结果
亮氨酸剥夺触发人类黑色素瘤细胞的凋亡细胞死亡
我们检测了四种患者来源的黑色素瘤细胞系（A-2058、SK-MEL-3、SK-MEL-5、SK-MEL-28）以及未转化但永生化的人类MEL-ST黑色素细胞系的存活率(). 我们使用caspase-3的裂解作为caspase依赖性凋亡的读数(Galluzzi等人，2009年;Kroemer等人，2009年;Taylor等人，2008年). 半胱氨酸蛋白酶-3裂解一系列凋亡相关蛋白，包括PARP(图S1A).
去亮氨酸诱导人黑色素瘤细胞凋亡患者衍生黑色素瘤细胞（A）、永生化人类黑色素细胞和非黑色素细胞衍生系（B）以及转化黑色素细胞（C）的调查。在剥夺个体必需氨基酸48小时后，对指示细胞系的完整和裂解caspase-3进行免疫印迹分析。条形图显示了蛋白质质量（细胞生长和增殖的读数）和胱天蛋白酶-3激活百分比（裂解与全长胱天蛋白酶-3的比率）的相对变化。虚线表示caspase-3激活10%。Ctrl，控制RPMI-1640媒体；C-F-H-I-K-L-M-Q-R-T-V-W-Y，剥夺指定的单一氨基酸（氨基酸的单字母代码）；Adr，阿霉素2µg/ml。（D）Annexin-V凋亡诱导试验。FL1；膜联蛋白-V-荧光素，FL2；碘化丙锭，UR；右上象限，左后；右下象限。（E） 细胞存活分析。细胞被剥夺所有必需氨基酸（-EAA）、组氨酸（-His）、异亮氨酸（-Ile）或亮氨酸（-Leu）2天，然后重新放入对照RPMI-1640培养基中，并在指定的时间点测量细胞数量的变化。数据表示为平均值±标准差，*表示与对照组有显著差异的值。另请参见图S1.
细胞被剥夺了十三种被普遍认为是人类必需的氨基酸（F、I、K、L、M、T、V、W）或有条件的（C、H、Q、R、Y），每次一种氨基酸(Berg，2007年;鹰，1959年). 我们只剥夺了黑色素瘤细胞的必需氨基酸，因为细胞株合成非必需氨基酸的能力不同，这将极大地混淆对结果的解释。不出所料，在任何一种必需氨基酸被剥夺后，所有细胞株都停止了增殖，并伴随着细胞周期蛋白D1水平和蛋白质质量的下降(、和图S1A). 相反，黑色素瘤细胞系的不同之处在于，当个别氨基酸从培养基中缺失时，会触发caspase-3的裂解(). 有趣的是，在所有黑色素瘤细胞系中，唯一不变的是亮氨酸缺失触发caspase-3的裂解和相应的caspase依赖性PARP的裂解(图S1A). 然而，在非转化的Mel-ST黑素细胞或非黑素细胞衍生的HEK-293T细胞中，亮氨酸剥夺并没有诱导caspase-3裂解(). DNA损伤剂阿霉素确实在后两种细胞系中诱导caspase-3裂解，就像在患者源性黑色素瘤细胞中一样().
与caspase-3裂解结果一致，Annexin-V分析(Galluzzi等人，2009年;Kroemer等人，2009年)发现，当亮氨酸缺乏时，a-2058细胞质膜外叶上磷脂酰丝氨酸（PS）的时间依赖性增加(). Annexin-V染色的增加先于质膜完整性的最终丧失，这可以通过后期碘化丙啶染色的增加来检测().
RAS-MEK通路的过度激活使黑素细胞依赖亮氨酸生存
因为我们研究中的所有黑色素瘤细胞株都有RAS-MAPK途径的激活突变（COSMIC数据库，Wellcome Trust Sanger Institute）(Bamford等人，2004年)，我们询问Ras通路的过度激活是否可以赋予黑素细胞在亮氨酸缺乏时诱导胱天蛋白酶-3激活的能力。事实上，Mel-STR细胞是一种通过转化Mel-ST黑素细胞产生致癌的工程黑色素瘤细胞RAS-G12伏(Gupta等人，2005年)，当缺乏亮氨酸时，非常强烈地诱导caspase-3裂解(). Mel-STMK细胞，是表达活化等位基因的Mel-ST细胞MEK1型(MEK1-Q56P型) (Bottorff等人，1995年;Marks等人，2008年)在caspase-3裂解试验中，其表现与Mel-STR细胞非常相似，在Annexin-V试验中，表现与A-2058细胞非常相似(). 这些数据支持这样的观点，即RAS-MEK通路负责黑素细胞对白细胞剥夺的敏感性。与这一解释一致的是，U-0126（MEK1/2的小分子抑制剂）(Davies等人，2000年;Favata等人，1998年)而不是KT5720（PKA抑制剂）阻止了缺乏亮氨酸的Mel-STR细胞中caspase-3的裂解(图S1B).
在人类癌症中发现的RAS-MAPK途径的几个成分发生突变，BRAF公司是黑色素瘤中的一个关键癌基因。50%-70%的病例中有激活突变(加内特和马莱，2004年;Gray-Schopfer等人，2007年)我们调查的所有患者源性黑色素瘤细胞系都携带一个突变的等位基因BRAF公司(Bamford等人，2004年). 因此，我们询问肿瘤基因的表达胸罩-V600E，最常见BRAF公司黑色素瘤中发现的突变等位基因(Davies等人，2002年)，模拟RAS-G12伏一个d MEK1-Q56P型使黑素细胞在缺乏亮氨酸时对凋亡敏感。事实上胸罩-V600E以及BRAF-Δ3-V600E，无法与交互的变体加拿大皇家空军(Karreth等人，2009年)，促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在亮氨酸退出时的裂解(图S1C). 野生型的表达BRAF公司或BRAF-Δ3没有V600E突变的变体没有相同的效果(图S1C). 总之，这些结果支持RAS-BRAF-MEK1信号轴在确定细胞对亮氨酸缺乏的敏感性方面的关键作用。
我们还测定了在去除亮氨酸、异亮氨酸或所有氨基酸后，在约80%细胞汇合处将等量细胞重新接种到完整培养基中时，细胞恢复增殖的能力。Mel-STMK、A-2058和SK-Mel-5，但不包括Mel-ST，失去亮氨酸的细胞在重新培养时无法显示增殖(). 仅将培养基更换为完整培养基而不重新接种也显示出与细胞重新接种的结果一致的结果，这排除了由于观察到的结果而导致电镀效率变化的可能性(图S1D). 与缺乏亮氨酸的结果相反，所有缺乏异亮氨酸或所有必需氨基酸的细胞株都成功地恢复了增殖(). 在缺乏组氨酸的SK-MEL-5和A-2058细胞中，细胞存活程度与caspase-3裂解程度呈负相关().
线粒体凋亡途径调节的半胱氨酸天冬氨酸酶活性对亮氨酸剥夺引起的细胞死亡是必要的
为了研究亮氨酸缺乏是否需要凋亡的胱天蛋白酶来触发细胞死亡，我们使用了泛胱天蛋白酶抑制剂Q-VD-OPH(Caserta等人，2003年;Chauvier等人，2007年)和Z-VAD-fmk(Slee等人，1996年). Q-VD-OPH抑制一系列具有高度特异性的半胱天冬酶，而Z-VAD-fmk也可能抑制其他类型的蛋白酶，包括钙蛋白酶和溶酶体组织蛋白酶(Caserta等人，2003年;Chauvier等人，2007年;Kroemer等人，2009年). Q-VD-OPH抑制凋亡细胞的形态学变化，以及缺乏亮氨酸细胞中PARP的半胱氨酸依赖性裂解(). 至关重要的是，Q-VD-OPH和Z-VAD-fmk大大提高了缺乏亮氨酸的黑色素瘤细胞的存活率(). 由于Q-VD-OPH不能完全拯救细胞免受亮氨酸剥夺诱导的细胞死亡，因此除了半胱氨酸依赖性凋亡外，其他机制也可能导致细胞死亡。
通过线粒体凋亡途径激活caspase级联对亮氨酸缺乏诱导的死亡是必要的（A） 在存在或不存在20µM Q-VD-OPH的情况下，显示所有必需氨基酸（-EAA）、异亮氨酸或亮氨酸缺失后形态变化的显微照片。比例尺=100µm。（B） 免疫印迹分析显示增加Q-VD-OPH浓度（0µM、5µM，20µM和100µM）对caspase介导的过程的剂量依赖性抑制作用。（C） 细胞存活分析。在存在或不存在泛酶抑制剂、20µM Q-VD-OPH或100µM Z-VAD-fmk的情况下，细胞被剥夺亮氨酸（-Leu）2天。（D） 流式细胞术分析显示使用JC-1染料的MOMP的变化。FL1；J单体（JC-1绿色荧光），FL2；J聚集体（JC-1红色荧光）。（E） 免疫印迹分析显示Bcl-xL表达对亮氨酸剥夺后caspase-3激活的影响。（F） 流式细胞术分析显示MOMP的变化。（G） 细胞存活分析。数据以平均值±标准差表示，*表示与对照组明显不同的值。
半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂实验也暗示了亮氨酸剥夺是如何激活半胱氨酸酶级联反应的。Q-VD-OPH不仅抑制已知的caspase-3底物PARP的裂解，而且还抑制caspase-9在Asp-315的自裂解。作为线粒体途径的启动子caspase，caspase-9调节执行子caspases，包括caspase-3(). 与这一发现一致，亮氨酸剥夺增加了A-2058和Mel-STMK细胞的线粒体外膜通透性（MOMP），但不增加Mel-ST细胞(). 为了确定MOMP的增加是否对亮氨酸剥夺引起的细胞死亡是必要的，我们建立了过度表达Bcl-xL的A-2058细胞(). 与亲本系相比，Bcl-xL过表达细胞在缺乏亮氨酸时，不会增加MOMP或触发caspase-3的裂解(). 在无亮氨酸条件下，Bcl-xL过表达细胞中胱天蛋白酶-3激活的减少与其存活率的增加直接相关(). 这些结果支持线粒体凋亡途径在亮氨酸剥夺后触发细胞死亡中的重要作用。
亮氨酸剥夺不会激活黑素细胞衍生细胞中具有组成活性RAS-MEK信号的自噬
为了研究为什么剥夺亮氨酸而非其他必需氨基酸是黑色素瘤细胞凋亡的普遍诱导剂，我们检测了剥夺亮氨酸和RAS信号对自噬活性的影响。人们越来越认识到，自噬对细胞在营养缺乏条件下生存至关重要，氨基酸是这一过程的主要调节器(克林斯基，2007年;莱文和克罗默，2008年).
我们使用荧光蛋白标记的LC3报告子定量自噬活性。这种双色DsRed-LC3-GFP报告基因是经典GFP标记的LC3报告基因的修饰形式(Kabeya等人，2000年)，并提供了两个自噬活动读数：DsRed-LC3点的数量和流式细胞术测量，我们称之为自噬指数。与之前使用GFP-LC3报告器获得的结果类似(Kabeya等人，2000年)，我们的报告显示，在PBS孵育或氨基酸缺失后，DsRed-LC3点的数量增加(). 报告者通过自噬蛋白酶ATG4的识别位点从LC3的C末端分离出GFP，并且可以通过流式细胞术监测GFP荧光的丢失（参见图S2详细信息）。正如预期的那样，ATG4识别序列的删除消除了报告者对低营养状况的敏感性(图S2CS2E). 与对照培养基条件相比，剥夺所有氨基酸显著降低了免疫印迹检测到的全长DsRed-LC3-GFP报告子的水平(图S2B). 为了表示流式细胞术获得的结果，我们引入了自噬指数，该指数将GFP荧光的变化标准化为DsRed-LC3荧光的变化（参见方法和图S2). 通过自噬指数，可以将氨基酸缺失后报告基因合成的潜在变化标准化。重要的是，我们的自噬指数与DsRed-LC3点的数量密切相关，这是一种自噬的既定测量方法(和图S2).
缺乏亮氨酸不会激活激活Ras-MEK信号的黑色素瘤细胞的自噬（A） 显示自噬标记的荧光显微照片。控制，完成RPMI-1640介质控制；PBS，磷酸盐缓冲液-EAA，剥夺所有必需氨基酸，-Ile，剥夺异亮氨酸-亮氨酸缺乏。DAPI，细胞核；DsRed-LC3，DsRed-LC3点的红色荧光；GFP，来自未纯化的DsRed-LC3-GFP报告子的绿色荧光；DAPI、DsRed和GFP信号的合并图像。（B） DsRed-LC3点定量。条形图显示了每种类型的营养饥饿后每个细胞DsRed-LC3点的平均值±标准差。显示检查的细胞数量。（C） 自噬活性的流式细胞术分析。条形图显示了剥夺单个必需氨基酸24或48小时（n=3）后获得的自噬指数的平均值±标准差。虚线表示在对照培养基中培养的细胞的自噬指数。（D） PBS孵育后HEK-293T细胞的自噬指数或氨基酸缺失。（E） 自噬活性的流式细胞术定量。米，标记线，指示对照培养基中细胞FL1（GFP荧光）的中值荧光强度。（F） 条形图显示自噬指数的平均值±标准差（n=3），*表示与对照组有显著差异的数值。另请参见图S2.
Mel-ST细胞在对照培养基中生长时表现出稳定的自噬活性水平，自噬指数约为40%。正如预期的那样，在剥夺所有氨基酸或大多数单一氨基酸后，自噬指数增加（至70-80%）。相反，亮氨酸缺乏未能显著激活自噬(). 免疫印迹分析还表明，仅剥夺亮氨酸并不会降低全长DsRed-LC3-GFP报告基因的水平，而剥夺所有氨基酸或仅剥夺异亮氨酸则会降低全长Ds Red-LC3-GFP的水平(图S2B)表明亮氨酸剥夺后自噬的调节存在缺陷。这种差异不太可能是由于蛋白酶体活性的改变，因为剥夺所有氨基酸、异亮氨酸或亮氨酸都会同样影响细胞周期蛋白D1的水平，细胞周期蛋白是一种短命蛋白质，其周转受泛素蛋白酶体途径调节(图S1A和图S2B)(阿劳，2007;Diehl等人，1997年). 在HEK-293T细胞中，亮氨酸剥夺诱导自噬的能力与异亮氨酸、蛋氨酸或所有氨基酸的能力没有区别(). 因此，在黑素细胞衍生的细胞系中，亮氨酸在氨基酸中是例外的，因为它的缺失不会激活自噬。
很快发现，与亲代Mel-ST细胞相比，Mel-STR和Mel-STMK细胞在营养素缺乏时有明显的自噬缺陷(). 在这些工程化黑色素瘤细胞中，PBS孵育、完全氨基酸剥夺和异亮氨酸剥夺激活的自噬程度小于亲代Mel-ST细胞中相同处理(). 重要的是，在亮氨酸缺乏的情况下，工程黑色素瘤细胞中的自噬水平甚至受到更大的抑制，这表明亮氨酸缺乏对具有激活的RAS-MEK信号的黑色素细胞衍生系中的自噬有着深远的影响().
MEK的组成性激活使mTORC1通路抵抗亮氨酸剥夺
因为mTORC1抑制自噬(Kamada等人，2000年;Noda和Ohsumi，1998年)和氨基酸激活mTORC1(Hara等人，1998年)，我们询问mTORC1的不适当调节是否可以解释为什么亮氨酸剥夺不会刺激RAS-MEK信号激活细胞的自噬。我们通过测量S6K1在Thr-389（mTORC1直接磷酸化的位点）的磷酸化来监测mTORC 1的活性(伯内特等人，1998年). 在相同的细胞中，我们还通过检测内源性LC3-I到LC3-II的转换以及LC3的最终降解来监测自噬活性(). 所有氨基酸的剥夺都会严重抑制mTORC1并激活Mel-ST细胞的自噬。Mel-STMK细胞表现类似，只是这些细胞即使在长时间缺乏必需氨基酸后仍保持一些剩余的mTORC1活性(). 然而，更有趣的发现是在缺乏亮氨酸的情况下获得的。与所有氨基酸剥夺相比，亮氨酸剥夺是mTORC1的一种较差的抑制剂，因此是自噬的诱导剂(). 令人惊讶的是，在Mel-STMK细胞中，缺乏亮氨酸几乎不能抑制mTORC1活性。与自噬报告人的结果一致，亮氨酸剥夺并没有导致Mel-STMK细胞中LC3-I到LC3-II的实质性转换或内源性LC3的丢失().
组成活性MEK对mTORC1通路的去调节激活与mTOR在溶酶体表面的不当定位有关（A） 免疫印迹分析显示，在剥夺所有必需氨基酸或亮氨酸后，mTORC1和自噬活性的时间依赖性变化。（B） 免疫荧光分析显示，在剥夺所有必需氨基酸（-EAA）或亮氨酸（-Leu）后，mTOR定位。短时间（50分钟）或长时间（4小时）剥夺细胞的指定氨基酸，并在处理mTOR（红色）和LAMP2（绿色）的联合免疫染色和成像之前，再次喂入氨基酸10分钟。在所有图像中，插图显示放大五倍的选定字段及其覆盖。比例尺=10µm。另请参见图S3.
为了进一步研究为什么亮氨酸剥夺不能抑制具有组成活性MEK的细胞中的mTORC1信号传导，我们检测了mTORC1-到溶酶体表面的氨基酸敏感性易位(和图S3用于高分辨率图像和量化）。最近的研究表明，mTORC1的氨基酸信号传递中的关键事件是氨基酸诱导mTORC2向溶酶体膜移动，在溶酶体中，mTORC可以与其激活物Rheb（一种小的GTPase）相互作用(Sancak等人，2010年). mTORC1对溶酶体表面的组成性靶向足以使mTORC1pathway对氨基酸水平不敏感(Sancak等人，2010年). 正如预期的那样，mTORC1在剥夺所有氨基酸50分钟的Mel-ST和Mel-STMK细胞中没有与溶酶体标记LAMP2共存(). 相反，在这两个品系中，仅剥夺亮氨酸50分钟并不会对mTORC1与溶酶体的共定位产生很大影响。然而，在长时间（4小时）剥夺细胞的亮氨酸后，两株细胞的行为发生了分歧：在Mel-ST细胞中，mTORC1不再与溶酶体共存，而在Mel-STMK细胞中，m TORC1仍然与溶酶体相关(). 这些发现与RAS-MEK通路影响调节mTORC1亚细胞定位的亮氨酸敏感机制上游的mTORC 1一致。
mTORC1和RAS-MEK通路的不适当激活使其对亮氨酸剥夺后的细胞凋亡敏感
为了确定通过激活RAS-MEK信号抑制黑色素瘤细胞中mTORC1通路的失败是否会导致细胞死亡，我们检测了信号通路小分子抑制剂的作用。雷帕霉素或U-0126处理的Mel-STR细胞不仅重新激活了自噬()但也抑制了caspase-3的激活(). 此外，在几个患者衍生的黑色素瘤细胞系中，雷帕霉素和U-0126在抑制亮氨酸缺乏引起的caspase-3裂解方面同样有效(). 重要的是，mTORC1或MEK抑制剂显著提高了亮氨酸衍生黑色素瘤细胞的存活率().
自噬抑制与低亮氨酸浓度协同诱导黑色素瘤细胞凋亡（A） 显示雷帕霉素（RAPA）或U-0126存在或不存在时自噬指数的条形图。（B–E）半胱天冬酶-3的裂解和激活以及PARP裂解的免疫印迹分析。（F–H）细胞存活试验。（一） 免疫印迹分析证实了shRNA-介导的ATG1敲除。（J） 的击倒自动液位计1表达的模仿效应光栅-G12V或MEK1-Q56P型在剥夺亮氨酸后使Mel-ST细胞对caspase-3激活敏感。（K） 免疫印迹显示，在存在或不存在氯喹的情况下，与减少的亮氨酸孵育的细胞中caspase-3和PARP裂解。（五十） 氯喹（CQ）使A-2058黑色素瘤细胞对部分亮氨酸缺乏敏感。免疫印迹显示并用图表定量显示caspase-3的激活与含有或不含氯喹的培养基中亮氨酸浓度的关系。（M） A-2058细胞在指定条件下培养2天的存活率。数据表示为平均值±标准差，*表示与对照组有显著差异的值。另请参见图S4.
自噬抑制模拟激活的RAS-MEK信号，赋予对亮氨酸剥夺的敏感性
当亮氨酸缺乏时，Mel-STR细胞的自噬比Mel-ST细胞受到更强烈的抑制(). 为了确定这种差异是否足以赋予Mel-STR细胞在亮氨酸退出时触发caspase-3裂解的能力，我们询问自噬的抑制是否会像RAS-MEK通路激活、Mel-ST细胞对亮氨酸剥夺敏感。为了抑制自噬，我们采用了两种不同的shRNAs靶向自动液位计1（自噬相关基因1，也称为ULK1系列)大大降低ATG1蛋白表达(). ATG1是一种进化上保守的Ser/Thr蛋白激酶，在自噬的早期阶段发挥重要作用(Chan等人，2007年;Matsuura等人，1997年). 事实上自动液位计1就像表达光栅-G12V或MEK1-Q56P型使Mel-ST细胞对亮氨酸缺乏敏感(). 通过击倒获得了类似的结果视频处理34，III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）(图S4A). 这些结果证实，细胞必须有特定水平的自噬才能在必需氨基酸缺乏的情况下存活，并表明，当缺乏亮氨酸时，RAS-MEK激活的黑色素瘤细胞会低于这个阈值。
一种小分子自噬抑制剂使黑色素瘤细胞对部分亮氨酸缺乏敏感在体外
为了探讨黑色素瘤细胞在完全剥夺亮氨酸后死亡这一发现的潜在治疗意义，我们需要确定一种方法，使黑色素瘤对部分剥夺亮氨酸敏感，因为目前不可能在体内完全剥夺癌细胞的细胞外亮氨酸。由于所有细胞都有基本水平的自噬，这可能有助于必需氨基酸的循环，我们推断，如果我们用小分子抑制剂部分抑制自噬，即使细胞外环境中保留了一些亮氨酸，黑色素瘤细胞也可能诱导凋亡。
使用氯喹（一种小分子自噬抑制剂）研究了这一想法的可行性。氯喹是一种溶酶体营养药物，可以抑制自噬途径的晚期(Boya等人，2005年)目前正在进行多项抗癌药物临床试验(临床试验.gov). 正如预期的那样，在A-2058细胞中，氯喹增加了p62/SQSTM1/Sequestosome-1的水平，并防止了LC3-II的丢失(图S5A). 通过直接与LC3结合，p62被并入自噬体并降解(Bjorkoy等人，2005年)因此p62水平与自噬活性呈负相关(水岛等人，2010年).
为了询问氯喹是否能在亮氨酸部分耗尽后诱导黑色素瘤细胞凋亡，我们首先测定了细胞外亮氨酸的最大浓度，该浓度仍低到足以触发培养中黑色素瘤的细胞凋亡(). 我们检测了一系列亮氨酸浓度：380µM（RPMI培养基中亮氨酸的浓度）；120µM（约为正常饮食小鼠的血浆亮氨酸浓度）；和60µM（约为喂食等热量、无亮氨酸合成饮食的小鼠的血浆亮氨酸浓度(Anthony等人，2004年)). 在没有氯喹的情况下，只有细胞外浓度为30µM或以下的亮氨酸才能激活caspase-3裂解(). 相反，当也用适量的氯喹处理时，即使在含有60µM亮氨酸的培养基中培养，a-2058和Mel-STR细胞也会触发caspase-3激活(). 当完全剥夺亮氨酸并用氯喹处理时，Mel ST细胞确实会裂解一些胱天蛋白酶-3()，与击倒自动液位计1和视频处理34(和图S4A). 有趣的是，氯喹治疗与所有氨基酸或蛋氨酸的剥夺相结合也促进了细胞凋亡，尽管其程度小于氯喹和亮氨酸剥夺引起的凋亡(图S4B). 最重要的是，含有60µM亮氨酸和氯喹的培养基联合使用可协同降低A-2058细胞的存活率(). 总之，这些结果表明，氯喹介导的自噬抑制使黑色素瘤细胞敏感到血浆亮氨酸水平，这可以通过喂食缺乏亮氨酸的动物来实现(Anthony等人，2004年).
饮食中亮氨酸剥夺和自噬抑制协同靶向黑色素瘤异种移植物体内
评估组合策略的潜力体内将A-2058细胞皮下注射到免疫低下小鼠体内，建立肿瘤异种移植物。当肿瘤长约100毫米时三在体积上，给宿主动物喂食：（1）对照饮食，包括添加亮氨酸的无亮氨酸饮食；（2） 等热量无亮氨酸饮食；（3） 控制饮食并用氯喹治疗；或（4）无亮氨酸饮食和氯喹治疗(). 氯喹的使用量为60 mg/kg体重，与其他人使用的剂量相似(阿马拉瓦迪等人，2007年)在我们手中，它对动物没有明显的毒性。氯喹治疗确实抑制了体内自噬，因为免疫组织化学检测显示，氯喹处理的小鼠肿瘤中p62水平预期会增加(图S5B).
在缺乏饮食亮氨酸并用自噬抑制剂治疗的小鼠中协同抑制黑色素瘤生长（A） 用添加亮氨酸的等热量控制饮食（控制饮食）、控制饮食加氯喹（+CQ）、无亮氨酸饮食（-亮氨酸饮食）或无亮氨酸膳食加氯喹的等热量对照饮食喂养14天后切除的肿瘤异种移植物的照片。（B） 柱形散点图显示肿瘤的平均±标准体积。*指示与控件显著不同的卷。注释：在−亮氨酸饮食+CQ组中，肿瘤位于右侧第三位，呈扁平圆盘状，而不是其他组中的大肿瘤呈球形。因此，它在照片中看起来似乎很大。（C） 原位TUNEL分析。H+E，苏木精和伊红染色肿瘤切片的代表性显微图像；TUNEL，TUNEL分析中处理的肿瘤切片的代表性图像；TUNEL+H，苏木精复染TUNEL结果的代表性图像。比例尺=3 mm。（D）肿瘤切片的代表性高倍显微照片，显示TUNEL阳性、凋亡区域。比例尺=100µm。（E） 肿瘤内黑色素瘤细胞的凋亡与肿瘤毛细血管的距离有关，抑制自噬会显著缩小肿瘤毛细血管周围的活袖口。显微照片显示肿瘤切片的相应高倍和低倍图像，显示毛细血管（用箭头表示）和TUNEL阳性的凋亡区域。比例尺=100µm。
就其本身而言，饮食中缺乏亮氨酸对肿瘤大小没有显著影响。相比之下，联合使用饮食缺亮氨酸和氯喹治疗的小鼠的肿瘤明显小于对照组的小鼠(). 无亮氨酸饮食本身无法减少肿瘤生长，这可能反映出无亮氨酸膳食可将血浆亮氨酸水平从约133µM降低至约76µM(Anthony等人，2004年)我们的体外实验结果表明，其本身并不足以导致黑色素瘤细胞的显著死亡().
为了确定饮食缺亮氨酸和氯喹治疗对肿瘤大小的协同作用是否反映了黑色素瘤细胞死亡的增加，我们用原位TUNEL分析对肿瘤切片进行染色(). 与培养结果类似()，联合治疗有很强的预防死亡效果体内因此，几乎在肿瘤的所有区域都观察到广泛的TUNEL阳性染色(). 只有肿瘤外壳和紧邻微柱的细胞似乎幸存下来(). 这种存活模式可能反映了肿瘤血管周围的黑色素瘤细胞比远离血液供应的细胞能够获得更多的亮氨酸。饮食中单独剥夺亮氨酸对体内黑色素瘤细胞的死亡具有显著的诱导作用，但效果较差，而单独使用氯喹只能促进肿瘤少数孤立区域的细胞死亡().
用位点特异性（D175）裂解的caspase-3抗体对肿瘤进行免疫组织化学分析，结果表明，与体外一样，部分亮氨酸剥夺联合氯喹治疗导致体内caspase-3裂解(). 裂解的caspase-3信号在毛细血管周围的活袖带和TUNEL阳性的大面积死亡细胞之间的边界处最高(). 这种模式表明，半胱天冬酶可能会启动细胞死亡，但随着凋亡程序的进行，裂解半胱天蛋白酶-3的数量下降，而凋亡小体中的DNA片段持续存在。
饮食缺亮氨酸和自噬抑制联合诱导黑色素瘤caspase-3激活体内（A） 免疫组织化学分析显示胱天蛋白酶-3裂解体内H+E，用苏木精和伊红染色的肿瘤切片图像，其中毛细血管用箭头表示；TUNEL，用于TUNEL分析的肿瘤切片图像；D175裂解Caspase-3，肿瘤切片图像，用抗Asp-175位点特异性裂解Caspase-3抗体染色活性Caspase 3；D175裂解的Caspase-3+阻断肽，肿瘤切片图像，用预先与表位阻断肽孵育的抗Asp-175位点特异性裂解Caspase-3抗体染色活性Caspase-3；黑色素A，用人类黑素细胞特异性标记物抗黑色素A抗体染色的肿瘤切片图像。比例尺=100µm。（B） 肿瘤组织的代表性高倍显微照片，显示TUNEL阳性信号和D175裂解caspase-3阳性信号之间的地理相关性，毛细血管用箭头表示。比例尺=100µm。另请参见图S5.
除了小鼠毛细血管内皮细胞和肿瘤表面的薄层细胞外，肿瘤内的大多数活细胞都被人类特异性黑素细胞标记物黑素-A染色(和图S5C). 这些Melan-A阴性的小鼠细胞没有被裂解的caspase-3染色，这表明饮食中缺乏亮氨酸和氯喹的联合治疗不会影响肿瘤的非转化细胞(图S5C).
讨论
人们对营养敏感和代谢途径在肿瘤发生中的作用以及这些途径潜在的癌症治疗靶点越来越感兴趣。例如，自噬越来越被认为是真核细胞和生物体在营养物质缺乏期生存的重要方式(Boya等人，2005年;Degenhardt等人，2006年;Kuma等人，2004年)和小分子自噬抑制剂，如氯喹，在抗癌方面的应用引起了人们的兴趣（综述于(Rubinsztein等人，2007年)).
在研究癌细胞对单一必需氨基酸缺失的反应时，我们观察到，在所有研究的人类黑色素瘤细胞系中，缺失亮氨酸（而非其他必需氨基酸）会诱导细胞凋亡。大量证据表明，亮氨酸剥夺触发细胞凋亡，因为与其他类型的细胞不同，它不抑制mTORC1通路，因此不激活自噬。事实上，通常被认为是抗癌药物的mTORC1抑制剂雷帕霉素能够重新激活亮氨酸衍生黑色素瘤细胞的自噬并促进其生存。奇怪的是，mTORC1通路对黑色素瘤细胞中亮氨酸的提取有如此大的抵抗力，因为这种氨基酸是该通路的典型激活剂，并且它的缺失会抑制多种正常和转化细胞中的mTORC2信号(Guertin和Sabatini，2007年). mTORC1的氨基酸信号传导是一个深入研究的课题，但氨基酸感应机制仍然是一个谜。一旦了解了这种机制，可能会发现黑色素瘤细胞中的这种机制与其他细胞类型中的不同。黑色素瘤细胞中常见的RAS-MAPK通路的过度激活明显导致mTORC1对亮氨酸缺乏不敏感。到目前为止，我们的工作表明RAS-MEK信号干扰了mTORC1在溶酶体表面的正常亮氨酸敏感性定位。MAPK通路的一部分激酶，如ERK和p90 RSK1，磷酸化并抑制TSC2的功能，TSC2是一种肿瘤抑制因子，是mTORC1的负调控因子(Inoki等人，2003年;Ma等人，2005年;Roux等人，2004年;Tee等人，2003年). 然而，TSC2似乎在mTORC1的氨基酸信号传导中没有发挥主要作用(Byfield等人，2005年;Nobukuni等人，2005年;Smith等人，2005年)因此，MAPK通路可能通过TSC2诱导的依赖机制影响黑色素瘤细胞中mTORC1的亮氨酸敏感性。有趣的是，RAS途径在芽殖酵母和苍蝇中负向调节自噬，但尚不清楚TORC1途径是否参与这些生物体的自噬抑制(Berry和Baehrecke，2007年;Budovskaya等人，2004年).
单独的自噬抑制并不能在体外引发黑色素瘤细胞的凋亡，氯喹治疗在体内喂食对照饮食的小鼠中也未能显示出抗肿瘤作用。这可能是因为肿瘤内的大多数细胞能够获得超过生存所需的最低水平的细胞外亮氨酸。另一方面，在喂食无亮氨酸饮食的动物中，抑制自噬可能会导致从体内释放出很少的亮氨酸，从而使这种必需氨基酸的细胞水平降至生存所需的阈值以下。为了在当前研究中实施这种组合策略，我们使用氯喹来抑制自噬。然而，氯喹的一个警告是，作为一种溶酶体营养化合物，它不仅可以抑制溶酶体的自噬过程，还可以抑制溶菌体的非自噬相关功能。自噬所必需的蛋白质抑制剂，如蛋白酶ATG4和激酶ATG1/ULK1和VPS34，可能在未来被开发出来。通过RNAi，我们发现ATG1和VPS34对于确定黑色素瘤细胞对亮氨酸缺乏的敏感性非常重要。
为了去除黑色素瘤异种移植物中的亮氨酸，我们给小鼠喂食无亮氨酸饮食，这种饮食可以降低啮齿动物和人类的血浆亮氨酸浓度，而不会严重影响血胰岛素水平(Anthony等人，2004年;Guo和Cavener，2007年;Hambraeus等人，1976年). 在临床环境下，无亮氨酸饮食不太可能是消除肿瘤中亮氨酸的理想方法。在未来，可能通过静脉内输送专门降解亮氨酸的酶或亮氨酸摄取的小分子抑制剂。作为前者的模型，天冬酰胺酶（L-天冬酰胺酰胺水解酶）是FDA批准的一种酶，可将天冬酰胺水解为天冬氨酸，是治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）的成功方法。亮氨酸分解代谢途径中的酶，如BCAT（支链氨基转移酶）(Berg，2007年)，如果其底物特异性可以被设计为仅限于亮氨酸，则可以以类似的方式使用(Conway等人，2003年;Onuffer和Kirsch，1995年). 似乎也有许多转运体介导亮氨酸摄取(Broer，2008年)，而一些特征更好的药物，如LAT1，可能是可用药的。或者，获得与自噬抑制和营养剥夺对肿瘤细胞生存的协同作用的最简单策略可能是联合使用一种可以剥夺肿瘤细胞许多营养素的药物，例如血管生成阻滞剂，以及一种特定的自噬抑制剂。我们发现，在自噬抑制剂存在的情况下，当黑色素瘤细胞不仅缺乏亮氨酸，而且缺乏所有必需氨基酸时，就会触发胱天蛋白酶-3的激活，这支持了这一想法的可行性。
实验程序
材料
试剂来自以下来源：阿霉素、雷帕霉素和U-0126，来自Calbiochem和LC实验室；细胞培养级纯氨基酸、葡萄糖和西格玛氯喹；Invitrogen的JC-1染料；Vector Laboratories和Dako的免疫组织化学试剂盒；来自Open Biosystems的MEK1、ATG1和LC3的cDNA克隆；罗伯特·温伯格博士实验室（怀特黑德研究所）H-RAS-G12V的cDNA克隆；David Tuveson博士（英国癌症研究）的BRAF-WT、BRAF-Δ3、BRAF-V600E和BRAF-△3-V600E的cDNA克隆(Karreth等人，2009年); 慢病毒shRNA构建自RNAi联盟（Broad Institute）；来自美国研究产品的SQSTM1/p62抗体；抗ATG1/ULK1、Bcl-xL、caspase-3、cyclin D1、LC3、Melan-A、PARP、phospho-T202/Y204-ERK、ERK、phospha-T389 S6K1、S6K1和VPS34的抗体，以及圣克鲁斯生物技术公司的HRP-结合抗鼠、抗兔二级抗体和细胞信号技术。
细胞系和组织培养
细胞系取自美国类型培养收集。细胞培养基粉末和血清购自以下来源：Dulbecco的MEM（DMEM）、RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、透析胎牛血清、Invitrogen的热灭活胎牛血清；美国生物公司的无氨基酸、无葡萄糖RPMI-1640细胞在以下培养基中培养：含有10%IFS的DMEM中的HEK-293T细胞；含有10%FBS的DMEM中的A-2058、SK-MEL-3、SK-MEL-5、SK-MEL-28、MEL-ST和MEL-ST衍生物。为了进行存活试验，我们在剥夺细胞必需氨基酸时用20µM Q-VD-OPH或100µM Z-VAD-fmk处理细胞。
必需氨基酸剥夺协议
为了生产缺乏单一必需氨基酸的细胞培养基，我们通过补充葡萄糖和除氨基酸外的个别氨基酸，重建了无氨基酸、无葡萄糖的RPMI-1640培养基。在进行氨基酸剥夺实验的前一天，将细胞接种在完整的培养基中，使接种的细胞在实验当天达到约80%的汇合。为了剥夺细胞的单一氨基酸，我们用不含靶氨基酸的RPMI-1640培养基替换培养基两次，并孵育细胞，直到取样进行分析。
使用DsRed-LC3-GFP报告器进行自噬分析
为了开发双色自噬报告子，我们在DsRed和EGFP的cDNA之间插入了大鼠LC3（也称为ATG8）cDNA，以便Ds红色蛋白与LC3蛋白的N末端融合，并且该蛋白的C末端连接到EGFP。如有必要，我们在LC3的C末端附近的ATG4识别位点引入五个氨基酸的缺失（TALAV），以使嵌合蛋白对ATG4介导的裂解具有抗性。为了产生持续报告自噬活性的稳定细胞系，产生表达DsRed-LC3-GFP报告子的重组逆转录病毒，并用于感染靶细胞。自噬指数是GFP荧光强度中值相对于DsRed荧光强度中值相对变化的量度，计算公式为：自噬系数=100−（100 X（FL1/FL2）），其中FL1为荧光1（GFP荧光的中值荧光强度）FL2为荧光2（DsRed荧光的中值荧光强度）。请参见图S2了解关于自噬报告基因的开发和验证的详细信息。
流式细胞术分析
根据试剂盒制造商的说明（Roche），使用Annexin-V荧光素进行凋亡诱导分析。简单地说，收集培养细胞并在PBS中清洗一次，然后用Annexin-V-Fluorescin的现成溶液在含有碘化丙啶的HEPES缓冲液中培养。使用流式细胞仪分析样本。根据供应商的说明（Roche），使用对MOMP敏感的阳离子JC-1染料测量线粒体外膜渗透性（MOMP）的变化。JC-1在线粒体中表现出膜电位依赖性积累，表现为荧光发射从绿色（胞浆中的单体形式）转变为红色（线粒体中的聚集体）。简单地说，培养细胞在生长条件下用2µM JC-1染色15分钟，用PBS洗涤，并用流式细胞仪进行分析。必要时，以寡霉素为对照，针对不同的细胞类型优化JC-1的浓度。
免疫荧光分析
将Mel-ST和Mel-STMK细胞涂布在12孔组织培养板中的纤维连接蛋白涂层玻璃盖玻片上。24小时后，用PBS冲洗载玻片一次，并用加热至37°C的PBS中的4%多聚甲醛固定15分钟。用PBS冲洗玻片两次，用0.05%Triton X-100在PBS中渗透细胞5分钟。用PBS冲洗两次后，将载玻片与5%正常驴血清中的一级抗体在室温下孵育2小时，用PBS清洗四次，与驴产生的二级抗体（5%正常驴血中的1:400）在室温下在黑暗中孵育1小时，并用PBS洗涤四次。最后使用Vectashield（Vector Laboratories）将载玻片安装在玻璃盖玻片上，并在Perkin-Elmer旋转圆盘共焦显微镜系统上收集和分析图像。
人类异种移植瘤模型与饮食缺亮氨酸
免疫缺陷小鼠（NCR裸鼠，nu/nu；Taconic实验室）被保存在无病原体的设施中，如果没有其他规定，可以随意给予高压灭菌食物和水。将A-2058黑色素瘤细胞异种移植到6周龄免疫缺陷小鼠体内。简言之，1×106将黑色素瘤细胞重新悬浮在200µl培养基中，并在用异氟醚麻醉的小鼠上腹部皮下注射。肿瘤可以长到约100毫米三在大小和小鼠开始饮食亮氨酸限制使用一个无异量亮氨酸，合成饮食单独或与氯喹治疗。添加亮氨酸的等热量控制饮食和无亮氨酸合成饮食均来自Research diet，Inc.。根据一系列初步实验，每周两次以60 mg/kg体重腹腔注射氯喹。肿瘤体积估算公式为：体积=（2a×b）/2，其中a=最短肿瘤长度，b=最长肿瘤长度，单位为毫米。必要时，处死动物，采集肿瘤并用标准组织学和免疫组织化学方法进行分析。动物研究方案得到了麻省理工学院动物护理委员会的批准，所有实验都是根据麻省理理工学院的动物护理委员会和美国实验动物护理协会的官方指南进行的。
慢病毒shRNA介导的RNAi
对于基因敲除实验，我们从Broad Institute的RNAi Consortium（TRC）获得慢病毒shRNA构建物，并使用瞬时转染协议生产重组慢病毒。简单地说，我们根据TRC标准协议用慢病毒shRNA质粒和包装质粒（pdeltaVPR和pVSVG）转染HEK-293T细胞，并使用慢病毒上清液感染靶细胞(Moffat等人，2006年).
统计分析
实验结果通过Student t检验进行分析，并使用Prism软件（GraphPad software，Inc.）绘制图表。体外数据用平均值±s.d.表示，体内数据用平均值±s.e.m.表示。P<0.05被认为具有统计学意义。
亮点
缺乏亮氨酸后的缺陷自噬揭示了黑色素瘤细胞的易感性。
亮氨酸缺乏触发黑色素瘤细胞的caspase激活和凋亡。
mTORC1和MAPK通路决定了对亮氨酸剥夺的敏感性。
饮食缺亮氨酸和氯喹协同诱导体内细胞凋亡。
重要性
黑色素瘤是一种高度侵袭性癌症，需要额外的治疗。自噬是一种细胞保护机制，可以帮助癌细胞在营养限制条件下生存，是抗癌治疗的潜在靶点。然而，在临床前肿瘤模型中，仅抑制自噬迄今为止具有相对温和的抗肿瘤作用。在这里，我们表明，亮氨酸剥夺和自噬抑制联合诱导体外和体内由RAS-MEK途径驱动的人类黑色素瘤细胞的caspase依赖性死亡，而非非转化细胞的caspase依赖性死亡率。研究结果为开发针对黑色素瘤的自噬抑制剂的联合疗法奠定了基础。
