TOR复合物1的氨基酸调节

摘要

TOR（雷帕霉素靶点）是创始成员PI3-激酶相关蛋白（Ser/Thr）激酶亚家族的酿酒酵母（Sc）作为突变基因的产物，该突变基因对雷帕霉素抑制生长/增殖具有显性抗性(43,64). ScTOR是细胞生长（细胞质量/大小增加）和增殖紧密耦合过程的关键调节器，因为它能够控制总体mRNA翻译以响应营养物质的可用性(6). TOR多肽约为300 kDa，含有～200 kDa的氨基末端非催化序列，主要由HEAT重复序列组成，在蛋白质的羧基末端三分之一处有一个双叶激酶结构域，其氨基酸序列与PI脂激酶的氨基酸序列相似，比典型蛋白激酶的氨基酸顺序更接近(58). 酵母含有两个TOR基因，而在后生动物中只发现一个TOR基因。然而，在所有真核生物中，TOR存在于两个独立调节、功能不同的异寡聚物复合物中，即TOR复合物1和2(41,59,69). TOR复合物1（TORC1）是细胞生长（即细胞质量/大小）调节的营养反应介质，由TOR和WD螺旋桨结构域组成，包含raptor和Lst8/GβL(41,59,60,69). 雷帕霉素与多肽FKBP12形成1:1的复合物，在位于mTOR催化结构域（mTOR AA 2148-2430）稍微氨基末端的调节（FKBP12-雷帕霉素结合/FRB）结构域（mTOR AA 2014-2115）处直接与TORC1中的TOR多肽结合，并抑制TORC1信号功能(13,14). 雷帕霉素不敏感ScTOR2突变体(43,64)包含位于该片段的单点突变（相当于Ser²⁰³⁵mTOR）消除FKBP12-雷帕霉素复合物的结合。哺乳动物TOR复合物2（TORC2）除了TOR和Lst8外，还含有必需的多肽rictor和sin1(54,69,96)与肌动蛋白细胞骨架和某些AGC激酶亚家族如Akt/PKB的调节有关(98)和新型PKC(27,48,96). TORC2中的TOR多肽对雷帕霉素-FKBP12复合物不可用，因此TORC2不易受到雷帕霉素的直接抑制，尽管雷帕霉素长期治疗会损害某些细胞中TORC2的组装(97). Lst8与两种配合物中的mTOR催化结构域紧密结合；然而，其在mTORC1复合物中的功能尚不清楚，因为Lst8基因敲除伴随着mTORC2功能的选择性丧失，而mTORC 1功能似乎被保留(36). 相反，猛禽为TORC1提供底物结合功能，因此是必不可少的；猛禽物候副本丢失TORC1丢失(41,73).

令人惊讶的是，已知的哺乳动物TORC1复合物的直接底物很少；最具特征的是翻译调节蛋白p70 S6激酶（S6K1），一种AGC家族激酶，以及真核启动因子（eIF）4E-结合蛋白（4E-BP），即mRNA 5′cap结合蛋白eIF4E的抑制剂。S6K1和4E-BP通过一个或多个短基序直接与猛禽结合；最具特征的是TOR信号（TOS）基序，其在S6K1和4E-BP中的形式为Phe-Ac-φ-Ac-φ（其中Ac=Glu/Asp和φ=Leu/Ile/Met）(100); Phe的突变消除了这些多肽与猛禽结合并被细胞内mTORC1磷酸化的能力(82,100,101). 在S6K1的情况下，如果TOS基序的去除/失活伴随着羧基末端非催化尾的缺失，则这种在细胞中对mTORC1不可见的双突变S6K1类似于Akt，因此在其激活位点（Thr^389/412)TORC2以胰岛素应答但雷帕霉素耐药的方式(1,11,121). 尽管已知除S6K1和4E-BP外的mTORC1底物（例如STAT3、HIF1α、PRAS40、IRS-1），但已证明S6K1与4E-BP的mTORC催化磷酸化至少部分地是mTORC1-促进细胞增大的能力的基础(31). 雷帕霉素可能是最具选择性的蛋白激酶抑制剂，因此是TORC1功能的有价值探针。雷帕霉素抑制S6K1活性，在所有被检测的哺乳动物细胞中抑制率>98%。抑制S6K1活性（IC₅₀～2 nM）归因于雷帕霉素在Thr处阻止S6K1多肽的TORC1催化磷酸化的能力^389/412，位于S6K1催化结构域的疏水段羧基末端的调节位点，其磷酸化对S6K1活性必不可少(88). 因此，S6K1（Thr^389/412)细胞中的磷酸化通常被用作TORC1激酶活性的反映(122). 然而，需要强调的是，在体外添加足以完全抑制完整细胞中这种磷酸化的雷帕霉素浓度（作为与FKBP12的复合物）时，对mTORC1直接磷酸化S6K1（Thr^389/412); 体外抑制TORC1激酶需要50倍或更高浓度的雷帕霉素/FKBP12，在这些水平上，雷帕霉素-FKBP12复合物还促进猛禽与mTOR的分离(85). 因此，雷帕霉素抑制体内mTORC1信号传导的主要机制尚不明确，但可能反映了雷帕霉素介导的底物提呈的中断，而不是（或可能是）抑制mTOR催化功能。相反，TOR抑制剂LY-294002（IC₅₀~5μM）和wortmannin（IC₅₀～0.3μM）作用于激酶ATP结合位点，后者通过不可逆共价机制，抑制TORC1和TORC2(7).

生长因子通过PI3K/Akt途径或Ras/MAPK途径调节TORC1活性，PI3K/Akt途径或Ras/MAPK途径汇聚在结节性硬化异二聚体复合物（TSC1-TSC2）上，通过TSC2的磷酸化抑制GTPase激活功能（GAP活性）向小GTPase Rheb（大脑中富集的Ras同源物）(20,49,65). Rheb被鉴定为一种基因，其在大鼠大脑中的表达被癫痫发作和诱导长期增强的刺激上调(35,124). 哺乳动物细胞中存在两种Rheb，即Rheb1和Rheb2，而酵母和果蝇属.果蝇属Rheb被鉴定为一种基因，其功能丧失导致细胞尺寸减小，功能增强导致细胞自主增大(87,99,113). 基因证据果蝇属将Rheb置于TSC复合体的下游，生化研究证实TSC复合物作为Rheb的GTPase激活蛋白发挥作用(10,33,50,115,126). TSC1或TSC2的消除或失活会导致Rheb的GTP充电分数增加至远高于90%，并导致TORC1的组成性激活，而胰岛素或生长因子不会进一步增强TORC1。关于作用于Rheb的鸟苷酸交换因子，人们知之甚少，尽管果蝇属“翻译控制肿瘤蛋白”（TCTP）的直系物被提出来催化这个反应(46). 因此，Rheb-GTP是TORC1的激活剂；与雷帕霉素-FKBP12一样，Rheb似乎并不调节TORC2。

细胞应激通过多种机制抑制TORC1，这些机制也集中在TSC复合体上；例如，能量耗竭或缺氧会激活AMPK，AMPK（与GSK3协同）磷酸化TSC2并激活TSC-GAP功能(51,52). 糖皮质激素(118)，缺氧(111)和其他应激诱导REDD1多肽的表达，该多肽结合14-3-3，从而减轻14-3-3对TSC GAP功能的抑制(21). 因此，这些对TORC1的负调控输入似乎主要通过上调TSC复合体的GTPase激活功能发挥作用。AMPK通过猛禽的直接磷酸化作用对TSC-null细胞中的TORC1产生一定的抑制作用(38)，尽管这种抑制的效力远低于存在完整TSC时的效力。TOR调节最不为人所知的方面是氨基酸控制TORC1活性的机制，这是接下来讨论的重点。与生长因子或应激相比，氨基酸对TORC1的调节有一个主要区别，即在TSC-null细胞中，氨基酸的调节只有轻微改变(89,110)，表明氨基酸调节的主要位点位于TSC的下游或独立于TSC的途径上。

TOR的营养调节概念来自于年的研究酿酒酵母其中，雷帕霉素治疗或两个TOR基因的失活会导致mRNA翻译大幅下降（90%），导致细胞周期早期的增殖停滞，并抑制其他几个合成代谢程序，同时激活分解代谢程序，如自噬(6). 这种阻滞表型与Go非常相似，Go是一种营养缺乏或生长在非常贫瘠的氮或碳源上的状态。因此，作为细胞生长和增殖的主要调节器，ScTOR被认为是营养反应途径的一部分，可能自身受到营养信号的调节。后来的研究表明，ScTORC1对谷氨酰胺的充足性反应最为敏感，因为谷氨酰胺缺乏和雷帕霉素都会导致调节谷氨酰胺合成的几个转录因子的核定位和活化(19); 然而，影响ScTOR的谷氨酰胺调节机制的分子成分仍未明确。TOR在完整后生动物细胞生长的营养调节中的作用的第一个证据是：果蝇属TOR阻止幼虫发育，并产生与氨基酸缺乏引起的细胞表型相似的细胞表型，即核仁大小显著减小，幼虫脂肪体中大量脂质小泡聚集，以及细胞周期阻滞的细胞类型特异性模式(84,125).

氨基酸对哺乳动物细胞中TORC1的相对直接调节的证据首先由以下发现提供：从组织培养基中去除1到2小时的氨基酸会导致选择性抑制S6K1和4E-BP去磷酸化，使这些靶点对胰岛素无反应；在没有血清或胰岛素的情况下，将氨基酸恢复到基础水平，可以恢复4E-BP磷酸化、S6K1活性及其对胰岛素的反应性，而进一步提高氨基酸浓度可以完全激活S6K1，从而胰岛素不会引起进一步激活(42). S6K1的氨基酸活化被雷帕霉素抑制，并由胰岛素发生的相同位点阵列的磷酸化介导，因此反映了TORC1的活性。重要的是，上述S6K1的双突变、雷帕霉素抗性变异体也被发现对氨基酸提取的抑制具有抵抗力，从而确定S6K1氨基酸调控发生在mTORC1或上游。氨基酸的退出不会干扰胰岛素激活Akt的能力，Akt是一种需要激活1A型PI3-激酶和TORC2的输出(98); 此外，氨基酸提取抑制S6K1的能力仅在TSC-null细胞中有轻微延迟，并且在Rheb-GTP充电没有改变的情况下受到影响(89,110). 因此，氨基酸调节mTORC1的途径在很大程度上独立于1A型PI3-激酶，并且不涉及Rheb GTP充电的调节。然而，值得注意的是，重组Rheb的过表达达到非常高的水平，例如，比内源性Rheb高10至100倍，能够完全克服由氨基酸退出引起的mTORC1信号传导的抑制(70–72). 体内，Rheb在果蝇属足以抵消脂肪体和唾液腺等组织中氨基酸饥饿的影响(113). 氨基酸的去除/恢复不会改变从暴露于这些处理的细胞中提取的TOR多肽的体外测定的激酶活性(37,42,70; 尽管参见参考。37)表明TOR的氨基酸调节可能不涉及TORC1组分的稳定修饰，而更可能是内源性Rheb-GTP激活mTORC1的能力的可逆抑制。

关于Rheb激活mTORC1的生化机制，Rheb并没有通过调节氨基酸摄取来实现这一作用，因为过度表达Rheb（或TSC1/2）不会影响细胞内单个氨基酸的稳态浓度，包括支链氨基酸和精氨酸的浓度。此外，尽管去除细胞外氨基酸会降低细胞内总氨基酸水平，但Rheb的过度表达并不能防止这种下降，TSC1/2的过度表达也不会增加这种下降(81). 类似地，在果蝇属S2细胞，Rheb过度表达激活TORC1信号，但不促进葡萄糖、大量氨基酸或精氨酸的输入(39). 因此，Rheb不会通过调节细胞内氨基酸水平来激活TORC1信号。

大量证据支持Rheb通过与mTOR的直接相互作用激活TORC1的观点。Rheb直接与TORC1中TOR激酶结构域（mTOR AA 2148-2300）的上小叶结合(71). Rheb直接与mTOR催化域结合的能力与Rheb-GTP激活TORC1的正常过程中发生的这种相互作用相一致；然而，Rheb对TOR的亲和力很弱，内源性Rheb与内源性mTOR的相互作用还没有确定，即使在TSC-null细胞中也是如此。然而，小GTPase与其效应器之间的其他重要生理作用，例如ras-GTP和1A型PI 3-激酶，表现出相对较低的亲和力(86)Rheb和mTORC1在重叠的内膜隔室上大量共定位，这可能会有所缓解。Rheb-mTOR相互作用的一个更不寻常的特征及其生理意义值得注意的是，重组Rheb在体外和细胞内结合mTOR的能力不依赖于Rheb-GTP充电或受其刺激；核苷酸缺失的非活性Rheb突变体实际上比野生型Rheb更紧密地结合mTOR。然而，当mTOR与这种核苷酸缺失的Rheb突变体共表达时，与这些Rheb突变株检索到的mTOR多肽在体外检测时基本上没有激酶活性(71). 这一发现表明，mTOR与天然的、可能带有GTP的Rheb的相互作用对于mTOR（至少在TORC1中）实现催化能力至关重要。调节其与mTOR相互作用的Rheb区域未知；Rheb突变表明Rheb开关1结构域的突变(71)，其配置高度依赖GTP，并且交换机2域(70)几乎不被GTP改变，这两种药物都使过表达的Rheb无法刺激氨基酸保护细胞中的mTORC1信号。Tamanoi等人的发现进一步证明了Rheb/TOR直接相互作用在TOR激活中的重要性(117)，他选择了葡萄裂殖酵母Rheb；在体外，这些突变体在不改变GTP结合的情况下，对GDP的亲和力显著降低。尽管是野生型S.pombe公司Rheb不能与共沉淀S.pombe公司TOR和在蔗糖密度梯度上不与SpTOR相结合，这种过度活跃S.pombe公司野生型水平表达的Rheb突变体与内源性Rheb共沉淀并结合S.pombe公司任务大纲。SpTOR突变体在信号传递效率和SpTOR亲和力方面的伴随增强表明这两种表型是因果相关的；然而，这仍然是推断性的。最后，Sancak等人(95)报道了在体外将Rheb GTP直接加入mTORC1导致TORC1激酶活性的激活；这一结果，如果在分子方面得到证实和定义，将为Rheb/mTOR直接相互作用在TORC1调节中的作用提供无可争议的支持。

氨基酸（或仅亮氨酸或精氨酸）的退出降低了重组Rheb与内源性或共表达重组mTOR结合的能力，这一发现为氨基酸退出抑制mTORC1信号的能力提供了一个现成的潜在解释(72). 氨基酸提取的这种效果也可以解释为什么需要大量Rheb过度表达，产生的Rheb-GTP水平远远高于TSC-null细胞中的水平，以克服氨基酸提取产生的mTORC1抑制。氨基酸提取抑制Rheb-mTOR相互作用能力的生化机制尚不清楚；然而，Rheb-mTOR相互作用的氨基酸调节完全通过mTOR进行，并通过TOR激酶结构域的下叶进行调节；下叶的缺失（mTOR AA 2301-2430）消除了氨基酸提取抑制Rheb与上叶结合的能力（mTOR AA 2148-2300），而不会显著改变Rheb结合本身。因此，氨基酸充足性调节mTORC1的机制似乎与Rheb激活mTORC2的机制密切相关；然而，不幸的是，Rheb调节mTOR的机制尚不清楚。

提出了两种机制，即Rheb可以间接激活TORC1，而无需直接与Rheb-mTOR相互作用。其中一种途径是通过磷脂酰胆碱（PC）的磷脂酶D催化水解产生磷脂酸（PA）。使用1-丁醇（而非2-丁醇）抑制PA积累(29)或RNAi诱导的PL-D1耗竭(28)减少血清刺激的S6K1和4E-BP磷酸化，有力支持了PL-D1通过产生PA为mTORC1提供正输入的观点。PA作用的部位似乎是mTOR本身；含PA的PC小泡通过mTOR-FRB结构域内的一个位点与mTOR发生盐敏结合，这种结合由几个碱基残基，特别是精氨酸（Arg）介导²¹⁰⁹添加FKBP12-雷帕霉素复合物将PA囊泡从分离的FRB结构域中置换，而雷帕霉素不敏感FRB突变体Ser²⁰³⁵我以雷帕霉素不敏感的方式结合PA囊泡。mTOR（参数²¹⁰⁹Ala）突变体在体外表现出未改变的激酶活性，但mTOR-WT在激活共表达S6K1方面的功效仅为～60%(29). 最近Sun等人(114)据报道，直接在体外添加的Rheb以GTP依赖的方式与PL-D1结合并刺激其活性。因此，Rheb被添加到广泛的PL-D上游调节因子中，包括蛋白激酶C亚型、ARF、Rho和Ras家族的其他小GTPase，尤其是磷脂酰肌醇4,5-二磷酸。在该途径中，Rheb-GTP刺激PL-D1产生PA，PA通过与mTOR直接结合，促进体内TORC1激活；未观察到加入PA对体外TORC1激酶活性的刺激作用。PA可以通过指导mTORC1的定位，使其接近Rheb或其他元素，而不是通过直接调节其催化功能发挥作用；PA在Raf激酶的调节中也有类似的作用。或者，PA可以参与FKBP38的mTOR监管，下文将进行讨论。

Rheb激活TOR的第二种机制不需要直接的Rheb-TOR相互作用，涉及雷帕霉素敏感性肽脯氨酰顺-反式异构酶（PPI）FKBP38。Bai等人(5)在带有Rheb诱饵的双杂交筛选中检索到FKBP38，并证明从293细胞共沉淀内源性多肽。FKBP38包含一个类似FKBP12的PPI结构域，即Rheb结合位点，随后是三个TPR重复序列，一个典型的Ca²⁺-钙调蛋白（CM）结合域及其羧基末端附近的跨膜结构域(67,109). FKBP38多肽通过羧基末端跨膜结构域与内膜和线粒体外膜结合，从而使多肽的大部分面向细胞质。先前的研究表明，FKBP38的催化功能是由钙钙调素复合物（EC）激活的₅₀～290 nM）与Ca结合²⁺-CM绑定域，将其从PPI域中替换(25,26). 由此释放，PPI结构域能够结合并抑制Ca中的Bcl2²⁺-依赖方式，从而促进钙²⁺-诱导多种细胞凋亡。钙²⁺-CM与FKBP38的结合也使三个四肽（TPR）重复序列能够与HSP90结合，HSP90本身是Ca²⁺-CM结合蛋白。FKBP38/Ca三元配合物²⁺-CM/HSP90无酶活性，不能结合Bcl2；因此，HSP90的可用性控制了钙的能力²⁺向合作伙伴提供FKBP38 PPI域(24). FKBP38也被鉴定为在过度表达TSC1或TSC2的HeLa细胞中显著不受调控的转录物之一，并且RNAi诱导的FKBP38s缺失逆转了TSC1或TSC2过度表达导致HeLa电池大小（FSC）减少（10-14%）的现象(92). Bai等人(5)证明FKBP38的过度表达抑制了由氨基酸再摄取或Rheb过度表达引起的4E-BP磷酸化，而RNAi诱导的内源性FKBP38-缺失上调了基础S6K1（Thr^389/412)和4E-BP磷酸化，并改善这些磷酸化的抑制作用，这些抑制作用发生在血清或氨基酸提取过程中。此外，体外添加FKBP38抑制了mTORC1激酶的活性。因此，FKBP38似乎是mTORC1的内源性抑制剂。重要的是，FKBP38优先于Rheb-GDP直接与Rheb-GTP结合，还以雷帕霉素不敏感的方式与包含FRB域（AA 2015-2114）的mTOR段（AA 1967-2191）结合。FKBP38与mTOR（AA 1967-2191）的结合是一个不结合Rheb的片段，但通过添加Rheb-GTP（而不是Rheb-GDP）抑制了FKBP38-mTOR的结合，可能是因为Rheb-GTP与FKBP38.的结合干扰了FKBP 38结合mTOR的能力。FKBP38通过其FKBP12-like结构域与mTOR结合；Rheb-GTP从mTOR中取代FKBP38的能力与Rheb-GTP也结合到该FKBP12-like片段的能力一致。调节Rheb与mTOR和FKBP38结合的区域未定义；然而，与野生型Rheb相比，核苷酸缺陷型Rheb-D60K突变体结合mTOR和FKBP38的强度更高，并没有从mTOR（AA 1967-2191）中取代FKBP39，这表明Rheb可能使用不同的结构域结合这两个伴侣。血清添加促进了Rheb-GTP的充电，增强了Rheb与FKBP38的结合，减少了FKBP38-mTOR的结合，这可能反映了Rheb-GTP从mTOR中取代FKBP38.的能力。氨基酸撤除减少了Rheb与FKBP38的结合，同时增加了FKBP38-mTOR的结合；由于氨基酸提取不会改变Rheb-GTP的充电，因此对这种行为的解释尚不明确。

总之，数据表明FKBP38在调节mTORC1中具有重要作用；然而，关于TORC1调节的PL-D1/PA和FKBP38机制仍然存在问题。首先，迄今为止，这两种机制都缺乏支持性的遗传证据。在细胞化过程中，PL-D-缺失果蝇的生存能力降低，但PL-D-缺乏的成虫则明显正常(66)与PL-D在果蝇属TOR规定。果蝇属编码FKBP38同源物（CG5482）；然而，已经揭示Rheb、TSC、REDD等元素的细胞/器官筛选尚未（到目前为止）确定CG5482是细胞大小的调节器。更确切地说，SpRheb是TORC1活性的主要调节因子(三)尽管在S.pombe公司可以想象，PL-D和/或FKBP38在TORC1调节中的参与可能仅限于高等后生动物，例如脊椎动物。对于所有输入，Rheb无疑是哺乳动物TORC1的主要近似调节器；然而，Rheb与mTOR、PL-D1或FKBP38的相互作用对TORC1激活的相对贡献尚待确定，并且多个机制可能以并行或相互依赖的方式同时运行。由于PA与mTOR的结合与雷帕霉素-FKBP12复合物竞争(29)，PA也可能参与FKBP38对mTOR抑制的缓解。FKBP38作用的重要调节剂包括细胞内钙水平和/或HSP90。无法解释氨基酸提取/再摄取增强/减少FKBP38/mTOR相互作用，同时减少/增强FKBP38/Rheb相互作用的能力。也许，就像氨基酸提取对Rheb-mTOR相互作用的影响一样(72)，氨基酸提取可能通过TOR作用于增强FKBP38在FRB结构域附近的结合，从而降低FKBP38-对Rheb的可用性。将TORC1的氨基酸调控作用位点置于TOR本身而非Rheb，为解释TORC1调控提供了一个框架酿酒酵母，其中FKBP38同源物不存在，Rheb似乎不调节TORC1。虽然可能有多种机制(图1)（包括Rheb非依赖性输入）存在于TORC1的调节中，在基本阐明氨基酸调节机制之前，需要对Rheb调节mTORC1机制有更全面的了解。

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图1。

雷帕霉素复合物1（mTORC1）哺乳动物靶点Rheb-GTP活化的候选机制。图中为～AA 1967-2500的mTOR段；矩形裂缝将催化结构域分为上（AA 2147-2300）和下（AA 2301-2430）叶。Loop代表FKBP12-雷帕霉素结合（FRB）结构域（AA 2014-2115）。胰岛素和生长因子通过抑制结节性硬化复合物（TSC）（一种Rheb GTPase激活物）促进Rheb的GTP充电，如图所示C类.说明了Rheb-GTP激活mTORC1的三种模型。一：Rheb结合到催化域的上叶，当GTP充电时，激活mTOR。氨基酸的提取通过对下叶的影响，干扰了Rheb与上叶的结合。B类：Rheb-GTP促进磷脂酶D1活化的能力产生磷脂酸（PA），磷脂酸与FRB结构域结合，促进活化。C类：Rheb-GTP结合mTOR抑制剂FKBP38，与mTOR竞争并取代它，解除mTOR激酶活性的抑制。氨基酸的作用部位B类和C类未知。

GTPases的rag亚家族rag A–D最近成为氨基酸调节TORC1信号通路的组成部分。抹布是编码GX的小GTP结合蛋白₄GKS/T和DXXG图案；破布A和B，而不是C和D，包含一个位置适当的NXXD基序，而所有四个都包含一个HKM/VD，可能参与鸟苷结合。没有明显的候选S/CA基序，也没有法尼基化或肉豆蔻酰化基序(103). 人类抹布A（313AA）和抹布B（346AA）的相同性超过98%，不同之处仅在于抹布B中33个氨基酸的氨基末端延伸；抹布B也有一个较长的亚型，在AA76之后有一个28 AA的插入物，位于开关1回路的中心。Rag C（399 AA）和D（400 AA）总体上77%相同，主要区别在于它们的氨基末端60和羧基末端30个氨基酸。Rag A/B与Rag C/D的同源性仅为~20%，每个与Ha-ras的同源性约为17-18%，具有超出Ha-ras序列的长羧基末端延伸；rag A/B多肽通过这些羧基末端片段作为异二聚体与rag C/D结合(103)并作为必需的异二聚体发挥作用。在最活跃的形式中，rag A/B是GTP收费，而rag C/D是GDP收费。尽管有证据表明ras也可能作为二聚体发挥作用(53)稳定二聚体的形成，特别是rag二聚体活性形式每一半中鸟苷酸的不协调磷酸化状态，是这些小GTPase的独特特征。rag蛋白与酿酒酵母; 人类破布A[Q66L]将拯救Gtr1 LOF突变体(45). Gtr1最初以突变形式在RCC1（Ran-GEF）突变体抑制剂的筛选中检索到，野生型Gtr1通过Gtr2对Gsp1/Ran进行负调控(80,103). 重组rag A-GTP主要为细胞质，而rag A-GDP在细胞核中呈斑点状，当共表达时，rag C/D紧跟在rag A之后(103). Gtr1/2或rag与多种核蛋白的关联(104,116,119)支持这些GTPase通过细胞核循环的可能性。高和凯撒(32)然而，确定了Gtr1/2的主要内体定位；他们在一次筛查中检索到了Gtr1和Gtr2，以寻找一般氨基酸转运蛋白GAP1功能所需的基因，GAP1在氨基酸缺乏时被转运到细胞表面(12,93). Gtr1/2多肽的下拉研究恢复了蛋白质EGO1/{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE3”，“term_id”：“3”}}GSE3标准、EGO3/{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE2”，“term_id”：“2”}}GSE2型和Ltv1，所有这些都是GAP1功能所必需的。Gtr1、Gtr2、EGO1和EGO3的组成复合物通过EGO3连接到内体；EGO1/3是没有后生动物同源物的小多肽（184/162 AA）。复合物使GAP1易位到PM的能力取决于Gtr2p和GAP1之间的直接相互作用，Gtr1p的GTP充电，其次，Gtr2p的GDP充电(32). EGO-Gtr复合物保留在终末体上，可能促进GAP1装载到循环囊泡上，以转位到PM。EGO-Gtro复合物对氨基酸通透性酶中的GAP1相对特异，尽管此前报道Gtr1对磷酸转运蛋白Pho84的功能表达很重要(8).

第一个将这些小GTP酶与TORC1联系起来的证据来自年的屏幕酿酒酵母Dubouloz等人(23)经鉴定，EGO1/3和Gtr2突变株缺乏从雷帕霉素抑制中恢复的能力。观察到EGO-Gtr复合物与液泡膜相关；在雷帕霉素的作用下，液泡由于与自噬小泡融合而大大增大。在从雷帕霉素中恢复的过程中，多余的液泡膜被内吞到液泡中，这一过程称为微自噬；这在EGO-Gtr突变体中没有发生。在EGO突变体中，液泡膜向其他隔室的逆行运输没有受损，这表明这个过程不足以恢复TORC1活性。相反，促进谷氨酸/谷氨酰胺合成或抑制其降解的突变会抑制EGO LOF对雷帕霉素恢复的影响。最近庞贝乳杆菌(127)寻找增强部分TOR1（主要是TORC1）LOF突变生长缺陷的基因，检索到EGO-Gtr复合体的所有四个组分，以及vps34/vps15、囊泡运输所需的许多vps C类基因，以及编码核糖体和线粒体组分的许多基因。至于囊泡流量受损与TORC1 LOF协同作用的机制，温度敏感型vps11或vps18 C类突变体转移到非允许温度时表现出非常显著的（50-90%）和相对选择性的细胞内谷氨酸和/或谷氨酰胺水平下降。综上所述，这些数据表明，EGO-Gtr复合物在其各种作用中，控制膜流量以促进足够的细胞内氨基酸（尤其是Glu/Gln）水平。

rag GTPases和TORC1之间存在直接的物理和功能相互作用，这一发现表明哺乳动物细胞的TORC1免疫沉淀物与rag C共沉淀(94). 这些碎布被显示为异二聚体与内源性和共表达的TORC1结合，显然是通过与猛禽的直接关联。绑定在很大程度上依赖于GTP形式中的rag A/B，如果rag C/D收取GDP费用，则会增强绑定。Kim等人(61)产生shRNA对抗所有132果蝇属小GTP酶并发现果蝇属rag A/B和C/D同源物，以及D-Rheb选择性降低DS6K1[Thr³⁹⁸-P] ●●●●。与rag C一起表达的rag B的组成激活突变体能够在氨基酸缺乏的细胞中恢复S6K1-P，其效价与Rheb相似，而在TSC复合物水平抑制TORC1的应激源继续抑制mTORC1，尽管表达了组成激活的rag B+C复合物。因此，内源性Rheb-GTP的耗竭大大降低了重组rag B+C的刺激作用，充足的重组Rheb-GTP可以独立于rag激活TORC1。显性抑制Rag A/B变异体抑制对氨基酸和胰岛素的反应(61,94). 虽然内源性Rheb-GTP需要活性rag来促进TORC1信号传导，但如果rag被RNAi耗尽，重组过表达Rheb激活mTORC1的能力在很大程度上不受影响。相反，破布即使以活性形式过度表达，也需要Rheb-GTP才能刺激TORC1。抹布在TORC1营养依赖性调节中的特殊作用的证据来自果蝇属; rag异二聚体激活变异体的过度表达在饥饿条件下大大增加了细胞大小，而在补饲状态下几乎没有影响。相反，显性抑制性rag突变体在喂食状态下会减小细胞大小，但在禁食状态下不会减小细胞大小(61).

关于rag在TORC1调节中的作用机制，Sancak等人(94)报告称，将氨基酸重新注入剥夺细胞会将内源性rag的GTP电荷从44%增加到63%，并增加rag与TORC1的结合，后者只有在裂解前向细胞添加交联剂才能证明。免疫细胞化学显示，mTOR在氨基酸分泌细胞中呈弥漫性细胞质，但在氨基酸补充后聚集到富含rab7的囊泡隔室。Rag B的行为类似，但组成活性Rag B[Q99L]与该rab7隔间组成相关，Rheb也是如此。shRNAs对rag A/B、rag C/D或猛禽的耗尽可阻止氨基酸向这些rab7囊泡募集mTOR。Sancak等人(94)提出氨基酸通过促进rag A/B GTP充电，促进rag与猛禽的结合，并将mTORC1招募到含有mTORC1-近端激活物Rheb的（含rab7-的）膜室(图2).

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图2。

rag GTPases在mTORC1氨基酸调节中的可能作用机制。rag GTPases作为一种必需的异二聚体存在。rag A/B伙伴的GTP充电可能依赖于氨基酸的充足性，促进rag异二聚体与mTORC1的结合，并将其转移到富含Rheb的膜室，从而在Rheb被GTP充电时激活mTORC1。基于参考文献中的数据。61和93；详见正文。

一些报告提出了III型PI 3-激酶的作用，该激酶是酿酒酵母vps34，作为TORC1氨基酸调节的信号中间产物(9,81). III型PI 3-激酶vps34及其类似激酶的伴侣vps15在3′-OH基团上专一磷酸化PI，是酿酒酵母在哺乳动物细胞中，hvps34/hvps15异二聚体因其在内胚体运输和分选中的多种作用以及在自噬启动中的要求而被公认(4,68). PI3P主要存在于早期内胚体和多泡内胚体的内囊；富含PI3P的微域作为平台，通过PI3P与含有FYVE和PX域的蛋白质的相互作用构建贩运复合物。将III型PI 3-激酶与mTORC1联系起来的重要证据包括细胞外氨基酸能够调节hvps34脂激酶活性的发现(9)也许通过Ca²⁺-依赖机制(37); 提取细胞外氨基酸可使免疫沉淀hvps34活性降低～50%(9). 此外，哺乳动物细胞中vps34或vps15的缺失会抑制氨基酸刺激的S6K1磷酸化，重组vps34和vps15过度表达会增加S6K1的磷酸化，特别是在存在氨基酸的情况下。二聚体FYVE结构域封存物PI3P本身的过度表达也抑制S6K1磷酸化(81). 此外，可以检测到hvps34与内源性mTOR的一些共沉淀(37). 总之，这些发现支持hvps34通过产生PI3P参与mTORC1激活的结论。然而，需要注意的是，III型PI 3-激酶的基因消除果蝇属对DTORC1信令没有影响(55)我们观察到vps34或vps15的RNAi缺失秀丽线虫没有重述CeTOR或CeRaptor缺乏症的任何表型（参考文献。90; X.Long和J.Avruch，未发表的观察）。然而，通过PI3P的产生，vps34可能只参与脊椎动物或哺乳动物细胞中TORC1的氨基酸信号传递。这种参与可能是作为mTORC1激酶的直接调节器（在体外不明显），或通过促进产生最佳mTORCl激活所需的膜室。然而，也有可能PI 3-激酶的作用更为间接，并通过其对囊泡运输（例如对溶酶体的运输）的作用进行调节，从而提供细胞内氨基酸。

芬德利等人(30)进行了RNAi筛选果蝇属DS6K1过度磷酸化所必需的蛋白激酶，并鉴定了一个Ste20家族成员（MAP4K3），其缺失抑制S6K1和4E-BP磷酸化，其过表达以PI3-激酶依赖但雷帕霉素敏感的方式增加S6K1-P。重组MAP4K3的活性通过氨基酸提取而降低，通过氨基酸恢复而恢复，但对胰岛素或雷帕霉素不敏感。MAP4K3/生殖中心激酶相关蛋白激酶先前被认为参与了TNFa和Wnt3a对淋巴细胞JNK活化的调节(105,106). 这种蛋白激酶的作用部位及其在调节TORC1信号传导中的生理作用仍有待确定。

赠款

本文引用的作者的工作得到了国立卫生研究院DK-17776和CA-73818的支持。

致谢

参考文献