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分子细胞。作者手稿；PMC 2013年8月24日提供。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2012年8月24日；47(4): 535–546.
2012年7月12日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2012.06.09
预防性维修识别码：PMC3693578型
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院389079
PMID：22795129

TBC1D7是mTORC1上游TSC1-TSC2复合物的第三亚单位

克里斯蒂安·迪布尔,1 温弗里德·埃利斯,2,6 苏希特拉·梅农,1,6 魏琴,4,5 贾斯汀·克莱科塔,2 约翰·M·阿萨拉,三，5 彼得·菲南,2 大卫·J·奎亚特科夫斯基,4,5 利昂·O·墨菲,2和布伦丹·D·曼宁1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

总结

结节性硬化复合物（TSC）肿瘤抑制剂形成TSC1-TSC2复合物，其限制细胞生长以应对不良的生长条件。通过其对Rheb的GTPase激活蛋白（GAP）活性，该复合物抑制雷帕霉素（mTOR）复合物1（mTORC1）的机械靶点，后者是细胞生长的关键促进剂。在这里，我们将TBC1D7鉴定为TSC1-TSC2复合物的稳定相关且普遍存在的第三核心亚基，并对其进行了生化表征。我们证明TSC1-TSC2-TBC1D7（TSC-TBC）复合物是感知特定细胞生长条件并具有Rheb-GAP活性的功能复合物。TSC患者样本的序列分析表明待定第7页不太可能代表TSC3。TBC1D7基因敲除减少TSC1和TSC2的结合，导致Rheb-GAP活性降低，但不影响TSC2在溶酶体中的定位。与其他TSC-TBC组分一样，TBC1D7敲除导致mTORC1信号增加，自噬诱导延迟，并在生长不良的条件下促进细胞生长。

引言

雷帕霉素（mTOR）复合物1（mTORC1）的机制靶点是一种蛋白激酶复合物，它通过抑制分解代谢过程（如自噬）和刺激合成代谢过程（包括蛋白质和脂质合成），在促进细胞生长（即细胞大小增加）中发挥关键的进化保守作用(拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年). 由于这种合成代谢过程对能量和营养的大量需求，细胞已经形成了一个精细的信号通路网络，可以感知细胞生长状态并将其传递给mTORC1。两类小G蛋白，Rag和Rheb GTPases，直接位于mTORC1的上游，以控制其对特定生长信号的激活状态。最近的证据表明，Rag蛋白与Ragulator复合，特别介导mTORC1感知氨基酸的能力(Kim等人，2008年;Sancak等人，2010年;Sancak等人，2008年;Zoncu等人，2011年)构成mTORC1激活的基本信号(Hara等人，1998年). 另一方面，Rheb受多种影响mTORC1的刺激物控制，包括生长因子、激素和细胞因子、细胞能量水平和应激(黄和曼宁，2008;拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年). 由于Rheb上游信号网络的扰动，mTORC1在多种疾病环境中受到异常调节，包括遗传肿瘤综合征、大多数散发性癌症、常见神经疾病（如孤独症和阿尔茨海默病）以及代谢疾病（如肥胖和2型糖尿病）(Ehninger和Silva，2011年;拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年;梅农和曼宁，2009年). 因此，对Rheb和mTORC1调控的详细了解将提供对正常生长控制和导致这些不同疾病病理学的分子事件的机制性见解。

TSC1类和TSC2系统是在肿瘤综合征结节性硬化综合征（TSC）和淋巴管平滑肌瘤病（LAM）中突变的肿瘤抑制基因，其基因产物形成一个蛋白复合体，整合Rheb和mTORC1上游的信号。TSC1和TSC2（也称为hamartin和tubin）是与其他蛋白质相似性有限的大型蛋白质，但TSC2 C末端约200个氨基酸的延伸类似于Rap1Gap的GTPase激活蛋白（GAP）结构域。TSC2中的这一结构域充当Rheb的GAP，与TSC1形成复合物可稳定TSC2并增强其GAP活性(Garami等人，2003年;Inoki等人，2003a;Tee等人，2003年;Zhang等人，2003b). 通过刺激Rheb固有的GTPase活性，TSC1-TSC2复合物将Rheb从mTORC1激活的GTP结合态转换为非活性的GDP结合态。有趣的是，大多数调节Rheb和mTORC1的信号都会影响TSC1-TSC2复合物，因此不良生长条件会激活复合物，而生长条件会抑制复合物，从而分别抑制或激活Rheb或mTORC2(黄和曼宁，2008). 例如，许多生长因子和细胞因子通过Akt介导的TSC2抑制磷酸化激活mTORC1(Inoki等人，2002年;Manning等人，2002年;Potter等人，2002年)而能量应激通过AMPK依赖性激活TSC2磷酸化抑制mTORC1，至少部分抑制(Inoki等人，2003b;Shaw等人，2004年). 与这些信号机制一致，TSC1-TSC2复合物的功能丧失导致构成性mTORC1激活，该激活对细胞生长条件的扰动基本不敏感(Jaeschke等人，2002年;Kwiatkowski等人，2002年). 现在很明显，TSC1-TSC2复合物是一个信号通路网络的汇聚点，该信号通路向Rheb和mTORC1传递有关细胞生长条件的信息，以正确控制细胞生长。然而，关于这一关键信号整合节点的分子特征仍有很多需要了解的地方，该节点在人类疾病中通常被错误调控。

TSC1-TSC2复合物被认为具有异二聚体的功能(van Slegtenhorst等人，1998年). 文献中描述了数十种相互作用的蛋白质(郭等，2010;Rosner等人，2008年)这些关联的功能意义尚不清楚。重要的是，在假设驱动或无偏见的实验中，没有发现与TSC1-TSC2复合物结合的蛋白质被描述为复合物的额外亚单位。在这里，我们描述了Tre2-Bub2-Cdc16（TBC）1结构域家族成员7（TBC1D7）的鉴定，以严格搜索与TSC1-TSC2复合物相关的蛋白质。这里介绍的生化特征表明，TBC1D7是TSC1-TSC2复合物的第三个常驻成分，与复合物的其他成员一样，它是通过细胞生长条件对Rheb和mTORC1进行适当调节所必需的。

结果

TBC1D7是TSC1-TSC2复合物的一个稳定关联且普遍存在的结合伙伴

为了更好地理解TSC1-TSC2复合物的分子功能，我们试图鉴定在高化学计量比下与该复合物相互作用的蛋白质。共表达的鞭毛标记TSC1和TSC2从细胞中进行免疫纯化，并处理鞭毛肽洗脱液以使用质谱进行蛋白质鉴定。两次独立纯化中最丰富的蛋白质是一种293氨基酸（~34kDa）蛋白质，命名为TBC1D7(图1A和第1部分). 虽然关于该蛋白的文献很少，但之前的两项研究报告了与TSC1的关系(Nakashima等人，2007年;Sato等人，2010年); 参见讨论）。序列比对搜索显示TBC1D7在多个门中广泛保守(图S1B)具有与TSC1和TSC2直系图基本重叠的保护模式(Serfontein等人，2010年). TBC1D7主要由假定的TBC域组成(图S1C)是所有真核生物基因组中的一种结构。一些蛋白质的TBC结构域对小GTPase Rab家族的特定成员具有GAP活性，这被认为是该结构域家族的保守功能(Frasa等人，2012年). 然而，TBC1D7 TBC域的中心区域与其他TBC域没有很好的对齐，而且重要的是，缺少三分之二的特征基序，这些基序包含对其他TBC蛋白的Rab-GAP活性至关重要的残基(图S1C、D;Frasa等人，2012年).

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内源性TBC1D7与TSC1-TSC2异二聚体紧密而广泛地结合

（A）TSC1-TSC2纯化中鉴定的蛋白质的相对丰度。从HEK-293细胞裂解液中免疫沉淀共表达的Flag-TSC1和-TSC2，并使用LC-MS/MS鉴定3xFlag-肽洗脱液中的胰蛋白酶肽。在两种独立纯化中均鉴定出三种或三种以上肽的蛋白质，但在表达空载体的细胞中的抗Flag免疫沉淀中缺失，列出了。蛋白质的光谱丰度是根据确定的肽数量（光谱计数）和蛋白质的氨基酸长度计算得出的。请参阅图S1A中的支持数据.

（B）内源性TBC1D7、TSC1和TSC2的相互免疫共沉淀。使用指示的抗体（在实验程序中列出）从HeLa细胞裂解物中免疫沉淀内源性蛋白质。请参阅图S1E中的支持数据.

（C）小鼠组织中TBC1D7与TSC1和TSC2的共免疫沉淀。TSC1和TSC2从所示小鼠组织的裂解液中免疫沉淀。WAT（白色脂肪组织）。

（D）TBC1D7的两个细胞池之一以密度梯度与TSC1和TSC2共分馏。HeLa细胞裂解液在蔗糖梯度上超速离心，收集十个密度增加的连续组分。使用ImageJ软件量化免疫印迹条带强度，并以每种蛋白质所有组分的总条带强度的百分比表示。

（E）TBC1D7和TSC1与来自高密度组分的TSC2共同免疫沉淀。TSC2是从（D）的指示组合组分中免疫沉淀的。

（F）TBC1D7-结合TSC1和TSC2的化学计量比。从HeLa细胞裂解液中免疫沉淀内源性TBC1D7（或对照IgG），并使用LC-MS/MS检测胰蛋白酶肽。使用光谱丰度和平均总离子流（TIC）这两种已建立的定量方法估计TBC1D7-免疫沉淀中TSC1和TSC2的比率。这两种方法产生的比率与示意图摘要中所示的相同。

（G）TBC1D7与TSC1-TSC2复合物紧密结合。用缺乏NaCl和SDS的缓冲液溶解HeLa细胞。从该裂解液中分离出单个TSC1免疫沉淀物，并用含有指定浓度NaCl或SDS的裂解缓冲液洗涤。

TBC1D7与TSC1-TSC2复合物的内源性相互作用在相互免疫沉淀中得到证实，该沉淀中有六种针对TSC1或TSC2的独特抗体，以及一种针对TBC1D6的抗体(图1B)其特异性通过siRNA介导的TBC1D7的敲除得到证实(图S1E). TBC1D7存在于TSC1和TSC2中，但不控制IgG、来自不同系列小鼠组织的免疫沉淀，包括代谢组织和TSC疾病中最常见的组织(图1C)表明TBC1D7与TSC蛋白的表达和相互作用是普遍存在的。为了确定与TSC1-TSC2复合物相关的总细胞TBC1D7的比例，细胞裂解物在蔗糖密度梯度上进行分级。有趣的是，TBC1D7比TSC1（~130 kDa）和TSC2（~200 kDa(图1D). 重要的是，与TSC1一样，TBC1D7与TSC2仅从这些密度较高的组分中共同免疫沉淀，这表明它们的共分离反映了它们的关联(图1E). 从多个这样的实验中，似乎40-50%的总细胞TBC1D7与TSC1-TSC2复合物有关。我们还惊讶地发现，在中等密度组分中，TSC2与TSC1的化学计量水平无关(图1D、E)表明TSC2和TBC1D7在细胞中均以无TSC1和相关实体的形式存在。TBC1D7与TSC1和TSC2的共分馏表明，它主要与TSC1-TSC2复合物结合，而不是单独与任一蛋白结合。TSC1和TSC2被认为以1:1的比例相互作用(Zhang等人，2003a)并在其表达的所有生物体中发挥异二聚体的作用(高和潘，2001;Plank等人，1998年;波特等人，2001年;van Slegtenhorst等人，1998年). 事实上，基于无标签定量质谱分析来估计与内源性TBC1D7共同免疫沉淀的TSC1和TSC2的相对化学计量比，得到了接近1:1的TSC1与TSC2比率(图1F)，进一步证明TBC1D7主要与TSC1-TSC2复合物结合。

TSC1和TSC2彼此紧密结合，因为纯化的复合物对各种洗涤剂、高盐浓度和pH极限具有抗性(高和潘，2001;Nellist等人，1999年;普朗克等人，1998年;波特等人，2001年;van Slegtenhorst等人，1998年)而在这种情况下，更松散结合的蛋白质的结合很容易被破坏(Huang等人，2008年). 为了评估TSC1-TSC2-TBC1D7相互作用的强度，用TSC1抗体免疫沉淀内源性复合物，然后用含有增加浓度NaCl或SDS的缓冲液广泛清洗(图1G). 与TSC2一样，TBC1D7与复合物的结合被发现对含有10倍生理盐浓度的洗涤液具有抵抗力，而较高浓度的十二烷基硫酸钠可以将TBC1D7.从复合物中分离出来。总的来说，这些发现将TBC1D7确定为TSC1-TSC2异二聚体的强相关、普遍存在的结合伙伴，将其与先前表征的TSC1-或TSC2-相关蛋白区分开来。

TBC1D7与TSC1-TSC2复合物内的TSC1结合并被TSC1稳定

在确定TBC1D7与TSC1-TSC2复合物具有强烈且普遍的相互作用后，我们试图确定这三种蛋白质在复合物中的相互依赖性。通过相互免疫沉淀，我们发现所有三种蛋白在野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中都相关，但TBC1D7和TSC2在母鼠源性成纤维细胞中没有相互作用Tsc1型−/−MEF公司(图2A). 另一方面，在没有TSC2的情况下，TBC1D7和TSC1可以结合，如Tsc2型−/−MEF，尽管与野生型细胞相比，它们的关联性降低(图2A). 为了在等基因条件下确认这些结果，我们在siRNA介导的TSC1或TSC2敲除后，从HeLa细胞进行了相同的免疫沉淀。同样，TBC1D7在没有TSC2的情况下绑定到TSC1，但在没有TSC1的情况下不绑定到TSC2(图2B)，确认TBC1D7通过TSC1与复合物结合。确定TBC1D7是否分离为高密度组分(图1D)反映了通过TSC1与TSC1-TSC2异二聚体结合，我们在siRNA介导的三种复合组分敲除后重复了蔗糖密度分级。事实上，TSC1的敲除对剩余TBC1D7的分馏产生了显著影响，其完全转变为低密度组分(图2C). TSC2击倒也消除了高密度组分中的TBC1D7，增加了低密度组分的TBC1D水平。然而，TSC2损失后，在中等密度组分中也发现更多TBC1D7，这与在没有TSC2的情况下其仍然结合TSC1的能力一致。在具有稳定shRNA介导的TBC1D7、TSC1和TSC2敲除的细胞系中获得了几乎相同的结果(图S2A). 这些数据表明，TBC1D7仅由于与TSC1-TSC2复合物的结合而存在于高密度组分中。值得注意的是，虽然TBC1D7可以在没有TSC2的情况下与TSC1结合，但我们的集体数据表明，缺乏TSC2的TBC1D7-TSC1复合物在野生型细胞中很少见或不存在，并且TBC1D七主要与TSC1-TSC2复合物结合。

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TBC1D7与TSC1-TSC2复合物内的TSC1结合并被TSC1稳定

（A）MEF中TBC1D7与TSC2的TSC1依赖关联。使用母鼠源野生型（+/+）的裂解物和其中一种进行TBC1D7、TSC1、TSC2或对照IgG（C）抗体的免疫沉淀Tsc1−/−（左）或Tsc2−/−（右）MEF。

（B）HeLa细胞中TBC1D7与TSC2的TSC1依赖性结合。与对照组（siC）相比，使用具有siRNA-介导的TSC1或TSC2敲除的HeLa细胞裂解液进行（A）中的免疫沉淀。

（C）TBC1D7的高密度分馏取决于TSC1和TSC2。在蔗糖梯度上对具有siRNA介导的敲低TBC1D7、TSC1和TSC2的HeLa细胞的裂解物进行超离心，并收集密度增加的10个连续级分。使用ImageJ软件量化TBC1D7免疫印迹条带强度，并以每种蛋白质所有组分的总条带强度的百分比表示。请参阅图S2A中的支持数据.

（D）TSC1的损失会降低TBC1D7和TSC2的稳定性。将具有siRNA-介导的TSC1敲除的HeLa细胞与100μM环己酰胺（chx）孵育指定时间。免疫印迹带强度以（C）表示，并以未处理（0 h）样品的百分比表示。

（E）TBC1D7的“空闲”池不稳定。将HeLa细胞与环己酰胺或水（载体）孵育3 h，并按（C）所示进行分馏。两种治疗的组分3和7也在相同的免疫印迹上进行比较（右）。

与之前的调查结果一致(Benvenuto等人，2000年;Kwiatkowski等人，2002年)，这些实验中TSC1的丢失导致TSC2水平的降低(图2A、B). 有趣的是，与TSC2一样，TSC1缺失后TBC1D7蛋白水平降低(图2A-C)在不同的细胞培养条件下，TSC2和TBC1D7的减少是无法区分的(图S2B). TSC2的瞬间击倒对TBC1D7产生相反的影响，适度增加其水平(图2B和S2B型). 为了阐明TSC1缺乏对TBC1D7和TSC2的影响，我们监测了它们在环己酰胺处理一段时间后TSC1敲除细胞中的稳定性，以阻止新的蛋白质合成(图2D). 在对照细胞中，TSC2水平随时间保持相对稳定，而TBC1D7则更不稳定。然而，在TSC1敲除细胞中，TBC1D7和TSC2的降解速度和程度都显著增加，表明TSC1可以稳定这两种蛋白质。考虑到大约50%的TBC1D7快速降解，即使存在TSC1，而其余的更稳定，我们假设TBC1D6的两个池的稳定性不同。为了验证这一点，我们比较了载体处理细胞和环己酰胺处理细胞中这两个池中TBC1D7的水平(图2E). 事实上，在3小时的处理过程中，只有代表自由池的低密度组分中的TBC1D7降解。这与导致TBC1D7稳定性下降的TSC1损失相一致，并表明细胞中存在的TBC1D7free pool与紧密结合在TSC1-TSC2复合体上的自由池相比，迅速翻转。

敲除TBC1D7减少TSC1和TSC2的结合，而不影响TSC2的溶酶体定位

为了确定TBC1D7作为TSC1-TSC2复合物的一种成分是否影响TSC1和TSC2的结合，这些蛋白质是从TBC1D6被敲除的细胞中免疫沉淀出来的(图3A). 在没有TBC1D7的情况下，仍然检测到TSC1和TSC2之间的复合物，但观察到它们之间的关联性有可复制的降低(图3A). 正如预期的那样，在蔗糖密度分数中(图3B、C)并且稳定(图S3A、B)TSC2的敲除导致TSC1完全转变为中等密度组分(图3B和S3A系列)，和TSC1敲低对TSC2的分馏具有相同的影响(图3C和第三方银行). 与免疫沉淀实验中观察到的TSC1和TSC2的部分分离相一致，TBC1D7的瞬时和稳定敲除都导致一些TSC1的转移(图3B和第3页)和TSC2(图3C和S3B型)到含有非复合蛋白质的中等密度组分。作为对照，这些敲除均未影响mTORC2组分Rictor的分馏模式(图S3C)，与TSC1-TSC2复合物弱相互作用(Huang等人，2008年). 这些数据进一步证明TBC1D7代表TSC1-TSC2复合物的第三个核心亚单位。

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TBC1D7的敲除导致TSC1和TSC2的结合减少，而不影响TSC2的定位

（A）TBC1D7的敲除导致TSC1和TSC2的共同免疫沉淀减少。与对照组（siC）相比，使用具有siRNA-介导的TBC1D7敲除的HeLa细胞裂解物进行TSC1、TSC2或对照IgG（C）抗体的免疫沉淀。

（B、C）TBC1D7的敲除改变了TSC1和TSC2的分馏模式。用siRNA-介导的TBC1D7、TSC1或TSC2敲除的HeLa细胞裂解液在蔗糖梯度上超速离心，收集十个密度增加的连续组分。使用ImageJ软件对TSC1（B）和TSC2（C）的免疫印迹带强度进行量化，并将其绘制为所有组分的总带强度的百分比。请参阅图S3A–C中的支持数据.

（D）内源性TSC2的定位。与对照组（siC）相比，siRNA-介导TSC2敲除的HeLa细胞被血清饥饿16 h，并用TSC2抗体进行免疫荧光标记。单个单元格的放大视图如下所示。

（E）TBC1D7和TSC1的敲除对TSC2的定位没有明显影响，包括其与LAMP2在溶酶体的共同定位。制备具有所示siRNA-介导敲除的HeLa细胞，如（D）所示，但同时免疫标记TSC2（红色）和LAMP2（绿色）。在合并的图像中，黄色和橙色区域表示共同定位，插入框显示垂直于从z堆栈构建的主图像的平面（箭头表示插入中显示的单元格）。相应的免疫印迹和单个细胞的放大视图显示在右侧。请参阅图S3D、E中的支持数据.

为了开始了解TBC1D7在TSC1-TSC2-TBC1D6（TSC-TBC）复合体中的作用，我们测定了其对TSC2亚细胞定位的影响。虽然一些研究报告了TSC2通过免疫荧光的各种定位模式，但大多数研究都是针对过度表达的蛋白质进行的，或者未能验证所用抗体的特异性。我们已经测试了大多数商用TSC2抗体的特定定位模式，这些定位模式在内源性TSC2表达下调后被消除。一种单一的高度特异性TSC2抗体在整个细胞中表现出点状定位模式，在核周区域具有更集中的模式(图3D). 到目前为止，我们还无法用同样的方法识别揭示内源性TSC1或TBC1D7特异定位模式的抗体。通过与膜细胞隔室的多个标记物共同定位研究，我们发现TSC2定位集中的核周区域部分代表晚期内体或溶酶体，因为存在大量重叠（约50%，图S3D)血清饥饿条件下LAMP2染色(图3E，插入垂直图像）。敲除TBC1D7对TSC2定位没有显著影响(图3E和S3D系列). 令人惊讶的是，TSC1敲低也是如此，尽管TSC2的总体水平降低了。重要的是，我们发现TSC2定位于该隔室并不反映其在溶酶体中的降解，因为溶酶体抑制剂在存在或不存在TSC1的情况下不会增加TSC2的水平(图S3E). 值得注意的是，内源性TSC2与LAMP2的部分共定位与mTOR相似(Sancak等人，2010年;Sancak等人，2008年;Zoncu等人，2011年; 见下文）。

待定1D7似乎不是第三个TSC基因

生殖系突变TSC1类或TSC2系统破坏TSC1-TSC2复合物或使其功能失活的基因会导致结节性硬化复合物（TSC），这是一种常染色体显性肿瘤综合征，其特征是良性肿瘤（归类为错构瘤）的广泛发生，以及各种神经系统表现的高发率，包括癫痫和自闭症谱系障碍(Crino等人，2006年). 虽然基因突变TSC1类或TSC2系统在高达85%的TSC病例中，大约15%的临床诊断为TSC的患者在这两个基因中没有明显的突变，这导致推测可能存在第三个TSC基因（即TSC3）(Camposano等人，2009年;Kwiatkowski，2005年). 我们考虑了作为TSC1-TSC2复合物的第三个常驻成分TBC1D7在该亚群TSC患者中可能发生突变的可能性。因此，我们对该基因的七个编码外显子进行了测序待定1D7轨迹(图S4A)来自12名未发现突变的TSC患者TSC1类或TSC2系统经过广泛的遗传分析(秦等，2010). 然而，除了已知的单核苷酸多态性（SNPs）外，我们在这些基因的外显子2到8中没有发现点突变待定1D7基因，表明这种突变在TSC患者群体的生殖系中没有明显的发生频率。

TSC1-TSC2-TBC1D7（TSC-TBC）复合体接收生长信号，是Rheb的功能GAP

由于TSC1-TSC2复合物唯一确定的作用是调节Rheb和mTORC1，因此我们确定TSC-TBC复合物是否为该功能单位。TSC1-TSC2复合物作为细胞中Rheb的GAP的能力受上游通路控制，上游通路导致TSC2上不同位点的磷酸化被抑制或激活。为了确定TSC-TBC复合物是否以这种方式控制，在复合物的TBC1D7与TSC1免疫沉淀中评估TSC2的调节磷酸化。有趣的是，胰岛素刺激的Akt介导的（S939和T1462；图4A)二甲双胍刺激，AMPK介导（S1387；图4B)在TBC1D7和TSC1免疫沉淀中发现TSC2磷酸化水平相似。因此，主要是TSC-TBC复合物受Rheb上游这些特征明确的途径调节。

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TSC-TBC复合体对生长线索作出反应，并具有Rheb-GAP活性

（A）TBC1D7与Akt在胰岛素作用下磷酸化的TSC2相关。在用TBC1D7、TSC1或对照IgG（C）抗体进行裂解和免疫沉淀（IP）之前，用胰岛素（100nM）刺激血清饥饿（18小时）的HeLa细胞10分钟。

（B）TBC1D7与AMPK在能量应激反应中磷酸化的TSC2相关。如（A）所示，在裂解和IP之前，在含有或不含有苯乙双胍（1mM）的新鲜血清（10%）存在下培养MEFs 2小时。

（C）TBC1D7与具有Rheb-GAP活性的TSC2相关。具有稳定的shRNA-介导TSC2（shTSC2）或萤火虫荧光素酶对照（shLUC）敲除的HeLa细胞在裂解前血清饥饿6小时，IP如（a）所示。使用重组GST或预先负载GTP[α-32P] ●●●●。在重复实验中，通过薄层色谱（TLC）分离Rheb-bound GTP和GDP，并使用磷化成像仪进行定量。GDP平均水平用GTP加上GDP（%GDP）的百分比表示，并用误差条表示平均值的标准误差。

（D）TBC1D7的敲除导致TSC2的Rheb-GAP活性净下降。除了使用具有稳定shRNA-介导的TBC1D7敲除（shTBC7）或GFP对照（shGFP）的HeLa细胞，以及两倍于细胞数量的细胞外，Rheb-GAP分析均按（C）中所示进行、分析和绘制。请参阅图S4B中的支持数据.

TSC2-GAP结构域对于TSC1-TSC2复合物抑制Rheb至关重要(Inoki等人，2003a;Tee等人，2003年;Zhang等人，2003b). 为了确定TSC-TBC复合物是否具有Rheb-GAP的功能，我们用TBC1D7或TSC1抗体免疫纯化内源性复合物，并对重组、纯化的Rheb进行GAP分析(图4C). TBC1D7免疫沉淀物的Rheb-GAP活性与TSC1免疫沉淀剂相当，尤其是考虑到TSC1免疫沉淀中存在更多TSC2。重要的是，这种GAP活性依赖于TSC2，因为来自稳定敲除TSC2的细胞的内源性复合物未能刺激Rheb的GTPase活性，使其高于对照IgG观察到的固有水平。因此，TSC1-TSC2复合物的大部分（如果不是全部）Rheb-GAP活性与TBC1D7有关。为了确定TBC1D7敲除是否影响复合物的生物化学活性，我们用免疫沉淀法从具有对照或TBC1D6敲除的细胞中提取内源性复合物，并测量Rheb-GAP活性。有趣的是，在TBC1D7的shRNA敲低稳定的细胞中，这种活性部分降低，这在使用TSC1和TSC2免疫沉淀的Rheb-GAP分析中很明显(图4D). TBC1D7敲除对复合物GAP活性的影响不是由于Akt增加TSC2的抑制性磷酸化(图S4B). 事实上，TBC1D7敲除导致TSC2-T1462和Akt-S473的磷酸化降低，以响应胰岛素，这让人想起TSC1或TSC2缺失对mTORC2和Akt信号的影响（在黄和曼宁，2009年). TBC1D7缺失后内源性GAP活性的降低与上述TSC1和TSC2的相关性降低一致(图3A-C和S3A、B)在这里再次检测到(图4D免疫印迹）。尽管在对照和TBC1D7敲除试验中存在相同水平的TSC2，但TSC2免疫沉淀物中的GAP活性也明显降低，这反映了TSC2对Rheb的完整GAP活性与TSC1形成复合物的重要性(Tee等人，2003年).

TBC1D7缺失导致生长因子依赖性激活mTORC1信号

上述集体研究结果表明，TBC1D7是功能性Rheb-GAP复合体的核心成分，对已知调节Rheb的上游信号作出反应，这提出了一种可能性，即与复合体的其他成员一样，TBC1D可能需要通过特定的生长线索对mTORC1信号进行适当调节。特别是，TSC1和TSC2需要在生长因子退出时抑制mTORC1信号，其丢失导致在缺乏生长因子的情况下持续mTORC2信号(Jaeschke等人，2002年;Kwiatkowski等人，2002年). 事实上，TBC1D7稳定敲除的细胞在血清饥饿条件下表现出生长因子依赖性的mTORC1信号激活，这可以通过其直接下游靶点S6K和S6K底物S6的磷酸化增加检测到，这两种底物都对mTORCl抑制剂雷帕霉素敏感(图5A). TBC1D7敲低也增加了4E-BP1的磷酸化，4E-BP1是mTORC1的另一个直接靶点，通过磷酸特异性抗体和电泳迁移率的变化来评分，正如其他人所报道的，这些效应对雷帕霉素仅部分敏感(Choo等人，2008年). 在各种小鼠和人类细胞系中短暂敲低TBC1D7类似地导致生长因子非依赖性mTORC1信号增加(图5B). 当直接比较敲除TSC-TBC复合物的三个亚单位的相对效果时，观察到mTORC1信号传导的分级效应，敲除TBC1D7产生适度增加，支架亚单位TSC1产生中度增加，Rheb-GAP TSC2产生最大增加(图5B，希拉）。重要的是，为了刺激S6K磷酸化，敲低TBC1D7与敲低TSC1或TSC2不是相加的，这与TBC1D7缺失通过对三聚体复合物的影响对mTORC1信号传导的影响一致(图5C). 为了支持TSC1-TSC2复合物通过充当Rheb的GAP抑制mTORC1的既定机制，靶向Rheb1的siRNA抑制了TBC1D7敲除对mTORC2信号的刺激，Rheb2（也称为RhebL1；图5D).

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TBC1D7在不良生长条件下负调控mTORC1信号

（A）稳定敲除TBC1D7的细胞中生长因子依赖性mTORC1信号。对具有稳定shRNA-介导的TBC1D7敲除（shTBC7）或GFP对照（shGFP）的HeLa细胞进行16小时的血清饥饿处理，如有必要，在最后15分钟用雷帕霉素（20 nM）处理。

（B）生长因子依赖性激活多种细胞系中的mTORC1信号，并敲除TBC1D7。与对照组（siC）相比，具有siRNA-介导的人（293E，RPE1，HeLa）或小鼠（MEF）TBC1D7敲低的指示细胞系在裂解前血清饥饿16小时。

（C）TBC1D7与TSC1或TSC2的双重敲除对mTORC1信号没有加性影响。HeLa细胞与所示的siRNAs共转染，并按（B）处理。

（D）TBC1D7缺陷细胞中的mTORC1信号仍然依赖Rheb。HeLa细胞与所示的siRNAs共转染，并按（B）处理。

（E）TBC1D7缺陷细胞中的mTORC1信号对生长因子和葡萄糖提取具有抵抗力，但对氨基酸提取没有抵抗力。MEF按（B）中的方法处理，但在血清饥饿后，指示的样品或者再饥饿3小时所有氨基酸或葡萄糖。显示相同的磷酸S6K印迹的光照和暗照。

（F）mTOR和LAMP2的共定标不受TBC1D7损失的影响。HeLa细胞被血清饥饿16小时，并用mTOR和LAMP2抗体进行免疫荧光标记。在mTOR（红色）和LAMP2（绿色）的合并图像中，共同定位用黄色和橙色像素表示。每个合并图像中的插图显示与从z堆栈构造的主图像垂直的平面。箭头指示这些插图中显示的单元格。

（G）TBC1D7缺陷细胞的自噬诱导延迟。将具有稳定shRNA-介导TBC1D7敲除（shTBC7）或GFP作为对照（shGFP）的HeLa细胞生长在完整的生长培养基中，然后在指定的持续时间（min）内用或不用透析FBS（dFBS）饥饿所有氨基酸（-aa）。使用ImageJ软件量化LC3B-II/I比值，并将其归一化为20分钟shGFP样本。

（H）敲除TBC1D7会增加细胞大小。用对照（siC）或TBC1D7（siTBC7）siRNAs转染HeLa细胞，转染后24小时，血清饥饿48小时。使用Z2-Coulter计数器测量细胞群中细胞直径（μm）的分布。第页小于0.0001，用于比较siC和siTBC7大小分布（平均5次重复，每个重复测量28400个细胞）。请参阅图S5中的支持数据.

除生长因子外，mTORC1的活性还取决于营养物质的存在，如葡萄糖和氨基酸，这些营养物质通过mTORC2上游的TSC1-TSC2复合依赖和独立途径进行检测。与之前的研究结果一致，mTORC1的氨基酸感应在很大程度上独立于TSC1-TSC2复合物(Kim等人，2008年;Sancak等人，2010年;Sancak等人，2008年;Smith等人，2005年)，氨基酸退出消除了对照和TBC1D7敲低MEFs中的mTORC1信号传导(图5E). 虽然撤除葡萄糖同样会降低mTORC1信号，但相对于对照组，TBC1D7敲除组中S6K磷酸化水平升高。这些结果与通过TSC-TBC复合物依赖性和非依赖性机制作用的葡萄糖戒断和能量应激一致(Gwinn等人，2008年;Inoki等人，2003b;Kalender等人，2010年;Shaw等人，2004年). 这些数据表明，TBC1D7不影响mTORC1的氨基酸感应，这涉及Rag GTPases将mTORCl招募到含有LAMP2的小室中，以供Rheb激活(Kim等人，2008年;Sancak等人，2010年;Sancak等人，2008年;Zoncu等人，2011年). TBC1D7敲除后，mTOR与LAMP2共定位缺乏变化，进一步证明了TBC1D6作用于Rheb上游而非Rag GTPases(图5F). 因此，与TSC1和TSC2一样，TBC1D7参与mTORC1对生长因子和葡萄糖的正确传感，但不参与氨基酸的传感。

为了确定TBC1D7对mTORC1信号转导的影响是否影响已知的由mTORC2调节的细胞过程，我们检测了自噬和细胞大小，它们已知受TSC1-TSC2复合物功能丧失的影响(高和潘，2001;Menon等人，2012年;Parkhitko等人，2011年;波特等人，2001年;Tapon等人，2001年). 虽然长时间（>2 h）饥饿氨基酸会强烈抑制TBC1D7敲除细胞中的mTORC1信号，但在这些细胞中，尤其是在存在透析血清的情况下，氨基酸提取后的mTORC抑制明显延迟(图5G). 这与之前报告的结果一致Tsc2型−/−MEF公司(Smith等人，2005年). 为了检测氨基酸戒断诱导的自噬的开始，我们检测了对照组与TBC1D7敲除细胞中LC3B-I转化为其脂化形式（LC3B-II）的情况。正如mTORC1信号延迟抑制所预测的那样，TBC1D7敲除细胞在氨基酸退出的一段时间内表现出自噬启动的延迟(图5G). 最后，我们发现在TBC1D7敲除后，生长因子依赖性mTORC1信号的激活(图5A–E)与细胞生长增加相一致(图5H)并且稳定(图S5A)TBC1D7的敲除导致细胞大小显著增加。总的来说，这些数据支持一个模型，其中TBC1D7作为TSC-TBC复合体的核心成分，调节Rheb和mTORC1信号，以响应特定细胞生长条件的改变，从而控制下游细胞过程(图6).

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TSC-TBC综合体模型

Rag GTPases通过Ragulator和Rheb通过TSC-TBC复合物（或Rhebulator）对mTORC1的综合调控示意图。详见正文。

讨论

我们的生物化学研究表明，TBC1D7是TSC1-TSC2复合物的第三个功能亚单位，它与几十个以前确定但特征较差的复合物结合伙伴相区别(Rosner等人，2008年). 之前的两项独立研究也报道了内源性TBC1D7和TSC1之间的相互作用(Nakashima等人，2007年;Sato等人，2010年)，但这些研究没有将该蛋白识别为TSC1-TSC2复合物的成分。在第一项研究中，发现TBC1D7通过与TSC1的相互作用与复合物共免疫沉淀(Nakashima等人，2007年)，我们在我们的表征中证实了这一点。然而，TBC1D7过表达实验得出结论，这种相互作用抑制TSC1-TSC2复合物，并通过促进TSC1的泛素化激活mTORC1。与这些发现相反，我们证明TBC1D7的缺失部分破坏了TSC1和TSC2之间的联系，导致Rheb-GAP活性降低。鉴于我们的生化和细胞生物学数据表明，内源性TSC-TBC复合体是负向调节Rheb和mTORC1的功能单位，这一单核亚单位的过度表达可能会破坏化学计量复合体及其下游功能，这可能解释了另一项研究的结论。我们的数据还表明，TBC1D7与复合物的结合不受控制复合物活性的已知细胞生长条件变化的影响，这与TBC1D6是复合物的组成部分而非瞬时调节器一致。第二项研究发现TBC1D7被TSC1稳定，我们对此进行了确认和扩展，以证明细胞中存在不稳定的TBC1D7free pool。这些研究人员认为，在肺癌细胞中，TBC1D7-TSC1复合物独立于mTORC1促进细胞增殖(Sato等人，2010年). 虽然我们发现，当细胞中没有TSC2时，这种复合物可以存在，但我们对内源性TSC-TBC复合物的生化实验表明，TBC1D7和TSC1之间没有TSC2的复合物在细胞和组织中很少或不存在。最后，虽然这两项研究的作者都提出这种联系可能是细胞和组织特异性的，但我们证明了内源性TSC-TBC复合物的广泛组织分布，并且尚未确定没有这种复合物的哺乳动物环境。这一发现与其下游靶点Rheb和mTORC1的普遍性质一致。

TBC1D7的分子功能尚不清楚，但可能取决于其TBC结构域，该结构域跨越了这个小蛋白的近三分之二。其他蛋白质中的TBC结构域对特定Rab家族成员具有GAP活性，这表明TBC1D7的功能也与一个小G蛋白有关。重要的是，TBC1D7属于“非传统”TBC结构域家族成员的一个亚组，缺乏三分之二的保守基序，而在经典TBC结构区中，保守基序对GAP活性至关重要(Frasa等人，2012年). 非传统的TBC结构域通常缺乏已知靶点，有些结构域被描述为在保持与其他小G蛋白结合能力的同时缺乏Rab-GAP活性(Frittoli等人，2008年;Martinu等人，2004年). 令人惊讶的是，在TBC蛋白靶点的高通量筛选中，发现重组TBC1D7具有特异性在体外针对Rab17的GAP活动，与其他40多只Rab相比(Yoshimura等人，2007年). 这两种蛋白的过度表达也会影响RPE1细胞中初级纤毛的形成。然而，我们没有发现使用相同的细胞系敲除TBC1D7对纤毛形成或长度的显著影响（数据未显示），并且特定的Rab17同源序列似乎在节肢动物中不保守，它们表达明确的TBC1D7TSC1和TSC2同源序列。需要进一步研究以确定TBC1D7是否对Rab或其他小G蛋白家族成员具有生理相关的GAP活性或与之结合。此外，重要的是确定此类活动是否因其与TSC1和TSC2的复合形成而改变。

我们的发现进一步证实并扩展了营养素和生长因子调节mTORC1的现有模型(图6;拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年). TSC-TBC复合物三种成分中任何一种的缺失都会导致mTORC1信号的持续激活，尽管在不同程度上，是在生长因子退出后，这是由GTP-结合的Rheb水平升高所驱动的。然而，mTORC1信号对葡萄糖饥饿仍然部分敏感，这与能量应激产生的其他调节机制的存在一致(Gwinn等人，2008年;Kalender等人，2010年). 虽然我们在缺乏TBC1D7的细胞中检测到mTORC1对氨基酸提取的抑制延迟，但氨基酸仍然是mTORC1-signaling必不可少的。这种延迟抑制可能反映了Rheb-GTP水平升高对维持mTORC1活性的异常刺激作用，如Rheb在细胞中过度表达时所见（综述见黄和曼宁，2008). 虽然氨基酸传感机制尚未完全确定，但氨基酸通过刺激mTORC1募集到溶酶体表面来激活mTORC1，其方式依赖于Rag GTP酶和被称为Raulator的支架复合物(Kim等人，2008年;Sancak等人，2010年;Sancak等人，2008年;Zoncu等人，2011年). mTORC1向溶酶体的募集不足以激活它，但据信会使激酶复合物在该位置与Rheb接触，当GTP结合时，Rheb会有效刺激mTORC1的激活(Sancak等人，2007年). 重要的是，我们发现控制Rheb-GTP水平的大量细胞TSC2也定位于溶酶体。因此，这两组GTPase，Rags和Rheb，以及它们的调控复合物Ragulator和TSC-TBC复合物（或Rhebulator），在空间上可以整合不同的信号来正确地启动或关闭mTORC1活性(图6).

进一步描述TBC1D7在TSC-TBC复合体中的功能将为Rheb和mTORC1的调控提供分子见解，并有助于表征该关键信号整合节点的假定mTORC1-依赖功能。尽管迄今为止，我们尚未在TSC患者TBC1D7编码区发现种系点突变，但作为TSC-TBC复合物的核心亚单位，其分子功能在TSC和LAM疾病中都会受到异常影响，其中复合物的其他成分发生突变。最后，考虑到控制TSC-TBC复合物的上游调控网络经常受到环境或遗传事件的干扰，这种复合物的调控不当也可能是多种人类疾病的病理特征的基础，包括其他肿瘤综合征、散发性癌症、代谢性疾病、，和神经系统疾病(Ehninger和Silva，2011年;拉普兰特和萨巴蒂尼，2012年;梅农和曼宁，2009年).

实验程序

细胞培养、RNAi和细胞大小测量

除非另有说明，否则细胞在含有10%胎牛血清（FBS；Sigma）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中生长。Tsc1型−/−和Tsc2型−/−MEF及其母鼠衍生的野生型对应物如前所述(Kwiatkowski等人，2002年;Zhang等人，2003a). 对于siRNA敲除，细胞转染20 nM ON-TARGETplus siRNA池（ThermoScientific）和2.5μL（每ml培养基）RNAiMAX Lipofectamine（LifeTechnologies），除了图5D其中，根据制造商的说明，在40 nM的条件下使用siRNAs，在3.5μL（每ml培养基）的条件下，使用RNAiMAX Lipofectamine。除非另有说明，否则在转染后72小时收集细胞。TSC2 shRNA结构如前所述(Huang等人，2008年). 对于细胞大小分布，新鲜胰蛋白酶化细胞在等渗缓冲液中稀释，并使用Z2 Coulter计数器（Beckman）进行分析。

细胞和组织溶解、免疫沉淀和蔗糖密度梯度分级

除非另有说明，否则细胞和组织在NP-40裂解缓冲液（40 mM HEPES，pH 7.4，120 mM NaCl，1 mM EDTA，1%NP-40[Igepal CA-630]，5%甘油，10 mM焦磷酸钠，10mM甘油2-磷酸，50 mM NaF，0.5 mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂（Sigma））中进行裂解/均质。如前所述，从HEK-293细胞中免疫纯化标记TSC1-TSC2复合物(Huang等人，2009年)但使用3xFlag肽（Sigma）在缺乏洗涤剂的裂解缓冲液中进行洗脱。处理3xFlag-肽洗脱液进行MS/MS分析，详见补充材料用于这些研究的TBC1D7兔多克隆抗体由Covance使用肽CKVGFRGVEEKKSLEI生成。用于免疫沉淀的抗体图1B：控制IgG（细胞信号技术（CST）；TSC1#1（CST#4906）、TSC1#2（生命科技（LT）#37-0400）、TSC1#3（圣克鲁斯生物科技（SCB）#SC-12082）、TSC2#1（CAST#3612）、TSC2#2（SCB#SC-892）、TSC#3（SCB#SC-893）。TSC1（LT#37-0400）和TSC2（LT#37-0500）抗体用于除内源性GAP分析外的所有其他免疫沉淀（见下文）。用于免疫印迹的抗体：TSC1（CST#6935）、TSC2（CST#4308）、Rictor（Bethyl Laboratories）和所有其他抗体均来自CST。对于密度梯度，使用溶解在不含甘油的NP-40裂解缓冲液中的蔗糖在5 ml超离心管中形成15%（0.5 ml）、20%（1 ml）、25%（1 ml。将来自接近汇合的10cm平板的细胞在700μl缺乏甘油的NP-40裂解缓冲液中裂解，并将0.5ml裂解物在4℃下以175000 x g的梯度离心16-17小时。从梯度顶部依次取出10个400ml级分。

免疫荧光显微镜

将贴在玻璃盖玻片上的HeLa细胞进行血清饥饿16–18小时，在PBS中的4%多聚甲醛中固定15分钟，在PBS中的0.2%Triton X-100中渗透10分钟，用PBS（Licor Biosciences）中1:1稀释的Odyssey封闭缓冲液封闭1小时，在4℃下与一级抗体（在封闭缓冲液中）孵育过夜，二次抗体在室温下持续1h。一级抗体为LAMP2（Abcam#ab25631，1:100）、TSC2（CST#4301，1:1000）和mTOR（CST#2983，1:100）。二级抗体为抗小鼠Alexa488（分子探针，1:1000）和抗兔Cy3（Jackson ImmunoResearch，1:100）。使用带有Axiovision软件的蔡司Axiotome荧光显微镜采集伪共聚焦图像（约0.3μm平面），并使用Axiotume特征。垂直图像（代表单个平面）由十个相邻焦平面的z堆叠构成。相同的暴露时间用于对比分析。

间隙分析

体外如前所述进行Rheb-GAP分析(Tee等人，2003年)，进行了以下修改。用TBC1D7（Sigma#SAB1400543）、TSC1（CST#6935）和TSC2（SCB#sc-892）抗体免疫纯化内源性复合物(图4C)或四个(图4D)每次反应15厘米皿的缺血清（6小时）HeLa细胞。每次反应使用约500 ng重组GST-Rheb，并在30℃下培养1小时。

统计分析

采用假设方差相等的非配对双尾Student T检验确定细胞大小分布差异的显著性。

​

集锦

  1. TBC1D7是TSC1-TSC2复合物中普遍存在的、稳定相关的第三核心亚单位。
  2. TSC1结合并稳定三聚络合物中的TSC2和TBC1D7。
  3. TSC1-TSC2-TBC1D7（TSC-TBC）复合体是mTORC1上游的功能性Rheb-GAP。
  4. 作为TSC-TBC复合体的一部分，TBC1D7抑制mTORC1和下游功能。

补充材料

01

单击此处查看。（230万，文件）

鸣谢

我们感谢Jordan Gallinetti、Bernie Boback和Min Yuan的技术援助，感谢Danielle Manning博士的技术建议。这项工作得到了NIH赠款P01-CA120964（B.D.M.、D.J.K.和J.M.A.）、R01-CA122617（B.D.M）和Dana Farber/哈佛癌症中心支持赠款P30-CA006516（J.M.A。

脚注

补充信息

补充信息包括补充实验程序和参考文献，以及五个支持性数字.

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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