肿瘤干细胞与上皮-间充质转化（EMT）-表型细胞：它们是表亲还是双胞胎？

摘要

1.简介

上皮-间充质转化（EMT）最初被认为是胚胎发生的一个特征，对胚胎发育过程中的形态发生至关重要。最近它也被认为与早期肿瘤转化为侵袭性恶性肿瘤有关[1]. 越来越多的证据表明，肿瘤进展与EMT表型的获得密切相关，EMT表型允许肿瘤细胞获得浸润周围组织的能力，从而允许这些细胞在远处转移[2-4]. 大多数肿瘤的进展与间充质表型的获得有关，这伴随着上皮标记物表达的丧失和间充质分子标记物的上调，导致细胞运动性和侵袭性增加[5]. 这些过程与获得“癌症干细胞样细胞”表型（也称为“干细胞”或癌症干细胞（CSC）特征）相一致[三]，尽管这些术语不是同义词。肿瘤的发生和复发被认为与CSC或致癌细胞的生物学密切相关[6-8]. 越来越多的证据表明，由不同因素诱导的具有EMT表型的细胞是肿瘤干细胞的丰富来源[5,9-11]这表明CSC、癌干样细胞、癌诱导细胞和EMT表型细胞之间的生物学相似性。此外，EMT在肿瘤细胞中的诱导不仅促进肿瘤细胞的侵袭和转移，而且有助于耐药[12-15]这表明，这些细胞的分子特性将有助于开发新的治疗方法来彻底根除肿瘤，这必将提高癌症患者的总体生存率。

2.EMT在肿瘤进展和转移中的作用

EMT是上皮细胞发生显著形态变化的过程，其特征是从上皮性鹅卵石表型转变为细长的成纤维细胞表型[16]. EMT的过程包括细胞-细胞连接的拆卸[17]，肌动蛋白细胞骨架重组[18]增加细胞运动[1]和入侵[2]其特征是E-cadherin和闭塞小带-1（ZO-1）的下调和重新定位[19,20]β-catenin从细胞膜到细胞核的下调和移位，以及间充质分子标记物如波形蛋白的上调[18,21]、纤连蛋白和N-钙粘蛋白[1,4,12,16]. 在EMT过程中，具有规则细胞-细胞连接和粘附的非活动上皮细胞失去了细胞-细胞的连接，转化为个体、活动和侵袭性间充质表型细胞。EMT与癌症相关的想法最初遭到质疑，因为病理学家无法找到确凿证据支持人类肿瘤样本中存在EMT[22-25]. 然而，越来越多的证据表明，EMT过程在癌症进展和转移中至关重要[2,三,5,12,22,26-29]. 实体瘤的进展是通过EMT的空间和时间出现发生的，从而使肿瘤细胞获得更具侵袭性和转移性的表型。具有间充质表型的转移性肿瘤细胞被认为会发生逆转，即转移部位的间充质-上皮转化（MET），以获得相应原发肿瘤的病理学[12,22]. 这一过程是转移性肿瘤细胞在次要部位生长的关键步骤。最近的研究表明，原发性结肠癌及其相应的转移表现为混合上皮-间充质表型[2]. 肿瘤中心的细胞E-cadherin和胞质β-catenin仍呈阳性表达，外围的肿瘤细胞表现为表面E-cadherin缺失、波形蛋白上调和核β-catentin染色，这是EMT表型的典型特征[2,22]. 更重要的是，Chaffer等。选用膀胱癌TSU-pr1（T24）系列细胞株体内通过全身循环增加播种后的转移能力，并发现更多的转移亚系具有EMT特征[27]. 在前列腺癌中，耶茨等。对肝细胞和DU145或PC3细胞进行共培养，发现在共培养条件下，DU145和PC3细胞在接触的外周部位显示E-cadherin上调[30]. 尽管PC3细胞系是一种高度恶性的前列腺癌细胞系，来源于骨转移瘤，但大多数前列腺癌的EMT研究都使用PC3细胞[12]. 这些细胞株表现出细胞间粘附连接的分子标记物如E-cadherin的表达，并伴有上皮样形态，这与原发性上皮性肿瘤细胞的特征相一致。患者原发部位的前列腺癌细胞很可能在到达转移部位（例如PC3和DU145细胞最初来源的骨骼和大脑）时也获得了MET特征。这也可能与获得不完全上皮表型或混合表型有关，通常称为融合细胞表型[12,22]. 新的证据表明，EMT的过程是由细胞外信号（如胶原蛋白）和生长因子（包括转化生长因子-β（TGF-β）、成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）a、B和D）之间的分子相互作用触发的[31-35]. 在最近的一项研究中，Graham等。表明IGF-1可以激活PC3细胞中的EMT表型，这是由ZEB1（锌指E-box结合同源框1）的激活介导的[36]. 这些结果表明，细胞中EMT表型的改变有助于肿瘤的侵袭性。

3.癌干细胞（CSC）或癌干样细胞

肿瘤干细胞（CSC）是肿瘤内的细胞，具有自我更新和分化为组成整个肿瘤的异质癌细胞谱系的能力。这些肿瘤起始细胞可以提供一个细胞库，导致治疗后肿瘤复发。Dick及其同事首次在白血病细胞中发现CSC[37]. 他们发现只有一小部分带有CD34的白血病细胞⁺CD38细胞⁻细胞表面标记物被移植到严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠中，导致与原患者相似的播散模式和白血病细胞形态[37]. 最近，在乳腺癌、结肠癌、脑瘤和前列腺癌等实体肿瘤中发现了CSC[38-43]，Ricci-Vitiani等。发现10⁵CD133型⁻结肠癌细胞不诱导肿瘤形成。注入10⁶五周后，总结肠癌细胞再次悬浮在基质凝胶中，生成可见肿瘤，而注射3000 CD133⁺四周后细胞诱导可见肿瘤[40]. 奥布莱恩等。还发现只有262 CD133⁺结肠癌细胞可诱导严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠肿瘤形成[39]. 结果表明结肠癌起始细胞是CD133⁺结肠癌细胞。辛格等。分离脑肿瘤干细胞（BTSC），通过使用神经干细胞表面标记物CD133，从髓母细胞瘤与低度胶质瘤相比最具侵袭性的临床样本中提取自我更新能力增强的亚群[41,42]. 这些CD133⁺细胞可以在培养中分化为表型上与患者肿瘤相似的肿瘤细胞。他们还证明，注射100 CD133⁺细胞在NOD-SCID（非肥胖糖尿病，严重联合免疫缺陷）小鼠大脑中诱导肿瘤发生。在人类前列腺癌中，Patrawala等。使用CD44表面标记物从已建立的异种移植物中识别肿瘤起始细胞，并通过分类CD44使这些细胞富集⁺α2β1⁺单元格[44]. 由于大多数人类PCa具有成熟的管腔表型细胞，其特征是细胞角蛋白8/18、雄激素受体（AR）和前列腺特异性抗原（PSA）的表达，因此假设PCa的起源细胞是分化的管腔细胞。然而，PCa内有很高的表型异质性，包括转移部位，含有罕见的表型未分化细胞[45]. 尽管前列腺癌的起源细胞需要完全阐明，但越来越多的证据表明，肿瘤起始细胞在前列腺癌的进展和复发中起着关键作用[6-8,46,47]. 最近的研究表明，Oct4、Sox2、Nanog、lin28、Klf4和c-myc等多能性标记物的联合表达可以将体细胞重编程为多能性胚胎干细胞[48-50]这表明，在有癌基因的细胞中联合表达干细胞相关因子也可以诱导这些细胞处于未分化状态。有趣的是，顾等。发现从具有上皮表型的人前列腺标本中获得的细胞系通过hTERT永生化，并显示出胚胎干细胞标记物的表达，如Oct4、Nanog和Sox2[46]这与Oct4、Sox2、Nanog和c-myc在低分化肿瘤中过度表达的结果一致[51]. Nanog、Sox2和Oct4已被证明在癌症进展中发挥重要作用[52-55]. 最有趣的是，越来越多的证据表明，由不同因素诱导的EMT与转移有关，也与干细胞的生成有关[5,9-11,47].

4.EMT-表型细胞作为CSC的资源

大多数恶性肿瘤的进展与上皮分化的丧失和间充质表型的增加有关，其特征是细胞运动性和侵袭性增加[1]导致肿瘤转移[5]和耐药性[15]. 这些过程被认为与EMT有关[1,16,56,57]. 最近的研究表明，EMT不仅在肿瘤转移中起着关键作用，而且在肿瘤复发中也起着重要作用，这与CSC的生物学密切相关[14,58-64]. 莫雷尔等。证明CD44⁺CD24型^−/低干细胞样信号可由CD44生成^低的CD24型⁺细胞，非肿瘤性乳腺上皮细胞，通过激活Ras/MAPK信号通路。此外，他们还发现CD44⁺CD24型^−/低细胞表现出EMT表型，其特征是E-cadherin表达减少和vimentin表达增加。他们假设EMT的诱导可能与CD44的转换有关^低的CD24型⁺CD44细胞⁺CD24型^−/低干细胞样细胞。为此，CD24⁺用转化生长因子-β（一种潜在的EMT诱导剂）处理的细胞在处理8天后出现CD24细胞，伴随着间充质表型细胞的富集，表现为E-cadherin的丢失和波形蛋白表达的增加[65]. 马尼等。进一步证明，由众所周知的转录抑制因子twist或snail的表达诱导的非致瘤性永生化人类乳腺上皮细胞进入EMT表型，导致上皮表型的丧失和间充质表型的获得，同时获得CD44^高的/CD24型^低的表达模式和乳腺形成能力以及肿瘤起始能力的增强[9]. 然而，分离的CD44^高的/CD24型^低的来自正常和肿瘤人乳腺细胞的干样细胞表现出间充质形态，并表达间充质标记物，如波形蛋白和纤维连接蛋白[9]. 桑蒂斯特万等。观察到上皮性乳腺癌免疫反应诱导EMT导致肿瘤生长体内[11]. 有趣的是，由此产生的间充质肿瘤细胞具有CD44⁺CD24型^−/低表型具有重建上皮性肿瘤的能力并增加耐药性，这与乳腺CSC一致[11]. 最近，古普塔等。还发现，通过shRNA介导的E-cadherin表达下调，在转化的HMLER乳腺癌细胞中诱导EMT，显示CD44的数量增加^高的/CD24型^低的与上皮表型细胞相比，这些细胞表现出约100倍的乳腺球形成能力[66]. 更重要的是，他们发现EMT细胞显示出与CSC特征相关的耐药性增加[66]. 这些报告强烈提示EMT的诱导可以产生干细胞样细胞；然而，对这种过程的分子机制还没有完全了解。

5.将EMT与干细胞特征联系起来的miRNAs

众所周知，microRNAs（miRNAs）参与胚胎发育和癌症进展[67]已知这一过程与上皮性肿瘤细胞EMT表型的获得有关[68]. miRNAs是一种小的（19-24个核苷酸）非编码RNA分子，它通过与位于多个靶mRNAs的3′UTR中的种子序列相互作用来下调基因表达，从而导致mRNAs的翻译抑制或降解[69]. 进化上保守的miR-200家族参与了发育过程中分化过程的调控[68]. 最近的研究还表明，miR-200家族成员可以通过与ZEB1、ZEB2 mRNA的3′UTR序列结合来调节ZEB1和ZEB2的表达，从而调节EMT的过程[10,19,70-73]. ZEB1和ZEB2可以通过直接结合miR-200基因簇启动子中的E-box结合位点来抑制miR-200家族的表达，从而在EMT期间建立控制ZEB1、ZEB2和miR-200家庭表达的双负反馈环[74]. 此外，miR-200还被证明通过调节Bmi1、Notch1和Lin28B的表达与干细胞特征相关[75-77]. 下浓等。发现miR-200家族在CD44中受到强烈抑制⁺CD24型^−/低谱系人类乳腺癌细胞和正常人类乳腺干细胞，而miR-200c强烈抑制正常乳腺干细胞形成乳腺导管的能力和由人类乳腺CSC驱动的肿瘤形成体内[76]. 他们还发现miR-200c抑制了Bmi1的表达，这与干细胞自我更新的调节有关[76]. 韦尔纳等。结果表明，EMT激活物ZEB1在低分化人类胰腺癌中强烈表达，原位（胰腺内）注射表达ZEB1的Panc1细胞导致大的原发性肿瘤侵入胃、脾、小肠和大肠，在裸鼠体内转移到淋巴结和肝脏。相反，注射ZEB1基因敲除的细胞导致较小的原发性肿瘤，几乎没有局部浸润，也没有淋巴结和远处转移。更重要的是，他们还证明了ZEB1对胰腺癌和结直肠癌细胞的致瘤能力是必要的。他们发现ZEB1不仅抑制miR-200c的表达，还通过抑制miR-203和miR-183的表达来控制Bmi1、Sox2和Klf4等“干”相关因子的表达[77]. 因此，ZEB1有望成为肿瘤治疗的靶点。最近，杨等。揭示了Bmi1在Twist1诱导的头颈部鳞癌EMT中起着重要作用，Twistl的异位表达不仅增加了Bmi 1的表达，还诱导了干细胞标记物Sox2的表达。他们进一步表明，Twist1直接调节Bmi1的表达。Twist1和Bmi1通过上调干细胞因子和抑制E-cadherin和p16INK4a的表达，对促进EMT和肿瘤启动能力是相互必要的[63]. 这些报告强烈表明miR-200家族与EMT的调节、CSC和干细胞特性的维持直接相关。

在许多信号通路中，已知Akt在人类癌症的发生和发展中起着关键作用，并且它还与EMT表型的诱导有关[28]. 有趣的是，伊利奥普洛斯等。证明了Akt的三种亚型通过调节miR-200家族的表达在EMT的诱导中起着相反的作用。他们在Akt-1中分别表达每个亚型^−/−/Akt-2公司^−/−/阿克特-3^−/−细胞系，并发现在表达Akt-2的细胞中miR-200家族的表达显著降低[78]. 在转化生长因子-β（TGF-β）处理的MCF-10A细胞中，Akt-1的敲除也降低了miR-200的表达，并促进了转化生长因子β诱导的EMT，其特征是E-cadherin的表达降低，并通过增加乳房球形成能力诱导干样细胞表型。同时，MMTV-cErbB2/Akt1中的癌发生^−/−小鼠miR-200表达下调，侵袭力增强。因此，Akt-1和Akt-2的比值而不是Akt的总活性可以通过调节miR-200家族的表达来控制EMT的诱导和“干”的维持[78]. 最近，他们还发现miR-200家族在癌干细胞诱导过程中受到抑制，但在携带可诱导Src癌基因（ER-Src）的MCF-10A模型中没有转化，并且抑制miR-200b显示CSC形成增加。有趣的是，他们证明miR-200b直接靶向多梳阻遏复合物（PRC2）的亚单位Suz12[79]. PRC2包含Suz12、EZH2、EED和RbAp亚单位，已知通过染色质修饰参与基因阻遏的调节，这对维持胚胎和成人干细胞至关重要[80,81]. PRC2介导的E-cadherin基因抑制促进了EMT的诱导。此外，进一步的研究表明，PRC2靶基因被干细胞调节因子如Oct4、Sox2和Nanog共同占据[80-82]. 伊利普洛斯等。发现在CSC形成过程中miR-200的缺失会增加Suz12的表达，而miR-200b的再表达或Suz12缺失会阻碍乳腺球的形成和维持[79]. 相反，Suz12在转化细胞中的异位表达促进了CSC的生成[79]. 这些结果表明miR-200b-Suz12-E-cadherin通路参与了乳腺癌细胞CSC的维持和侵袭特性。

我们最近发现，血小板衍生生长因子D（PDGF-D）是一种新发现的生长因子，可以调节细胞增殖、转化、侵袭和血管生成等多种细胞过程，通过下调miR-200家族的表达，诱导PC3 PCa细胞系发生EMT，导致ZEB1、ZEB2和slug的表达增加[20,70,75]. 与亲代PC3细胞相比，接触纯化活性PDGF-D蛋白的PC3细胞中miR-200的表达显著降低，这与ZEB2和slug的过度表达有关。有趣的是，具有EMT表型的PDGF-D过表达PC3细胞中miR-200的重新表达导致ZEB1、ZEB2和slug的下调，同时上皮标记物如E-cadherin、stratifin、EpCAM、F11R和connexin 26也相应上调，波形蛋白的表达降低[70]. 从这些结果中，我们得出结论，miR-200的丢失在PDGF-D诱导PC3细胞EMT表型的获得中起着重要作用，并且miR-200重新表达可以导致EMT表型向MET表型的逆转。有趣的是，我们还发现，PDGF-D过度表达诱导的EMT表型PC3细胞具有干细胞样特征，其特征是小鼠的克隆原性增强、自我更新能力增强以及致瘤性增强，这与干细胞标记物如Notch-1、Sox2、Nanog、，10月4日和Lin28B。这些EMT型细胞还显示miR-200或let-7家族的表达降低。更重要的是，通过转染miR-200前体蛋白，通过强制重新表达miR-200来逆转EMT，显著抑制克隆形成和前列腺素形成能力，这与下调Notch-1和Lin28B表达有关[75]. 此外，击倒Lin28B显著增加let-7的表达，降低自我更新能力。同时，我们还发现ARCaP_M（M）与对照细胞相比，具有EMT表型的细胞也具有干细胞特征，这与Notch-1表达增加以及克隆形成和前列腺素形成能力增强一致（ARCaP_E类细胞）具有上皮表型。miR-200c在ARCaP中被抑制_M（M）具有EMT表型的细胞和miR-200c的重新表达将EMT表型逆转为MET表型，与Notch-1表达下调和ARCaP自我更新能力相关_M（M）单元格[75]这些报告强烈提示miRNAs，尤其是miR-200家族成员，将EMT表型与干细胞特征联系起来(表1).

越来越多的证据表明，不同因素诱导EMT可产生干细胞样细胞，其特点是自我更新和侵袭能力增强，耐药性高，与肿瘤转移和复发密切相关(图1).

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图1。

上皮-间充质转化（EMT）表型细胞的诱导产生具有耐药性特征的癌症干细胞。生长因子，包括FGF、EGF、PDGF-B和PDGF-D，以及TGF-β、Notch-1和Wnt等因子可以诱导EMT，而miR-200家族通过调节转录抑制因子ZEB1和ZEB2的表达来抑制EMT。EMT表型细胞获得干细胞特征，其特征是转移能力增强、自我更新能力增强和获得性耐药。这些细胞转移到远处并进行MET以产生与原发肿瘤表型相似的转移性肿瘤。

6.观点

癌症的常规治疗主要针对分化的肿瘤细胞；然而，在相当数量的患者中，癌细胞经过标准治疗后会获得耐药表型，导致肿瘤复发和转移，目前对其治疗有限或没有治疗方法。肿瘤的复发被认为与CSC或致癌细胞的生物学密切相关[6-8]. 越来越多的证据表明，肿瘤侵袭性特征的获得也与肿瘤细胞经历EMT表型的能力有关，这使肿瘤细胞能够突破组织结构所施加的结构限制[三,4,12,22]. EMT诱导产生的干细胞或CSC为癌症复发提供了资源，这些细胞具有高度耐药性[9,15,65,67,72]. 因此，重要的是确定哪些因素可以诱导EMT，并揭示这些因素在癌症进展过程中的机制作用，这强调了这些因素对于开发新的靶向治疗方法以彻底根除癌症的重要性。CSC、肿瘤干细胞和EMT表型细胞的分子理解和生物学特性将使我们能够筛选出可能导致选择性杀伤这些细胞以消除肿瘤复发的潜在药物。此外，可能导致这些细胞中丢失的特定miRNAs重新表达的药物也将使我们能够消除肿瘤发展、维持、复发和转移的“根源”细胞。因此，通过利用目前对CSC的分子理解和EMT过程来彻底根除癌症的前景似乎比以往任何时候都更加光明。

致谢

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