白藜芦醇介导的自噬在没有诱导的吞噬体形成的情况下需要WIPI-1调节的LC3脂质化

白藜芦醇不促进WIPI-1点的增加，这对典型的自噬很重要

为了更详细地分析白藜芦醇处理对WIPI-1定位的影响，我们使用了一种专门用于自动获取（表荧光）和GFP-WIPI-1阳性自噬体结构图像分析（WIPI-1斑点形成测定）的自动高通量程序。³⁸使用稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞，我们使用无营养培养基（EBSS）或白藜芦醇（32μM、64μM、128μM）进行3、24或48小时的治疗(图2A). 对来自三个独立实验的每个处理的多达3899个单个细胞的分析表明，白藜芦醇在3、24或48小时后不会诱导GFP-WIPI-1点形成(图2B). 在较高浓度或更长时间的白藜芦醇处理中，与对照组相比，GFP-WIPI-1点状阳性细胞的基础数量显著减少(图2B). 正如预期的那样，营养素缺乏显著增加了显示GFP-WIPI-1点的细胞数量(图2A和B)和Baf A对溶酶体的抑制₁治疗进一步显著增加了GFP-WIPI-1点状阳性细胞的数量(图2C)以及每个单元格中GFP-WIPI-1点的数量（未显示数据）。在白藜芦醇处理的细胞中未观察到这种作用(图2C). 然而，我们证实，营养饥饿和白藜芦醇都能促进GFP-WIPI-1 U2OS细胞系中LC3-II的增加(图S1A 和 S1B级). 为了进一步证实此处使用的GFP-WIPI-1 U2OS细胞系中适当的典型自噬活性，我们监测了EBSS或雷帕霉素自噬刺激后LC3-II蛋白丰度和WIPI-1点的形成(图S1B 和 S1C系列). 正如预期的那样，当对照治疗与EBSS或雷帕霉素治疗进行比较时，LC3-II蛋白丰度增加(图S1B). 总之，与对照细胞（CM:26.2%点状阳性细胞）的基础自噬活性相比，雷帕霉素治疗（RM:64.1%点状阳性）和营养饥饿（EBSS:75.6%点状阳性电池）后，GFP-WIPI-1点状阳性的细胞增加，而沃特曼给药（WM:9.1%点状阳电池）后减少 (图S1C). 进一步的化合物，足叶乙甙和staurosporine，被证明可以刺激自噬，也可以增加暴露3小时后显示GFP-WIPI-1的细胞数量(图S1D). 重要的是，依托泊苷是一种通过抑制拓扑异构酶II诱导DNA链断裂的化疗化合物，它可以诱导依赖于PtdIns3KC3复合物活性的非经典Atg5非依赖性自噬降解途径。¹⁷足叶乙甙的使用增加了显示GFP-WIPI-1点的细胞水平（至48.7%）和多蛋白激酶抑制剂和强烈的凋亡诱导剂staurosporine，也导致显示GFP-WIPI-1点细胞的细胞增加（至73.9%）(图S1D). 因此，这些被发现调节自噬的促凋亡化合物也刺激WIPI-1点的形成。

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图2。

WIPI-1点状体的形成在营养缺乏时受到刺激，但在白藜芦醇治疗后不会受到刺激。用对照培养基（CM）、32μM、64μM或128μM白藜芦醇（Res）或无营养培养基（EBSS）处理稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞3、24或48小时。自动采集和分析GFP-WIPI-1荧光图像（A）。测定了GFP-WIPI-1点状阳性细胞的数量，每个条代表1732–3899个单独分析的细胞的平均值（n=3）±SD（B）。用对照培养基（CM）或64μM白藜芦醇（Res）处理稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞，并加入或不加入巴非霉素A₁（Baf A₁)或无营养培养基（EBSS）培养3 h。进行自动GFP-WIPI-1点状形成分析（n=516044-22479个单独分析的细胞），并表示为GFP-WIPI-1点状阳性细胞的数量±SD（C）。用GFP-WIPI-1 U2OS细胞系和以下处理进行时间进程实验：对照培养基（CM）、64μM白藜芦醇（Res）、无营养培养基（EBSS）、对照培养基中的100μM LY294002、无营养介质中的64μM白藜醇（EBSS/Res）或无营养介质（EBSS/LY294001）中的100µM LY29.4002。每个处理（n=3）多达5000个单个细胞的GFP-WIPI-1点状形成自动分析表示为GFP-WIPI-1点状阳性细胞的数量±SD（D）或每个细胞的GFP WIPI-1点状细胞的数量（E）。p值：*p<0.05**p<0.01***p<0.001；ns=不显著。比例尺：20µm。

基于此，我们重新探讨了白藜芦醇对WIPI-1点形成的抑制作用(图2B)并进行了超过6小时的时程实验(图2D和E). 我们使用EBSS诱导自噬，并使用LY294002抑制PtdIns（3）P的产生，从而形成WIPI-1点状。此外，我们还包括白藜芦醇或LY294002在无营养培养基（EBSS）中的联合治疗。事实上，我们证明白藜芦醇可以对抗营养缺乏诱导的GFP-WIPI-1点状细胞形成，这可以通过测量GFP-WIPI-1点状阳性细胞的数量来衡量(图2D)或每个细胞的GFP-WIPI-1点数量(图2E). 由于EBSS治疗用于通过氨基酸和血清剥夺使细胞饥饿，我们也使用含有氨基酸但缺乏血清的对照培养基（CM w/o FCS）进行了此实验。在CM w/o血清中也观察到白藜芦醇对抗GFP-WIPI-1斑点形成的趋势(图S2)，但与EBSS相比，这种效果并不显著(图2D和E)表明白藜芦醇可对抗氨基酸饥饿诱导的典型自噬。

WIPI-1和WIPI-2B/2D在自噬中显示冗余功能的证据

我们的研究结果有必要调查人类WIPI-2，即WIPI-1的最接近的人类同源物²³白藜芦醇治疗会产生点刺。因此，我们在U2OS细胞和定量细胞（来自七个独立实验的至少600个细胞）中瞬时表达了四种GFP-WIPI-2亚型（WIPI-2A，-2B，-2C，-2D）中的任意一种，通过共焦显微镜观察，在存在或不存在溶酶体抑制的情况下，白藜芦醇处理后显示了WIPI斑点。显然，白藜芦醇治疗后WIPI-2点状阳性细胞的存在并没有增加(图S3). 重要的是，我们确定了两个被测试的WIPI-2变异体，WIPI-2B和WIPI-2D，对营养缺乏的反应是形成相当于WIPI-1的细胞质斑点(图3A-D，左侧面板）。此外，我们监测了共表达的WIPI-1（GFP-WIPI-1）与任一WIPI-2亚型的细胞内定位(myc公司-通过共焦显微镜观察白藜芦醇给药后标记的WIPI-2A、-2B、-2C、-2D）。同样，当在同一细胞中共表达白藜芦醇时，WIPI-1和WIPI-2均未显示点状突起(图3A-D，中间面板）。通过在溶酶体抑制存在或不存在的情况下进行定量LC3脂质氧化分析，我们证明白藜芦醇处理可以在WIPI-1/WIPI-2共存细胞中适当诱导自噬(图3A-D，右侧面板）。据报道，用白藜芦醇处理细胞时，内源性WIPI-2点与GFP-LC3共定位。²⁶我们对WIPI-2点状阳性细胞的量化表明，这可能反映了基础条件下WIPI-2点的形成，因为大约20%的细胞在对照培养基中显示WIPI-2的点状(图3A-D，左侧面板，CM=控制介质）。

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图3。

白藜芦醇处理不会诱导WIPI-2穿孔形成，但WIPI-2B和WIPI-2D在营养缺乏时会形成穿孔。用四种GFP-WIPI-2变异体（GFP-WIPI-2A、-2B、-2C、-2D）中的任何一种瞬时转染U2OS细胞，并用对照培养基（CM）或无营养培养基（EBSS）处理。GFP-WIPI-2点状阳性细胞的数量通过荧光显微镜测定，400–600个细胞（n=2–3）的平均值显示为±SD（A–D，左侧面板）。稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞瞬时转染myc公司-标记的WIPI-2(myc公司-WIPI-2A，-2B，-2C，-2D），在对照培养基（CM）中加入或不加入64µM白藜芦醇（Res）处理3 h，然后加入抗-myc公司/Alexa546免疫染色和共聚焦显微镜（代表性图像，n=2）。细胞核用TO-PRO-3染色（A–D，中间面板）。同时，U2OS细胞共存myc公司-标记的WIPI-2变体(myc公司-WIPI-2A、-2B、-2C、-2D）和GFP-WIPI-1，在有或无巴非霉素A的情况下，在对照培养基（CM）中使用或不使用64µM白藜芦醇（Res）处理3小时₁（Baf A₁)接受LC3-II蛋白监测（A–D，右侧面板）。每个条形代表三个独立实验的平均值±SD p值：*p<0.05**p<0.01。比例尺：20µm。

白藜芦醇不促进内源性Atg12的吞噬细胞定位

Atg16L复合物，由与Atg5偶联并与Atg16相关的Atg12组成，⁵功能在WIPI-1的下游。²⁴因此，我们询问在白藜芦醇治疗后，Atg16L复合物是否被激活以定位于吞噬细胞。我们用白藜芦醇处理U2OS细胞，并使用EBSS作为阳性对照。我们通过抗Atg12免疫荧光观察内源性Atg16L复合物(图4A). 对三个独立实验中600个细胞的定量分析清楚地表明，与对照细胞（CM）相比，通过营养饥饿（EBSS）典型诱导自噬后，Atg12点状阳性细胞的数量显著增加（增至85.3%）。然而，在白藜芦醇治疗3小时后，Atg12点阳性细胞没有增加(图4B; 在GFP-WIPI-1 U2OS细胞中获得了相同的结果，数据未显示）。

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图4。

营养素缺乏时Atg12 punta和WIPI-1/DFCP1共定位增加，但在白藜芦醇治疗时不增加。用64µM白藜芦醇（Res）、无营养培养基（EBSS）或对照培养基（CM）处理U2OS细胞3 h，然后进行抗Atg12/Alexa488免疫染色，以便通过共焦显微镜（A）观察内源性Atg16L复合物。测定了Atg12点状阳性细胞的数量（600个细胞，n=3），每个条代表平均值±SD（B）。p值：***p<0.001；ns=不显著。稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞瞬时转染myc公司-DFCP1，用无营养培养基（EBSS）或64µM白藜芦醇（Res）处理3 h，然后用抗-myc公司/Alexa546免疫染色。显示了单个光学部分（上面板）的典型共焦显微镜图像（n=3）以及相应的强度剖面（下面板）（C和D）。比例尺：20µm。

WIPI-1在无营养条件下与DFCP1共定位，但在白藜芦醇处理后不共定位

由于白藜芦醇处理后WIPI-1和WIPI-2均未被刺激显著定位于吞噬细胞，因此我们询问是否有进一步的PtdIns（3）P-结合蛋白参与吞噬细胞形成的早期步骤DFCP1，²⁹可能对这种治疗有反应。我们发现myc公司-U2OS细胞或GFP-WIPI-1细胞系中标记的DFPC1导致DFCP1点定位(图4C和D). 营养缺乏诱导WIPI-1点形成后，DFCP1和WIPI-1在大多数细胞中部分共定位(图4C). 在白藜芦醇处理后，没有观察到这种部分共定位，因为WIPI-1点状阳性细胞的数量没有因处理而增加(图4D). 然而，在对照培养基（CM）或白藜芦醇处理后的少数GFP-WIPI-1点状阳性细胞中，GFP-WIPI-1和DFCP1点状也部分共定位（数据未显示）。

白藜芦醇治疗后，细胞PtdIns（3）P的可用性不受抑制

接下来，我们询问白藜芦醇是否影响细胞内PtdIns（3）P的整体可用性。我们使用稳定的GFP-2xFYVE标记内体PtdIns（3）P池^39,40白藜芦醇、沃特曼或LY294002处理3 h的U2OS细胞株(图S4). 使用自动荧光图像采集和分析，我们发现与对照细胞相比，白藜芦醇处理后每个细胞的GFP-2xFYVE阳性信号量没有显著差异，但LY294002处理后的GFP-2阳性信号量与预期的相同(图S4A). 这强烈表明，白藜芦醇不会阻止PtdIns（3）P的生成。总之，内源性EEA1（早期内体的标记）的共定位，³⁹而GFP-2xFYVE在白藜芦醇治疗后没有改变(图S4B). GFP-2xFYVE信号占对照细胞和白藜芦醇处理细胞早期内体的84%(图S4B). 因此，我们的结果表明，白藜芦醇不会阻止PtdIns（3）P的生成和可用性。然而，在营养饥饿和白藜芦醇处理后，观察到每个细胞的GFP-2xFYVE斑点数量减少(图S4C).

白藜芦醇介导的LC3反应的部分沃特曼不敏感

接下来，我们研究了当PtdIns（3）P生成被阻断时，白藜芦醇介导的LC3-II和GFP-LC3点状增加是否发生。我们将稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞与沃特曼和白藜芦醇或EBSS联合治疗(图5A). 来自六个独立实验的LC3蛋白丰度定量显示，在含有巴非霉素A的情况下，与白藜芦醇和沃特曼联合处理的细胞中，LC3-II水平显著增加₁相反，在巴非霉素A存在下使用沃特曼治疗₁并没有像预期的那样导致LC3-II蛋白的增加，EBSS和沃特曼联合治疗也完全消除了LC3-II的增加(图5A). 然而，与单独使用白藜芦醇相比，联合使用白藜醇和沃特曼素的细胞也显示出LC3-II水平的显著降低(图5A). 为了证实LC3-II蛋白监测的结果，我们生成了一个稳定的GFP-LC3 U2OS细胞系，并将该细胞系用于自动高通量GFP-LC3puncta分析。同样，我们在存在或不存在溶酶体抑制的情况下，用沃特曼和白藜芦醇或EBSS共同处理GFP-LC3 U2OS细胞（用Baf A₁) (图5B). 与单独或EBSS与沃特曼联合治疗相比，联合治疗白藜芦醇和沃特曼显著增加每个细胞的GFP-LC3点(图5B和C). 然而，在白藜芦醇/沃特曼联合治疗后，与单独治疗相比，每个细胞中GFP-LC3点的数量显著减少(图5C). 此外，与相同条件下溶酶体降解被阻断（Baf A₁)没有白藜芦醇单独刺激细胞的强度大(图5C). 因此，我们的结果提供了白藜芦醇介导的自噬是部分沃特曼敏感的证据。然而，白藜芦醇仍能刺激LC3-II和GFP-LC3在沃特曼中的增加。

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图5。

白藜芦醇促进LC3-II蛋白丰度增加，GFP-LC3点状物对沃特曼治疗部分不敏感。稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞用对照培养基（CM）、白藜芦醇（Res）、沃特曼蛋白（WM）、白黎芦醇加沃特曼肽（Res/WM）、无营养培养基（EBSS）或无营养培养液加沃特曼宁（EBSS/WM）处理3 h。巴非霉素A₁（Baf A₁)2小时后添加，如所示（+）。测定LC3-II蛋白丰度，并将其归一化为微管蛋白。每个条代表平均值±SD（n=6）（A）。如上所述处理稳定的GFP-LC3 U2OS细胞，并进行自动荧光图像采集（B）和分析（C）。每个条形代表1553–3207个单个细胞（n=3）分析的平均值±SD。p值：*p<0.05**p<0.01***p<0.001；ns：不显著。比例尺：20µm。

Atg7和Atg5依赖的LC3对营养饥饿和白藜芦醇治疗的反应

接下来，我们分析了LC3-II和GFP-LC3斑点的增加是否需要规范的LC3脂质沉积。我们使用了m5-7细胞，即来自Atg5基因敲除小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞，其中含有强力霉素可抑制的整合Atg5 cDNA。⁴¹显然，在没有多西环素的情况下使用该细胞系，形成了Atg12-5结合物，随后形成了LC3-II(图6A). 正如预期的那样，在营养缺乏（EBSS）时，LC3-II的数量增加(图6A). 与我们之前在这项研究中的发现一致，白藜芦醇治疗也导致LC3-II的增加(图6A). 当强力霉素介导的Atg5表达停止后，无论溶酶体抑制是否存在，这种作用几乎无效(图6B). 为了进一步研究白藜芦醇介导的LC3应答中对Atg5的依赖性，我们通过瞬时siRNA转染下调Atg5，并量化LC3-II蛋白丰度(图6C). 正如预期的那样，当Atg5下调时，营养缺乏诱导的LC3-II生成减少。与中显示的结果一致图6B在siAtg5存在的情况下，白藜芦醇处理的细胞中LC3-II水平也降低(图6C). 在下调Atg7后，Atg12–5共轭物的水平也降低了（请注意，Atg5主要以Atg12-5共轭形式检测到）(图6C)如预期。⁵因此，无论是使用对照治疗（CM）、无营养培养基（EBSS）还是白藜芦醇（Res），在siAtg7存在的情况下，LC3-II蛋白丰度都会降低(图6C). 由此可见，规范驱动的Atg7/Atg5依赖性LC3-II的产生是白藜芦醇对LC3产生作用的先决条件。然而，白藜芦醇治疗并没有促进Atg12的显著吞噬细胞定位，这反映了Atg12–5/Atg16L复合物的定位，但Atg5是白藜芦醇介导的LC3反应的功能所必需的。

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图6。

白藜芦醇介导的自噬依赖于Atg7和Atg5。用64µM白藜芦醇（Res）、无营养培养基（EBSS）或对照培养基（CM）处理小鼠胚胎成纤维细胞（m5-7细胞）3 h，并进行定量抗LC3蛋白印迹（n=7）（A）。将多西环素（1µg/ml）添加到培养基中，以关闭m5-7细胞中Atg5的表达。显示了用对照培养基（CM）、64µM白藜芦醇（Res）或无营养培养基（EBSS）处理3 h后检测Atg5（Atg12-5结合物）、LC3或微管蛋白的代表性western blot（n=3）；巴菲尔霉素A₁（Baf A₁)如（B）所示，在2小时后添加。用对照、Atg5或Atg7 siRNA转染稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞72小时，并用对照培养基（CM）、64µM白藜芦醇（Res）或无营养培养基（EBSS）处理3小时或显示Atg7蛋白，LC3-II蛋白丰度通过微管蛋白标准化并量化（n=3）（C）。p值：*p<0.05***p＜0.001。

抗体和染料

本研究中使用了以下主要抗体：抗WIPI-1（Abnova，H00055062-M02）、抗WIPI-2（Abgent，AP9559b）、抗LC3（NanoTools，0231-100/LC3-5F10）、抗Atg5（Cosmo Bio Co.，CAC-TMD-PH-AT5）、抗Attg12（Abgen，AP1816a）、抗Atg7（Cell Signaling Technology，2631）、抗-myc公司在小鼠或兔子中饲养（Santa Cruz，sc-40和sc-789）、抗EEA1（BD Biosciences，610456）、抗GAPDH（Hytest，5G4）、抗微管蛋白（Sigma-Aldrich，T5168）。抗小鼠IgG Alexa Fluor 546、抗兔IgG Alexa Fluor 488、抗兔IgG Alexa Fluor 546购自Molecular Probes（分别为A11003、A11008、A11010）。来自Cell Signaling Technology（7074）的抗兔IgG-HRP和来自GE Healthcare（NA931V）的抗鼠IgG-HRP。TO-PRO-3从Invitrogen（T3605）购买，DAPI从Applichem（A4099）购买。

cDNA构建物

GFP-LC3由大阪大学Tamotsu Yoshimori提供。GFP-WIPI-1如前所述。²⁷GFP-WIPI-2A和-2C是从最初的GFP-WIPI-2（GFP-WIBI-2B，GFP-WIPID-2D）分离物中产生的²³根据NCBI{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_056425”，“term_id”：“7661580”，“term_text”：“NP_056422”}}NP_056425号,{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_057087”，“term_id”：“54111428”，“term_text”：“NP_057088”}}NP_057087型,{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_001028690”，“term_id”：“75677329”，“term_text”：“NP_001028680”}}NP_001028690号,{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_001028691”，“term_id”：“75677331”，“term_text”：“NP_001028681”}}NP_001028691号.Myc公司-通过将WIPI-2 cDNA变体亚克隆到pCMV-Tag3（HindIII/EcoRI）中，生成WIPI-2（-2A、-2B、-2C、-2D）结构体。Myc公司-DFCP1是通过将DFCP1 cDNA（imaGenes，IRATp970A0374D）克隆到pCMV-Tag3b（BamHI/XhoI）中而产生的。通过PCR、自动DNA测序和蛋白质表达分析确认结构完整性。

siRNA

Atg5 siRNA、Atg7 siRNA和相应的对照siRNA分别来自细胞信号技术（6345、6604、6568）。WIPI-1 siRNAs（SR310458A，B，C）、WIPI-2 siRNA（SR308719A，B和C）和相应的对照siRNA（SR30004）购自Origene。

媒体和补充

DMEM和OPTI。MEM来自Invitrogen（分别为31966、51985），EBSS来自Sigma Aldrich（E2888）。使用了以下DMEM补充剂：胎牛血清（PAA，A15-043）、青霉素/链霉素（Invitrogen，15140）、血浆素（Invivogen，ant-mpp）、强力霉素（Sigma-Aldrich，D9891）、G418（Invit罗gen，11811）。

细胞培养

人类U2OS、G361和HeLa细胞（分别来自ATCC、HTB-96、CRL-1424、CCL-2）、MCF-7细胞（Evelyne May/CEA、CNRS）和m5-7细胞（Noboru Mizushima、东京医科和牙科大学）在DMEM、10%FCS、100 U/ml青霉素/100μg/ml链霉素、5μg/ml胞浆蛋白中培养。在培养基中使用1µg/ml多西环素可降低m5-7细胞中Atg5蛋白的表达。⁴¹稳定GFP-WIPI-1 U2OS³⁸或GFP-2xFYVE U2OS细胞系（GE Healthcare）在0.6 mg/ml G418存在的上述培养基中培养。

转染

本研究中使用了以下转染试剂：Lipofectamine 2000（Invitrogen，11668）、Promofectin（Promokene，PK-CT-2000-100）或DEAE-Dextran（Sigma-Aldrich，D9885）。根据制造商的方案，使用3µg DNA和5µl Promofectin在六孔板中进行常规瞬时转染。通过使用4µg DNA和10µl Lipofectamine 2000在六孔板中转染U2OS细胞，然后选择G418（1 mg/ml），生成稳定的GFP-LC3细胞系。瞬时转染myc公司-通过使用2µg DNA和15µl DEAE葡聚糖应用标准DEAE葡聚糖程序，将DFCP1质粒导入稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞。⁴⁴

siRNA转染

根据制造商的方案，在24孔板中用20 nM对照siRNA、Atg5 siRNA或Atg7 siRNA和1µl Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen，11668）转染稳定的GFP-WIPI-1 U2OS细胞。48小时后，进行第二次转染，再进行24小时的孵育期。将60 nM对照siRNA、三种独特WIPI-1 siRNA的混合物（每个20 nM）或三种独特的WIPI-2 siRNA（每个20 nM）与5µl Lipofectamine RNAiMAX的混合物在六孔板中转染G361细胞。36小时后，进行第二次转染程序，并将细胞再培养36小时。

自噬试验

在添加或不添加10%FCS的对照培养基（DMEM）中进行分析，如文中所述。通过给药EBSS、白藜芦醇（32µM、64µM或128µM）、沃特曼（233 nM）、雷帕霉素（300 nM），staurosporine（100 nM）和依托泊甙（5μM）或LY294002（100μM或50μM），在指定的时间段（通常为3 h）内进行治疗。还进行了如下共处理：白藜芦醇（64µM）+麦芽甘露聚糖（233 nM）、EBSS+麦芽甘聚糖（233nM），EBSS+白藜芦醇（64μM），以及EBSS+LY294002（100µM）。为了抑制自噬通量，200 nM巴非霉素A₁在整个治疗期间或治疗的最后一小时添加。

共焦显微镜

制备固定细胞（3.7%多聚甲醛）用于直接GFP荧光或间接免疫荧光（过度表达myc公司-如前所述，使用LSM 510显微镜（蔡司）和63×1.4 DIC Plan-Apochromat油浸物镜标记WIPI-2亚型或DFCP1或内源性Atg12）。²³通常，采集10-20个光学切片（0.5µm），并根据1-5个光学切片的投影制备最终图像。为了获得强度分布，使用了单个光学切片。通过使用三个光学切片的投影和ImagePro-Plus 4.1软件确定每个细胞的GFP-LC3点数量。如前所述，GFP-WIPI-1或Atg12点状阳性细胞通过荧光显微镜进行计数（在三到四个独立实验中，每个处理最多400个细胞）。

自动GFP图像采集和分析。³⁸

将稳定的GFP-WIPI-1、GFP-LC3或GFP-2xFYVE U2OS细胞镀在96孔（或24孔）板上，并按指示进行分析。使用细胞内分析仪1000（GE Healthcare）采集模式，使用尼康40x Planfluor物镜自动采集图像。为了可视化DAPI染色的细胞核，使用了激发过滤器D360/40和发射过滤器HQ460/40M，并使用了激发滤波器S475/20和发射过滤器HQ535/50M来可视化GFP。使用细胞内分析仪1000工作站3.4针对采集的荧光建立了特定于软件的分析协议，如下所示。应用双区域对象分析检测到GFP-WIPI-1点（灵敏度设置为5）包含内容和多尺度顶帽算法，表示为每个单元的GFP-WIPI-1点数量。更严格的决策树包括强度（>200）和内含物/细胞密度应用（>1.15）并确定GFP-WIPI-1点状阳性细胞的数量。使用双区域对象分析GFP-LC3或GFP-2xFYVE点状物由包含内容和多顶帽子算法。这里，灵敏度设置为40，并确定每个细胞的穿孔数。使用细胞内分析仪1000使用ImagePro-Plus 4.1软件对（GE Healthcare）和30个细胞（来自3-4个区域）进行分析。

免疫印迹法

用PBS洗涤细胞，并在TBS/1%Triton-X100中或在750 mM氨基己酸、50 mM Bis-Tris、0.5 mM EDTA、1%Triton-X100中溶解。将可溶部分（离心：14000 rpm，10 min，4°C）补充到Laemmli加载缓冲液中，进行SDS-PAGE并在PVDF膜上进行印迹（Millipore，IPVH00010）。或者，将煮沸的Laemmli缓冲液添加到细胞中，然后用23G针剪切染色质，从而生成总蛋白提取物。使用个人密度计SI（分子动力学）量化标准ECL检测的信号强度。为了量化蛋白质丰度，LC3-II信号强度在微管蛋白或gapdh上进行了标准化。

定量电子显微镜

在用对照培养基（CM）、64µM白藜芦醇（RM）或无营养培养基（EBSS）处理3 h后，将GFP-WIPI-1 U2OS细胞固定在2.5%戊二醛中2 h，包埋在琼脂糖中，并用1%四氧化锇和1%铁氰化钾在冰上处理90 min。在用1%醋酸铀酰水溶液洗涤和染色（60分钟）后，将afar块在分级系列乙醇中脱水并嵌入暴露树脂中。使用LEO 906透射电子显微镜分析超薄树脂切片。²⁷分析两种不同环氧树脂块（每个样品）的切片（每个处理总共72–87个细胞）。在16700倍放大镜下识别并计数多层自噬小泡（AV），并拍摄代表性图像。生成计数细胞的概览（400倍放大）和光栅（25µm²)已应用于点数。^35,37

我们感谢Noboru Mizushima提供m5-7细胞，感谢Tamotsu Yoshimori共享pEGFP-LC3结构。我们感谢Sabine Ruckerbauer和Boris Jakuschkin提供的技术援助。Codogno实验室获得了来自INSERM、巴黎南11大学机构基金的资助，以及来自ANR（国家癌症研究所）的资助。Proikas-Cezanne实验室得到了科学、研究和艺术部Baden-Wuertemberg的支持（Landesgraduiertenförderung，M.M.的博士前奖学金）；以及联邦教育和科学部（BMBF，BioProfile）和德国研究学会（DFG，SFB 773）向T.P.-C提供的资助。