAR允许病毒附着并进入细胞(三). 后续研究(10–12,61)研究表明，CAR主要存在于脑、心脏、肌肉和睾丸等多个组织和器官的紧密连接处（TJ）。有趣的是，它在支持细胞和代谢静止的生殖细胞（包括高分化单倍体精子细胞）中高度表达(36,37,62)除支持细胞TJ屏障外，它也是顶端胞质特化的组成部分[apical ES，一种睾丸特异性非典型粘附连接（AJ）](62). 由于细胞表面CAR的存在是腺病毒和柯萨奇病毒进入的关键决定因素(三)，CAR已被广泛研究并作为基因治疗的靶点(47,50). 最近的研究(10,18,45)已经表明，CAR是多细胞上皮中通过相邻上皮细胞之间的同型相互作用在TJ处的一种结构粘附蛋白。CAR还具有PSD-95/Dlg1/闭塞小带1（ZO-1）结合（PDZ-binding）基序以促进蛋白质之间的相互作用，因此，CAR已被证明与衔接蛋白ZO-1和β-catenin相互作用(10,60)和缝隙连接蛋白连接蛋白45（Cx45）(31)，形成蛋白质复合物。在睾丸中，在检测的十几种BTB相关结构和调节蛋白中，CAR也被发现与JAM-C相互作用(36)β-catenin、vinculin和最重要的非受体蛋白酪氨酸激酶c-Src的研究(62)使用共免疫沉淀（Co-IP），表明CAR可能具有其他功能和/或调节作用。事实上，CAR在房室结传导和心功能方面很重要，正如研究所证明的那样(31)使用心脏特异性CAR基因敲除（CAR-KO）小鼠，因为CAR被证明参与心脏夹层间盘Cx45、ZO-1和β-catenin的定位，而Cx45被认为参与房室结传导。在成年小鼠中，其组织/器官特异性敲除也导致肠道扩张和外分泌胰腺萎缩，说明其失活导致多种表型改变(42). CAR也可能起到抑癌作用(54). 总之，这些最新发现说明了CAR除了作为病毒进入的受体和TJ和/或AJ的结构粘附蛋白外，在多种细胞功能中的关键作用，可能通过其结合伙伴如c-Src介导。
自从发现CAR是睾丸支持细胞和生殖细胞中的一种假定的完整膜蛋白以来(36,62)据推测，CAR可能作为调节分子，在上皮细胞周期的第VIII阶段允许精母细胞在BTB转运(37,61); 然而，这一事件的分子机制尚不清楚。在此，我们报告了使用RNAi基因沉默和短暂过度表达技术的研究结果，即CAR通过参与调节BTB整体膜蛋白（如闭塞素）的磷酸化状态，在支持细胞BTB中发挥调节作用，进而，调节该部位内吞囊泡介导的蛋白运输事件，从而影响支持细胞-细胞界面的细胞粘附状态。简而言之，CAR似乎参与了一种动态有效的调节机制，以便生殖细胞可以在BTB转运，而免疫屏障功能在精子发生的上皮周期中保持完整。
材料和方法
动物和抗体。
雄性Sprague-Dawley大鼠，均为成年（约250–300 g体重）和20天龄幼鼠，购自查尔斯·里弗实验室（纽约州金斯顿）。洛克菲勒大学实验动物护理和使用委员会通过了第09–016号和第12–506号议定书批准使用动物进行本文报告的研究。除抗桥粒芯蛋白-2抗体外，其他抗体都是商业化获得的，如前所述，该抗体是在我们的实验室制备的(28) ().
表1。
| | | | | 工作稀释度
|
|---|
| 抗体 | 目录编号。 | 批号。 | 主机 | V供应商 | 国际银行 | 国际单项体育联合会 | IP（IP） |
|---|
| 汽车 | sc-15405号文件 | B2808型 | 兔子 | 圣克鲁斯生物技术 | 1:200 | 1:50 | |
| 闭塞素 | 71-1500 | 00250207 | 兔子 | Zymed/Invitrogen公司 | 1:400 | 1:50 | 1:40 |
| JAM-A（堵塞-A） | 36-1700 | 370923A个 | 兔子 | Zymed/Invitrogen公司 | 1:250 | | |
| 克劳丁-11 | 36-4500 | 387613安 | 兔子 | Zymed/Invitrogen公司 | 1分125秒 | | |
| ZO-1号机组 | 61-7300 | 389452安 | 兔子 | Zymed/Invitrogen公司 | 1:250 | 1:50 | |
| N-卡德林 | 供应链-7939 | H0907号 | 兔子 | 圣克鲁斯生物技术 | 1:200 | | |
| α-环连蛋白 | 供应链-7894 | G3003型 | 兔子 | 圣克鲁斯生物技术 | 1:100 | | |
| β-连环蛋白 | 71-2700 | 60806848C2号 | 兔子 | Zymed/Invitrogen公司 | 1:250 | | |
| 桥粒糖蛋白-2* | — | — | 兔子 | 程实验室 | | | |
| 地莫考林-2 | 标准编号-66863 | A0108型 | 兔子 | 圣克鲁斯生物技术 | 1:200 | | |
| γ-连环蛋白 | 610254 | 0000074819 | 鼠标 | BD转导实验室 | 1:1000 | 1:50 | |
| 欧洲经济区-1 | 610457 | 87095 | 鼠标 | BD转导实验室 | 1:2000 | 1:100 | 1:40 |
| 磷酸-丝氨酸 | 61-8100 | 40487618 | 兔子 | Zymed/Invitrogen公司 | 1:500 | | |
| 磷-苏氨酸 | 71-8200 | 681682安 | 兔子 | Zymed/Invitrogen公司 | 1:500 | | |
| 磷酸-Tyr | 61-5800 | 11067406 | 兔子 | Zymed/Invitrogen公司 | 1:500 | | |
| 肌动蛋白 | sc-1616标准 | 2007年2月 | 山羊 | 圣克鲁斯生物技术 | 1:200 | | |
原始支持细胞培养。
如上所述，从20日龄大鼠睾丸中分离出支持细胞(39). 支持细胞在无血清的F-12/DMEM中培养，补充碳酸氢钠、庆大霉素、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白和杆菌肽，培养温度为35°C，CO浓度为5%2-加湿CO中95%的空气（vol/vol）2培养箱如上所述(39). 睾丸细胞（如Sertoli细胞）的孵化温度为35°C，因为在啮齿类动物和人类中，睾丸位于腹腔外，封闭在阴囊中，以保持35°C的温度，低于37°C的体温，这是维持精子发生和生育所必需的(21,49,55). 值得注意的是，这些支持细胞已完全分化并停止分裂(41). 此外，从20日龄大鼠分离的支持细胞在形态和功能上与从90日龄大白鼠睾丸分离的细胞没有区别(26,33). 然而，从成年大鼠睾丸分离出的支持细胞纯度为～85%，而从20天龄大鼠睾丸中分离到的支持细胞的纯度大于98%，这是因为后者缺乏圆形/伸长/拉长的精子细胞，这些精子细胞紧密嵌入支持细胞中，并且很难去除，包括使用低渗处理(26,33). 根据实验类型，Sertoli细胞在不同应用中以不同的细胞密度进行电镀。首先，在0.45–0.5×10的条件下对细胞进行电镀6细胞/厘米2在Matrigel-coated 12孔培养皿上【Matrigel在无血清F-12/DMEM（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）中稀释1:7】，每个孔含有3-ml F-12/DEM，在指定的时间点采集培养物，以在细胞裂解液中获得足够的蛋白质，用于免疫印迹或用于RT-PCR或定量PCR的核酸提取。其次，在0.04×10的条件下对Sertoli细胞进行培养6细胞/厘米2在Matrigel-coated盖玻片上进行免疫荧光分析，以评估蛋白分布和/或定位的变化，每个盖玻片放在6孔培养皿中，每个孔含有5毫升F-12/DMEM。因此，支持细胞间隔均匀，并且可以容易地检测治疗组与对照组中支持细胞-细胞界面处蛋白质定位/分布的变化。第三，支持细胞以1.2×10接种6细胞/厘米2在Matrigel-coated双室单元上（Millicell细胞培养插入物，直径12-mm，孔径0.45-μm，有效表面积，～0.6cm2; Millipore，Bedford，MA）和单位被放置在24孔培养皿中，每个培养皿的顶部和底部室中都有0.5毫升的F-12/DMEM。电镀后约48小时，对细胞进行短暂的低渗处理（20 mM Tris，pH 7.4，22°，2.5分钟），以溶解残留的生殖细胞，如前所述(14)，培养物用F-12/DMEM冲洗两次，以清除生殖细胞碎片，然后用含有必要补充物的新鲜F-12/DEM替换(39). 因此，我们研究中使用的支持细胞培养物的纯度大于98%，而生殖细胞、Leydig细胞和/或肾小管周围肌样细胞的污染可以忽略不计，当使用上述特定引物对RT-PCR评估这些细胞的标记时(25). 值得注意的是，生殖细胞，即精原细胞和精母细胞（注：20日龄大鼠睾丸中不存在圆形/伸长/伸长精子细胞；参考文献。9)对这种短暂的低张治疗敏感，但对支持细胞不敏感。与未接受低渗处理的Sertoli细胞培养相比，在冲洗并恢复正常培养条件后约12–24小时评估经上皮电阻（TER）时，发现该处理不会阻碍TJ通透性屏障功能。还需要注意的是，使用这种体外模型，支持细胞组装了一个功能性的TJ通透性屏障，在电子显微镜检查时发现TJ、基底ES、缝隙连接（GJ）和桥粒的超微结构，与前面描述的体内BTB相似(27,28,53). 事实上，该系统已被研究人员用于研究支持细胞BTB动力学的生物学和调节(4,5,15,19,20,22,40,46).
利用CAR特异性小干扰RNA双工体通过RNAi在Sertoli细胞中敲除CAR。
从20日龄大鼠睾丸获得的支持细胞单独培养3天，以建立功能性TJ通透性屏障，其表现为细胞上皮上存在稳定的TER。此后，根据制造商的说明，使用核糖果汁siRNA转染试剂（Novagen，EMD Biosciences）将100 nM非靶向或CAR特异性小干扰（si）RNA双工体转染细胞24小时。为了沉默CAR，使用了100 nM CAR（5′-CCUGACAGAGGAUCGAAAtt，s137152；5′-GAAUGACUUCACCGUUAtt，s137.153；5’-CGAGUACACUUACGUAtt，s137154；Ambion）siRNA双工与100 nM非靶向控制双工（Ambin）的混合物。转染后，去除反应混合物，清洗，并用新鲜F-12/DMEM替换，细胞在终止前再培养48小时。对于双标记免疫荧光分析，使用2 nM siGLO红色转染指示剂（Dharmacon/Termo Fisher Scientific）与siRNA双链体共转染，以确认转染成功。
支持细胞CAR过度表达。
如前所述，通过PCR获得编码CAR的全长cDNA(64,65)使用从Sertoli细胞总RNA中提取的cDNA，通过作为模板的逆转录步骤和指定为ex-CAR的CAR特异性引物对(和). 将全长CAR cDNA克隆到pCI新哺乳动物表达载体（Promega）中Xho公司我和不是I使用CAR的特定引物（参见). pCI-neo哺乳动物表达载体携带人巨细胞病毒即时早期增强子/启动子区域，该区域促进CAR插入物在Sertoli细胞中的组成性表达。通过直接核苷酸测序（Genewiz）证实了这些克隆的真实性。打开第3天分离后，将支持细胞以0.5×10的细胞密度放置在Matrigel涂层的12孔培养皿或双室培养基上6或1.2×106细胞/厘米2分别使用效应基因转染试剂（Qiagen）以1μg DNA与15μl转染试剂的比率，每孔或插入物转染1或0.5μg质粒DNA。24小时后取出转染混合物，并用新鲜F-12/DMEM替换。如前所述，在2天后（即转染开始后3天）从这些支持细胞培养物中提取RNA和蛋白裂解物(58). CAR与pCIneo载体瞬时表达后的Sertoli细胞TJ屏障功能也通过TER测量进行评估。为了评估哺乳动物表达载体pCI-neo在Sertoli细胞中的转染效率，将荧光素酶报告质粒（pGL3-Control和pRL-TK，Promega）与质粒DNA以～0.1–3μg的浓度和不同的细胞密度以0.5或1.2×106细胞/厘米2如前所述，通过检测荧光素酶报告基因活性持续24小时(64). 使用这种方法，转染效率估计为～15–20%。
表2。
用于克隆大鼠支持细胞CAR全长cDNA的引物序列及其插入pCI-neo哺乳动物表达载体*
Sertoli细胞TJ-通透性屏障的功能评估。
Sertoli细胞TJ-通透性屏障通过细胞上皮限制电流流动的能力进行量化（即量化为电导率，单位为ohm，Ω）如前所述，当Millipore Millicell ERS的两个电极被放置在两院制单位的相应顶端和基底室中时(16). 简言之，在F-12/DMEM中培养的支持细胞以1.2×10的比例接种在Matrigel-coated双室单位（一式三份）上6细胞/厘米2在时间0每天记录TER，并在TER测量后补充新鲜F-12/DMEM。打开第3天当TJ通透性屏障建立时，如支持细胞上皮上稳定的TER所示，使用siRNA双工物沉默CAR或使用pCI-neo/CAR过度表达CAR与相应对照进行转染，以评估CAR敲除或其过度表达对Sertoli细胞TJ-通透性屏障功能的影响。
细胞内吞试验。
基本上如前所述进行了细胞内吞试验(63,67)并在之前的报告中详细说明(24). 总之，Sertoli细胞在0.5×106细胞/厘米2在Matrigel-coated 6孔板上放置3天。此后，用CAR特异性siRNA双链体和非靶向对照siRNA双联体转染细胞24小时。转染后第三天，当CAR被敲除约70%时，细胞表面蛋白用0.5 mg/ml的磺化NHS-SS-生物素进行生物素化（皮尔斯，罗克福德，IL；注：在PBS/CM缓冲液（PBS含有0.9 mM CaCl2和0.33 mM氯化镁2)在4°C下保持30分钟（在此温度下，没有发生蛋白质内化）。然后用50 mM NH淬火游离生物素4Cl在PBS/CM缓冲液中于4°C下持续15分钟。为了启动内吞作用，将支持细胞培养物从4°C转移到CO2在含95%空气和5%CO的潮湿环境中培养箱2（vol/vol），在35°C下孵育指定时间点，以评估转染CAR特异性siRNA双链与非靶向控制性siRNA双链的Sertoli细胞中生物素化蛋白内化的动力学。终止时（即0、15、30、60和90分钟），在100 mM Tris·HCl、100 mM NaCl和2.5 mM CaCl中用50 mM 2-巯基乙磺酸钠（MESNA，一种将生物素从生物素化的Sertoli细胞表面蛋白中裂解的还原剂；Sigma-Aldrich）剥离未经修饰的细胞表面蛋白上的生物素2pH 8.6，在4°C下保持30分钟，并用5 mg/ml碘乙酰胺（Sigma-Aldrich）在PBS/CM缓冲液中于4°C淬火15分钟。然后，使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-Aldrich）的IP裂解缓冲液[10 mM Tris、0.15 M NaCl、1%NP-40和10%甘油（vol/vol），pH 7.4，在22°C下]获得细胞裂解液。用UltraLink固定化NeutraAvidin Plus珠（Pierce）从每个样品中提取内吞生物素化蛋白（注：每个样品含有约300μg的支持细胞裂解物蛋白）。然后清洗复合物，并在含有2-巯基乙醇的SDS样品缓冲液中提取蛋白质(6)在100°C下保持5分钟（从生物素Mr 244.31中分离与NeutraAvidin Plus珠结合的蛋白质），并使用抗闭塞素抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。同时处理实验组内的所有样品，以避免实验间的差异。本文报告的所有内吞实验均使用不同批次的Sertoli细胞重复至少三次，并且每个实验都产生了类似的结果。
双标记免疫荧光分析。
通过免疫荧光显微镜检查CAR敲除后靶蛋白在Sertoli细胞中的分布和/或定位及其相应的对照。总之，Sertoli细胞以0.04×10的密度进行分离和培养6细胞/厘米2在Metrigel-coated盖玻片上，放置在6孔培养皿中，每个孔含有5毫升F-12-DMEM。打开第3天用100 nM非靶向或CAR特异性siRNA双工体转染细胞，以Ribojuice siRNA转染试剂（Novagen）作为转染介质，转染24 h。然后，去除转染混合物，再培养细胞48 h。将Sertoli细胞固定在PBS（10 mM NaH）中4%多聚甲醛中2警察4pH 7.4，22°C，含0.15 M NaCl；vol/vol）在室温（22°C）下保持10分钟。使用0.1%Triton X-100在PBS（vol/vol）中渗透对甲醛固定细胞。用10%的正常山羊血清在PBS（vol/vol）中阻断后，用目标抗体在PBS中以适当稀释度培养细胞（参见). 隔夜培养后，用与Cy3或FITC（Invitrogen；PBS中1:100稀释）结合的二级抗体培养细胞1小时。然后，用含有DAPI的ProLong防褪色试剂（Molecular Probes、Eugene、or）固定细胞，进行细胞核染色，使用Olympus BX61荧光显微镜获得荧光显微照片，使用Olympus MicroSuite FIVE（版本1224）软件包获得图像并以TIFF格式保存。随后合并双标记免疫荧光图像进行分析，以使用Adobe Creative Suite（3.0版）中的PhotoShop评估共定位。
RNA提取和RT-PCR。
根据制造商的说明，在使用TRIzol试剂（Invitrogen）转染siRNA双工体3天后，从Sertoli细胞中提取总RNA。如果每个RNA样本中有污染基因组DNA，则在使用莫罗尼小鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV RT）试剂（Invitrogen）将其逆转录成cDNA之前，先用RNase-freed DNase I（Invit罗gen）消化。如前所述进行PCR(56,58)使用对应靶基因的特异引物对(和). 对于RT-PCR，靶基因与核糖体S16共扩增()，它起到了样品处理和RNA装载相等的内部控制作用。
免疫印迹分析。
通过在添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-Aldrich）的IP裂解缓冲液（10 mM Tris、0.15 M NaCl、1%NP-40和10%甘油，pH 7.4，22°C）中处理细胞，获得Sertoli细胞培养物的裂解物，并在15000℃下进行超声处理和离心克在4°C下放置45分钟，以获得清澈的上清液。裂解液在使用前储存在−20°C。用SDS-PAGE对每个样品中的40微克支持细胞裂解蛋白进行解析，以进行免疫印迹分析，并用相应的一级抗体探测目标蛋白（参见). 以BSA为标准，使用Bio-Rad Dc（洗涤剂兼容）蛋白质检测试剂盒和Bio-Rad680型平板读取器，通过分光光度法进行蛋白质估算。
合作-IP。
Co-IP用于监测蛋白质相互作用的变化以及闭塞素磷酸化状态的变化。简言之，将2μg正常小鼠或兔IgG加入300μg Sertoli细胞蛋白裂解液中，孵育1h，然后用10μl蛋白A/g琼脂糖珠（Santa Cruz）沉淀1h，获得上清液（1000克，4°C下5分钟），用于随后的Co-IP。这一预清洗步骤对于从细胞裂解液中去除非特异性IgG相互作用蛋白非常重要。此后，将上清液与2μg正常小鼠或兔IgG孵育成阴性对照，或与抗早期内体抗原1（抗EEA-1）或抗闭塞素Co-IP在实验室微型实验室滚筒上在室温（～22±1°C）下孵育过夜，然后用20μl蛋白A/G琼脂糖珠培养以沉淀免疫复合物。此后，用IP裂解缓冲液洗涤珠子，并在SDS-PAGE样品缓冲液中提取免疫复合物(6)如前所述，在100°C下进行SDS-PAGE和免疫印迹分析(57).
统计分析。
使用GB-STAT统计分析软件（7.0版，Dynamic Microsystems）进行统计分析。每个实验至少重复三次，数据为平均值±SDt吨-测试或单因素方差分析结合双尾邓内特检验。
结果
RNAi对CAR的敲除通过改变TJ蛋白在Sertoli细胞BTB的定位和/或分布来干扰Sertoli电池的TJ通透性屏障功能。
显示了大鼠睾丸CAR的一级序列，该序列是通过PCR从Sertoli细胞RNA中克隆的cDNA()，并基于大鼠睾丸CAR一级序列制备了CAR特异性siRNA双链（参见材料和方法). 通过在体外转染Sertoli细胞，RNAi可将CAR表达降低约70%，该细胞具有一个已建立的功能性TJ-通透性屏障，该屏障使用CAR特异性siRNA双链与非靶向控制性siRNA双链在体内模拟Sertoli cell BTB(,A类,一和b条、和B类,一和b条). 研究发现，约70%的CAR基因敲除与ZO-1表达下调有关，但与其他检测到的TJ、基础ES和桥粒蛋白无关(B类,一和b条). CAR基因敲除也扰乱了Sertoli细胞的TJ-通透性屏障功能(). 接下来，我们通过双标记免疫荧光分析研究了这些培养物中Sertoli细胞-细胞界面蛋白定位和/或分布的任何变化(D类,a-f型). 与中显示的结果一致,A类和B类RNAi敲除CAR后，在Sertoli细胞-细胞界面上的CAR表达显著减少（参见D类,b条与。一). 这也导致了闭塞素（TJ整合膜蛋白）和ZO-1（TJ相关适配器蛋白）的定位和分布发生变化，这些蛋白重新分布，从支持细胞表面附近移动到细胞胞浆中(D类,d日和（f）与。D类,c（c）和e（电子）). 分布和/或定位的这种变化可能导致TJ屏障处细胞粘附的不稳定，扰乱支持细胞TJ通透性屏障，如图所示然而，这种变化也有可能导致TJ屏障的细胞旁转运的改变。RNAi敲低支持细胞CAR后对TJ屏障功能的破坏作用()以及细胞-细胞界面上的蛋白质分布/定位()这似乎不是非靶向效应的结果，因为被检测的几个BTB相关蛋白（包括闭塞素）的稳态水平保持不变，但ZO-1除外，ZO-1下调(,一和b条). 此外，两个干扰素刺激基因（ISG）的表达，如寡腺苷酸合成酶1（OAS1）和信号转导子和转录激活子1（STAT1），已知在RNAi载体转染细胞进行基因敲除时由于非靶向效应而上调(1,34,43)在本次半定量RT-PCR试验中，S16作为负荷控制，未受影响(,A类和B类). 简而言之，小的调节性RNA，如此处使用的siRNA，可以触发Sertoli细胞的细胞免疫反应，例如通过激活干扰素刺激的基因表达，从而导致非特异性细胞表型和副作用（例如，TJ-屏障破坏，改变蛋白分布/定位）称为离目标效应。由于两个ISG中的OAS1和STAT1在CAR敲除的Sertoli细胞与对照细胞中均未上调，因此这些发现(,A类和B类)结合免疫印迹数据显示从而支持我们的结论，即,C类和D类，是CAR击倒的结果。通过免疫荧光显微镜观察CAR沉默后，除闭塞素和ZO-1外，支持细胞-细胞界面上其他BTB相关蛋白的变化，如JAM-A和claudin-11；然而，没有有效的抗体。
体外研究评估RNAi敲除CAR对支持细胞紧密连接（TJ）通透性屏障功能的影响。支持细胞在Matrigel涂层培养皿上单独培养(A类和B类)，两院制单位(C类)或盖玻片(D类)持续3天，以组装功能性TJ通透性，如前所述，具有TJ、基础外质特化（ES）、缝隙连接（GJ）和桥粒（DS）的超微结构(27,28,53). 此后，用CAR特异性siRNA双链体与非靶向对照siRNA双链体转染细胞24小时，然后终止培养物进行RT-PCR/免疫印迹（IB；A类)，免疫印迹(B类)Sertoli TJ-渗透屏障评估(C类)和双标记免疫荧光分析（IF；D类).A类：RT-PCR证实转染3天后终止的Sertoli细胞中使用CAR特异性小干扰（si）RNA双工体通过RNAi敲除CAR(一)和免疫印迹(b条). M、 碱基对中的DNA大小标记（bp）。B类：CAR下降约70%(一和b条)转染3天后，还通过免疫印迹法检测支持细胞血液测试屏障（BTB）处的TJ（例如，闭塞素、克劳丁-11、JAM-A和闭塞小带1（ZO-1））、基础ES（例如，N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素）和桥粒蛋白（例如，桥粒糖蛋白-2、桥粒collin-2和γ-连环肽）的水平。值得注意的是，除了ZO-1的水平在Sertoli细胞中CAR被敲低约70%后下调约30%外，其他BTB蛋白的水平保持相对不变(一). 针对肌动蛋白标准化的CAR和ZO-1免疫印迹数据的密度分析，其中对照组被任意设置为1(b条). 每根钢筋的平均值±SD为n个=3个实验。C类：体外研究发现，CAR的敲除会暂时扰乱支持细胞TJ屏障。转染后3天进行PCR、免疫印迹（IB）和双标记免疫荧光分析（IF）。D类：为了研究细胞-细胞界面蛋白分布/定位的变化，将培养在Matrigel-coated盖玻片上的Sertoli细胞与siGLO Red（转染指示剂）与非靶向或CAR特异性siRNA双工体共转染，并对CAR（绿色荧光）、闭塞素（绿色荧光，或ZO-1（绿色荧光）打开第3天转染后3天对支持细胞进行IF处理（即。，第6天文化方面）。在CAR敲除细胞中检测到支持细胞-细胞界面CAR表达缺失（参见b条与。一). 尽管CAR RNAi对闭塞素的稳态水平没有明显影响(B类)发现其敲除会导致闭塞素的错误放大，导致其从细胞表面附近移动到细胞胞浆中。与闭塞素类似，CAR敲除除了下调ZO-1表达外，还破坏了ZO-1在支持细胞界面的定位/分布。比例尺=20μm in一，适用于b–f. **P（P）< 0.01.
通过RNAi监测支持细胞CAR敲除过程中的离靶效应的研究。两个干扰素刺激基因（ISG），即OAS1（寡腺苷酸合成酶1）和STAT1（信号转导子和转录激活子1），被用作评估非靶向效应的标记物，因为已知这些基因在RNAi载体转染细胞进行基因沉默时非特异性上调。与对照组相比，CAR敲低后，支持细胞中OAS1和STAT1均未上调。M、 碱基对中的DNA大小标记（bp）。
CAR敲除导致内吞小泡介导的蛋白质运输增加，并改变闭塞素磷酸化。
自CAR敲除导致Sertoli细胞TJ-通透性屏障部分破坏以来似乎是由于闭塞素内化增加导致蛋白质定位/分布变化的结果()采用蛋白内吞试验探讨这种可能性。值得注意的是，CAR的敲除确实显著增强，但在用非靶向对照siRNA双链转染Sertoli细胞的对照组中没有显著增强，闭塞素内吞动力学(,一和b条). 值得注意的是，在Le et al(24)使用细胞不可耐受但可硫醇裂解的生物素化试剂，即磺化NHS-SS-生物素，只有含有暴露的伯胺的支持细胞表面蛋白（包括闭塞素）才被生物素化。在指定为“Total”的通道中，它代表对照组中的总生物素化细胞表面蛋白，其中Sertoli细胞在未使用MESNA缓冲液剥离的情况下进行生物素化30分钟（即，在内吞前；～300μg蛋白质）用NeutraAvidin Plus微球将其拉下，并进行免疫印迹以可视化闭塞素，该闭塞素用于估计内吞闭塞素的百分比。由于在内吞试验前生物素化时，对照组和CAR siRNA组的细胞表面总闭塞素相似；因此，控制组的单个总车道如所示,一只有一小部分生物素化闭塞素被内吞(,一和b条). 简而言之，本试验的目的不是量化CAR敲除组与对照组中细胞表面闭塞素之间的差异，而是评估蛋白质内吞动力学的任何变化。众所周知，蛋白质内吞作用是通过整体膜蛋白（如闭塞素和E-cadherin）的蛋白质磷酸化的变化来调节的，至少部分是这样(7,17)接下来，我们检查了敲除组和对照组之间闭塞素中磷酸化-Ser、-Thr和-Tyr含量的任何变化。而Co-IP检测到的对照组和CAR-silenced Sertoli细胞之间的闭塞素水平相似()，与中显示的数据一致与对照细胞相比，CAR敲除细胞中磷酸化-Thr-occludin的水平显著降低，但磷酸化-Ser-或磷酸化-Tyr-ocludin水平没有降低，说明CAR沉默后封闭蛋白中磷酸化-Thr的含量降低(,一和b条).
RNAi通过建立TJ通透性屏障击倒支持细胞中的CAR，增强了闭塞素的内吞作用，并改变了闭塞素磷酸化状态。A类：支持细胞（0.45×106细胞/厘米2)在RNAi之前单独培养3天，其中通过将100 nM CAR特异性siRNA双工体与非靶向对照siRNA双倍体转染细胞24小时（参见). 三天后，进行内吞作用测定。使用总生物素化的细胞表面蛋白（Total，来自本文所示的对照组，其在CAR siRNA组中相似），在没有用2-巯基乙烷磺酸盐剥离的情况下，评估已经被内吞的occludin的百分比。使用等量的蛋白质（～300μg），通过使用Ultralink固定化NeutraAvidin Plus珠提取生物素化蛋白质（Pierce，包括相应肌动蛋白印迹所示的“Total”）。“-ve”表示不含生物素化的细胞表面蛋白质（～300μg），但使用NeutraAvidin Plus珠进行提取，并使用抗闭塞素进行免疫印迹（参见). 与对照细胞相比，支持细胞中CAR的敲除约70%可显著加速闭塞素（TJ整合膜蛋白）的内化(一). 肌动蛋白如所示一用作蛋白质负荷控制，代表NeutraAvdin下拉前支持细胞裂解产物中的肌动蛋白。此内吞实验的综合数据显示在b条其中每个数据点是的平均值±SDn个=3个独立实验。采用单因素方差分析进行统计分析**P（P）< 0.01.B类：首先对支持细胞裂解物（～300μg蛋白质）与免疫沉淀闭塞素抗闭塞素抗体进行联合免疫沉淀（Co-IP），非靶向对照组和CAR敲除组之间的样本中闭塞素水平相似（顶面板），与这也说明了两组之间的蛋白质负荷相等。然后用抗磷-Ser、-Thr或-Tyr抗体探测这些印迹（参见)并在随后的面板中显示(一). 对这些发现进行密度扫描，并与闭塞素水平进行标准化，对照组中的水平任意设置为1，并与之进行统计比较。每根钢筋的平均值±SD为n个=3-4个实验*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
支持细胞中CAR的敲除增强了闭塞素与内体的结合。
为了进一步扩展和确认和CAR敲除后蛋白内吞增加，我们检测了内吞囊泡相关蛋白如EEA-1（一种内体标记物；参考文献。35)或与CAR敲除后支持细胞中的闭塞素相关。值得注意的是，在CAR被击倒后，闭塞素被内化，它似乎与EEA1有更好的相关性(). 而CAR敲除的Sertoli细胞与对照细胞中EEA-1的稳态水平相似(,一和b条)Co-IP检测到闭塞素和EEA-1之间的相关性显著增加，具有统计学意义(,一和b条)，支持双标记免疫荧光分析得出的结果().
CAR敲除对支持细胞上皮内吞囊泡介导的蛋白转运的影响。A类：用CAR特异性siRNA双链体（CAR siRNA）转染细胞3天后，通过双标记免疫荧光分析检测EEA-1（红色，内体标记物）和闭塞素（TJ整合膜蛋白）在支持细胞上皮中的细胞定位及其在CAR敲除后的变化与非目标控制双工（Ctrl-siRNA）的比较。CAR敲除后，发现更多的闭塞素（绿色荧光）被内吞到支持细胞中，这与此外，闭塞素和EEA-1（红色荧光）似乎在CAR击倒细胞中更广泛地共定位（见“白色”箭头，表示CAR击落后闭塞素与EEA-1共定位增加）。DAPI（蓝色）用于显示细胞核。比例尺=20μm，适用于其他显微照片。B类：培养3天的支持细胞用CAR特异性siRNA双工体转染，而非靶向对照siRNA双倍体转染24小时。细胞用新鲜的F-12/DMEM冲洗和培养48小时，然后终止培养并用于免疫印迹。CAR敲除对Sertoli细胞中EEA-1的稳态水平没有明显影响(一)，以及的合成结果n个=3个实验显示在(b条); ns，无显著差异。C类：通过使用～300μg蛋白裂解物进行免疫沉淀，Co-IP用于评估CAR敲除后闭塞素与EEA-1之间蛋白-蛋白质相互作用的变化，如一无Co-IP的正常支持细胞裂解物（正常SC，40μg蛋白质）作为阳性对照(一).底部：IgG印迹H（H）和IgG我链，说明此Co-IP实验中的蛋白质负载相等(一). 在支持细胞中CAR敲除后，检测到闭塞素与EEA-1之间的相互作用增加(一). 复合数据，每个条形代表的平均值±SDn个=中显示的3个实验b条其中，对照组闭塞素与EEA-1的相对关联度任意设置为1，并与之进行统计比较*P（P）方差分析结果<0.05。
支持细胞中CAR的过度表达通过上调支持细胞BTB的TJ蛋白适配器ZO-1和桥粒蛋白促进TJ通透性屏障功能。
为了进一步验证RNAi获得的阐明CAR在BTB动力学中调节作用的数据，通过PCR分离出全长CAR cDNA()使用来源于Sertoli细胞RNA的cDNA作为模板，连接到哺乳动物表达载体pCI-neo(). 该pCI-neo/CAR质粒用于在支持细胞上皮中过度表达CAR，并建立了TJ通透性屏障(,A类和B类). 与RNAi的研究结果一致，在RNAi中，CAR的敲除扰乱了Sertoli TJ-屏障功能，CAR过度表达()约50%()导致Sertoli细胞TJ通透性屏障“收紧”(). 免疫印迹研究还表明，CAR过度表达导致ZO-1表达上调，与其中其敲低可以下调ZO-1的表达，但也可以上调桥粒蛋白-2和桥粒蛋白-2，但不能上调其他BTB相关的TJ和基础ES蛋白(,一和b条).
CAR过度表达对体外支持细胞TJ通透性屏障和BTB组成蛋白稳态水平的影响。为了证实基于RNAi的CAR在调节BTB功能中的生理作用，用pCI-neo/CAR载体和空pCI-nee载体（对照）转染Sertoli细胞，以检测CAR瞬时表达后TJ-屏障功能的变化。A类：通过RT-PCR检测转染含有全长CAR结构的pCI-neo/CAR载体的Sertoli细胞与空载体（pCI-nee）的CAR表达的增加。B类：1.2×10时的支持细胞6细胞/厘米2单独培养3天以建立功能性TJ通透性屏障，然后用pCI-neo载体和pCI-no/CAR载体转染。通过量化支持细胞上皮的TER来监测TJ屏障功能的变化。每个数据点的平均值±SD为n个=代表性实验的3个重复，从3个独立实验中获得类似结果**P（P）通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett检验得出<0.01。C类：通过免疫印迹法进一步证实用pCI-neo/CAR载体转染Sertoli细胞后CAR表达增加(一). 同样值得注意的是ZO-1的上调，与发现CAR的敲除与ZO-1的下调有关(一). 在Sertoli细胞中CAR过度表达后，持续检测到桥粒蛋白桥粒蛋白-2和桥粒collin-2上调，如一。免疫印迹数据总结在直方图中，如b条，说明ZO-1的显著上调(顶部)，桥粒蛋白-2，和桥粒蛋白-2(底部)CAR过表达后的表达。每根钢筋的平均值±SD为n个=4–5个实验中，目标基因的表达与相应的肌动蛋白水平标准化，转染pCI-neo空载体的Sertoli细胞中的蛋白水平任意设置为1，并与之进行统计比较*P（P）< 0.05.
讨论
CAR最初于1997年确定(2)作为柯萨奇病毒和腺病毒的受体(三,12). 它是多种上皮和内皮细胞中TJ的组成蛋白和细胞粘附分子(10,32,61). 现已证实，CAR是心肌细胞之间的一种重要的TJ整合膜蛋白，通过相邻细胞之间CAR的同型相互作用而被称为心脏内的间盘，对调节心脏重塑和心房与心室之间的电导至关重要(11,42). 由于CAR是腺病毒的特异性受体，因此也对CAR在腺病毒基因治疗中的应用进行了广泛的研究(23,50,68). 然而，最近的研究表明，CAR是一种具有多种功能的分子；其对细胞生理学的贡献远远超出其在TJ和其他细胞间连接处的结构和细胞粘附作用。例如，CAR被证明是一种转移性肿瘤抑制剂，因为它的表达降低了小鼠癌细胞的肺转移潜能(66). 然而，CAR的表达对于肺癌细胞亚群中肿瘤的有效形成也是必需的(44)，其表达对于支持结肠癌腺瘤的远处转移和减少凋亡是必要的(54). 总之，这些发现说明了其与肿瘤发生的关系。此外，CAR最近被证明在心脏受损心肌的再生中起支持作用(59)，通过脑内吞作用参与氯氰菊酯介导的细胞器的轴突运输，实现神经元稳态(48)以及通过将连接蛋白45（GJ整合膜和结构蛋白）、β-连环蛋白和ZO-1募集到适当的房室传导和心脏功能部位来调节心脏心室间盘的信号功能(31). 简而言之，基于对多个组织和/或器官的研究，有越来越多的证据支持CAR在细胞生理学不同方面的生理作用不断扩大。
在本报告中，CAR不仅仅是支持细胞BTB中TJ的一个结构成分。首先，在没有任何明显的非靶向效应的情况下，发现其敲除与支持细胞上皮中ZO-1表达的下调有关，该下调与体内模拟支持细胞BTB的TJ屏障有关，表明CAR可能在BTB的蛋白表达中起调节作用。我们的观察结果也与最近的一份报告一致(31)使用心脏特异性CAR条件敲除（CAR-cKO）小鼠，其中心脏中的CAR-KO也导致β-catenin和ZO-1在插入盘的表达显著下降，这是由TJ、AJ和GJ组成的心肌细胞之间的超微结构。更重要的是，发现其敲除与支持细胞TJ通透性屏障的破坏以及支持细胞BTB处TJ蛋白闭塞素的内吞增加有关。内吞小泡介导的蛋白质运输的增加显然是由于闭塞素中磷酸化-Thr（而非磷酸化-Ser或磷酸化-Tyr）的丢失，这反过来导致闭塞素与EEA-1（一种内体标记物）之间的联系增加，这得到了Co-IP实验的支持。CAR调节闭塞素磷酸化含量的机制可能通过c-Src介导，后者是BTB的一种非受体蛋白酪氨酸激酶(8)，因为c-Src是少数几个在睾丸中与CAR形成蛋白复合物的调节激酶之一(62). 例如，无论是磷脂酰肌醇3-激酶还是黏着斑激酶（FAK）都没有发现与CAR在结构上相关(62)即使两种磷脂酰肌醇3-激酶(53)和FAK(51,52)，尤其是p-FAK-Tyr407(30)已定位于大鼠睾丸中的BTB，并在上皮周期的特定阶段表达。在此背景下，值得注意的是，Co-IP的使用证明了闭塞素和EEA-1之间的相互作用；这一过程可能会降低内吞小泡的其他成分（但不是整个内吞小囊，因为使用的是支持细胞的裂解物，而不是完整的细胞），例如参与再循环或蛋白质降解的蛋白质，也可能参与干扰支持细胞的TJ-屏障功能。然而，由于在实验期间蛋白质的稳态水平保持不变，CAR的沉默不太可能会增强内体介导的闭塞素降解。总的来说，这些数据支持这样的观点，即CAR在BTB中可能发挥调节作用，以协调不同粘附蛋白复合物在位点的正常功能。在此背景下，值得注意的是，已知CAR在多上皮细胞的TJ处与衔接蛋白ZO-1和β-连环蛋白相关(10,60)，可作为连接CAR与底层肌动蛋白细胞骨架的连接物。由于ZO-1在结构上也以1:1的化学计量比与occludin相互作用(13); 因此，ZO-1的下调可能导致BTB处基于occludin-ZO-1的粘附功能的丧失，并且不与ZO-1结合的“游离”occludin可能导致其“不需要的”磷酸化，可能通过c-Src，这触发了其内化的增加，如本文所示。然而，导致CAR基因敲除后ZO-1表达下调的确切分子信号事件和/或机制尚待确定。其次，在支持细胞上皮中过度表达CAR的研究支持了这些发现，CAR被发现“收紧”和“促进”支持细胞TJ通透性屏障。CAR的过度表达也能上调Sertoli细胞中的ZO-1，这与RNAi实验的结果一致。有趣的是，CAR的过度表达也上调了桥粒的桥粒芯蛋白-2和桥粒结合蛋白-2的表达，桥粒是一种推测的完整膜蛋白和适配器，与共存的TJ、基底ES和GJ一起构成BTB(8,29)表明CAR作为TJ蛋白，可能作为一种“信号分子”调节桥粒组成蛋白的表达。然而，值得注意的是，如本文基于多项实验所示，CAR的敲除未能下调桥粒蛋白-2和桥粒collin-2的表达，这表明只有CAR的过度表达才能触发一些非预期的信号通路，从而导致这两种桥粒蛋白的上调。尽管如此，这些发现说明了CAR在协调其他粘附蛋白复合物以维持BTB屏障功能方面的可能作用。这一发现也与最近的一份报告一致(31)说明在心脏CAR-cKO小鼠中，CAR的丢失也会影响夹层椎间盘连接蛋白45（GJ蛋白）的表达，从而干扰房室传导以协调心脏功能。在CAR基因敲除或敲除后，极有可能存在类似的潜在分子机制诱导这些不同器官中ZO-1、β-catenin和connexin 45的下调，这应该在未来的研究中得到大力评估。
基于CAR的细胞粘附特性，以及在支持细胞和生殖细胞中都发现CAR的事实(36,37,62)据推测，在上皮细胞周期VIII-IX期，精母细胞（SP）中的CAR与支持细胞（SC）中CAR形成同型相互作用，从而维持精母细胞中CAR“替代”的屏障功能相邻Sertoli细胞（SC/CAR-CAR/SC）之间的两个相互作用的CAR之一，形成一个瞬态SP/CAR-CC屏障(61). 有趣的是，现在普遍认为，为了在上皮细胞周期第VIII-IX期BTB处的前精原细胞转运期间保持BTB的完整性，“新的”BTB（例如，TJ纤维）首先在迁移的前精母细胞后面组装，这些前精原母细胞通过细胞间桥以“克隆”形式连接，在“拆卸”“旧”BTB之前(7,8,38). 因此，在精母细胞通过BTB的转运过程中，CAR除了作为精母细胞和支持细胞之间的同型相互作用粘附分子外，还可能分别参与迁移精母细胞基底区和顶端区附近“新”BTB的组装和“旧”BTB分解，通过其在这两个位点上相应的“过度表达”和“沉默”，如本报告所示。在未来的研究中必须仔细评估这种可能性。然而，本文报告的研究结果提供了设计功能实验的框架。
披露
作者未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。
作者贡献
作者贡献：L.S.和C.Y.C.进行了实验；L.S.、D.D.M.和C.Y.C.分析数据；L.S.和C.Y.C.编制的数字；L.S.、D.D.M.和C.Y.C.批准了手稿的最终版本；D.D.M.和C.Y.C.研究的概念和设计；D.D.M.和C.Y.C.解释了实验结果；C.Y.C.起草的手稿；C.Y.C.编辑和修订手稿。
致谢
这项工作得到了国家儿童健康和人类发展研究所赠款的支持R01-HD-056034; （致C.Y.Cheng）和U54-HD-029990项目5（致程振英）和国家自然科学基金31101043（对L.Su说）。
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