干细胞。作者手稿；PMC 2012年7月19日发布。
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miR-200调节PDGF-D介导的前列腺癌细胞上皮-间质转化、粘附和侵袭
密歇根州底特律韦恩州立大学医学院卡马诺斯癌症研究所病理学系
所有信件发送至：Fazlul H.Sarkar，病理学系，Barbara Ann Karmanos癌症研究所，韦恩州立大学医学院，740 Hudson Webber癌症研究中心，4100 John R，底特律，MI 48201。电话：313-576-8327；传真：313-576-8389；ude.enyaw.dem@rakrasf - 补充资料
支持数据S1。
GUID:C822BCAA-95CB-4E21-A74A-98774C9FB1D3
补充表S1。
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摘要
微RNA与肿瘤进展有关。最近的研究表明，miR-200家族通过靶向锌指电子盒结合同源盒1（ZEB1）和ZEB2来调节上皮-间充质转化（EMT）。我们实验室和其他实验室的新证据表明，EMT的过程可以由多种生长因子触发，如转化生长因子-β（TGF-β）和血小板衍生生长因子-D（PDGF-D）。此外，我们最近报道了前列腺癌细胞（PC3 PDGF-D细胞）中PDGF-D的过度表达导致EMT表型的获得，该模型为研究PDGF-D-信号转导和EMT之间的分子相互作用提供了机会。在这里，我们首次报道了PC3 PDGF-D细胞以及暴露于纯化活性PDGF-D蛋白的PC3细胞中miR-200家族的显著下调，导致ZEB1、ZEB2和snail2表达上调。有趣的是，miR-200b在PC3 PDGF-D细胞中的重新表达导致EMT表型的逆转，这与ZEB1、ZEB2和snail2表达的下调有关，这些结果与上皮标记物的基因表达增加一致。此外，用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞可抑制细胞迁移和侵袭，同时抑制细胞对培养表面的粘附和细胞分离。从这些结果中，我们得出结论，PDGF-D诱导PC3细胞EMT表型的获得在一定程度上是由于miR-200的抑制，任何上调miR-200表达的新策略都将成为治疗浸润性前列腺癌的一种有希望的方法。
关键词：血小板衍生生长因子-D（PDGF-D）、上皮-间充质转化（EMT）、miR-200、锌指电子盒结合同源异型盒1（ZEB1）、蜗牛2
介绍
上皮-间充质转化（EMT）是一个让人联想到“癌干细胞样细胞”特征的过程，鹅卵石表型的上皮细胞获得具有纺锤形成纤维细胞样形态的间充质细胞特征。这一过程涉及细胞-细胞连接的解体，包括E-cadherin和闭塞小带-1（ZO-1）的下调和重新定位，β-catenin从细胞膜向细胞核的下调和移位，肌动蛋白细胞骨架的重组和间充质分子标记物如vimentin、，纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白(1). 通常，上皮细胞通过调节细胞-细胞连接和粘附形成簇，如紧密连接、粘附连接、桥粒和缝隙连接，从而抑制单个细胞的细胞运动。相比之下，与上皮细胞相比，间充质细胞在细胞之间的粘附性较小，从而具有更多的活动性和侵袭性特征，有助于癌细胞的侵袭和转移(2).
在EMT的获得过程中，上皮标记物的丢失是一个关键过程，受重要的转录阻遏物调控。在过去几年中，已经鉴定出了几种转录抑制因子，包括锌指E盒结合同源异型盒1（ZEB1）、ZEB2/SIP1，它是双手锌指核因子δEF-1家族的成员，包括snail1、snail2/slug、Twist和E47。ZEB1已被证明是不同细胞系中各种诱导物诱导的EMT的关键介体(三–6). 转录因子ZEB1已被证明通过与目标基因启动子区内的ZEB型E盒（CACCTG）结合来调节基因表达，从而导致染色质凝聚和基因沉默(7). E-cadherin的表达受ZEB1负调控，这是EMT过程的基础(8). 最近的研究还表明，ZEB1通过抑制细胞极性因子的表达促进细胞迁移和肿瘤转移(9，10). ZEB2/SIP1已被证明下调许多编码上皮表型关键蛋白（包括E-cadherin）的基因的表达(11)上调波形蛋白的表达(12). Snail2/蛞蝓已被证明在生长因子诱导EMT中发挥核心作用(13，14)表明ZEB1、ZEB2和snail2是EMT诱导中的重要调节因子。
EMT过程可由多种生长因子触发，包括转化生长因子-β（TGF-β）和血小板衍生生长因子（PDGF）A、B和D(15–19). 众所周知，PDGF-D可以通过激活其同源受体PDGFR-β来调节许多细胞过程，包括侵袭和血管生成(20，21). 最近的一项研究表明，PDGF-D在人前列腺癌样本中的表达增加，这表明PDGF-D可能在人类前列腺癌的进展中发挥重要作用(22). 我们最近发现，用PDGF-D cDNA稳定转染PC3细胞可获得EMT表型，这一过程与侵袭性增加和体内PC3 PDGF-D细胞的肿瘤生长率(23). 该模型为进一步研究PDGF-D信号传导和EMT之间的分子相互作用，以及PC3-PDGF-D细胞获得EMT表型的确切机制提供了机会。
新的证据表明miR-200家族可以通过靶向E-box结合蛋白ZEB1和ZEB2来调节EMT的过程(4，5，24). microRNAs（miRNAs）是一种小分子（19-24核苷酸）非编码RNA分子，通过与多个靶mRNAs 3'UTR中的序列相互作用而下调基因表达，从而导致mRNAss的翻译抑制或降解(25). 众所周知，miRNAs参与胚胎发育和癌症进展，这一过程与上皮性肿瘤细胞EMT表型的获得有关(26). 此外，最近的研究表明，miR-200可以通过与ZEB1-SIP1 mRNA的3'-UTR序列结合来抑制ZEB1-CIP1的表达，ZEB1和ZEB2可以直接与miR-200基因簇的启动子结合，从而抑制miR-200的表达，建立双负反馈环控制EMT期间ZEB1-SIP1和miR-200家族的表达(4，24，27). 在这种情况下，发现调节miR-200或ZEB1-SIP1/ZEB2表达的因子对控制EMT非常重要，这些知识可能有助于设计治疗侵袭性前列腺癌的策略。因此，在当前研究中，我们试图验证我们的假设，即miR-200的缺失是否有助于PC3 PDGF-D细胞中观察到的EMT表型的获得，以及miR-200重新表达是否会导致PC3 PDGF-D细胞EMT表型逆转。我们进一步假设，上述过程可能由ZEB1、ZEB2和蜗牛2转录因子的放松调控表达介导。
我们发现，与亲代PC3细胞相比，在PC3 PDGF-D细胞以及接触纯化活性PDGF-D-蛋白的PC3细胞中，miR-200的表达显著降低，这与ZEB1、ZEB2和snail2的过度表达有关，并且用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞导致ZEB1的下调，ZEB2和snail2具有相应的上皮标记上调。PDGF-D在LNCaP细胞中的过度表达导致miR-200的表达降低并诱导EMT。从这些结果中，我们得出结论，miR-200的缺失在PDGF-D诱导LNCaP和PC3细胞EMT表型的获得中起着重要作用，并且miR-200重新表达可以导致EMT表型逆转为间质-上皮转换（MET）表型。这些结果提供了miR-200在PDGF-D过表达前列腺癌细胞EMT/MET过程中的机制作用。
材料和方法
细胞系和培养条件
通过用相应的空载体pcDNA3-Neo或pcDNA3-PDGF-D转染PC3和LNCaP细胞，产生过表达PDGF-D的稳定细胞系：如前所述(22)分别称为PC3-Neo或PC3-PDGF-D细胞和LNCaP-Neo或LNCaP PDGF-D-细胞。PC3、LNCaP和转染后的细胞系在RPMI 1640（Invitrogen、Carlsbad、CA、，网址：www.invitrogen.com)补充5%或10%胎牛血清（FBS）、2 mmol/L谷氨酰胺、10μmol/L Hepes、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素。所有细胞均保持在5%的CO中2-37°C下的增湿大气。
siRNA和转染
使用DharmaFECT3 siRNA转染试剂（DHARMACON，Lafayette，CO，网址：www.dharmacon.com). 转染24 h后去除培养基，然后将细胞在含有5%FBS的培养基中再培养24 h。制备细胞裂解物用于Western blot分析，提取总RNA用于实时RT-PCR分析。
蛋白质印迹分析
使用细胞质、细胞核提取物或总细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。通过在含有50 mM Tris–HCl、150 mM NaCl、1%NP-40、0.1%SDS、0.5%脱氧胆酸钠、2 mM氟化钠和2 mM Na的RIPA缓冲液中裂解细胞，获得不同实验的总细胞裂解物三VO4视频21 mM EDTA、1 mM EGTA和1×蛋白酶抑制剂混合物。根据我们实验室先前描述的方法制备细胞核和细胞质提取物(28)如前所述进行Western blotting(28).
转染microRNA前体（pre-miRNA）和特异性抗-miRNA（抑制剂）
PC3 PDGF-D细胞接种于3×1056孔板中每孔细胞数，转染前miR-200b或miRNA阴性对照#1（Ambion，Austin，TX，www.ambion.com网站)使用DharmaFECT3转染试剂（DHARMACON），最终浓度为20 nM。使用DharmaFECT3转染试剂（DHARMACON），在最终浓度为600 nM（miR-200a、miR-200b和miR-200c抗miRNAs（Ambion）各200 nM）的情况下，用特定抗miRNA（miRNA抑制剂）或抗miRNA对照物转染LNCaP细胞。转染3天后，细胞分裂，每隔3-4天用pre-miR-200b、miRNA抑制剂或对照重复转染指定时间。
实时RT-PCR
使用Trizol试剂分离总RNA。根据制造商的说明，使用逆转录系统（Invitrogen）逆转录一微克RNA。实时PCR用于定量mRNA表达。ZEB1、ZEB2、snail2、vimentin、上皮细胞粘附分子（EpCAM）、sciellin、stratifin、crumbs同源物3（CRB3）、连接蛋白26、F11受体（F11R、连接粘附分子1）和GAPDH的引物序列显示在补充信息
表S本研究中用于E-cadherin的引物序列已在前面描述(4)RNA的相对量归一化为GAPDH的表达。对于miRNA分析，根据制造商的说明，使用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion）分离总RNA。使用Taqman MicroRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，Fostor，CA，www.appliedbiosystems.com)使用Taqman MicroRNA Assay（Applied Biosystems）的miRNA-specific RT引物。通过使用来自Taqman MicroRNA分析（应用生物系统）的miRNA-specific Taqman MGB探针来测定miRNAs的水平。将miRNA的相对量标准化为RNU6B。
免疫荧光显微镜
免疫荧光染色按照我们实验室之前的描述进行(23). 简单地说，用4%多聚甲醛固定细胞，并在0.5%Triton x-100中渗透，然后用10%山羊血清封闭。将细胞与5%山羊血清中的抗E-钙粘蛋白（1:20）、ZO-1（1:50）或波形蛋白（预稀释）的抗体孵育1小时，并用Alex Fluro 594缀合的第二抗体（1:250）染色1小时。对于F-actin染色，细胞在4°C下与0.33μM Alexa Fluor 594卵磷脂孵育1h。载玻片用含有防褪色试剂和DAPI的固定介质固定。通过荧光显微镜观察细胞，并使用Advanced Sport软件（Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI）分析图像。
细胞附着和脱落分析
补充部分显示了细胞附着和脱落试验。
数据分析
本研究中的实验代表了三次或更多的重复。数据显示为平均值±SE。双尾学生的t吨测试用于组间比较。p<0.05的值被认为具有统计学意义。
结果
PDGF-D调节PC3细胞中转录因子ZEB1、ZEB2和snail2的表达
众所周知，转录抑制因子如ZEB1、ZEB2、snail1和snail2是诱导EMT过程的关键调节因子，因此我们首先确定了这些转录抑制因子在我们的细胞培养模型中的表达状态。结果表明，PC3 PDGF-D细胞中ZEB1、ZEB2和snail2的表达显著上调，伴随着E-cadherin的丢失，以及vimemtin和N-cadherin表达的增加。此外，我们发现与PC3 Neo细胞相比，PC3 PDGF-D细胞中snail1的表达显著降低，Twist水平没有显著变化(). 为了进一步确定ZEB1表达的亚细胞定位，我们测试了全细胞裂解物、细胞质和核提取物中的ZEB1水平。我们发现，与PC3 Neo细胞相比，全细胞裂解物和PC3 PDGF-D细胞细胞核中的ZEB1水平显著升高(). 这些结果表明，ZEB1主要位于核室中。最重要的是，与PC3 Neo细胞相比，PC3 PDGF-D细胞表现出细长/不规则的纤维母细胞形态，后者表现出上皮性鹅卵石样外观(). 这些结果与PC3 PDGF-D和PC3 Neo细胞中PDGF-D的表达状态一致().
PDGF-D过度表达诱导PC3细胞EMT。（A） Western blot分析显示第15代和第20代PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞中PDGF-D、转录抑制因子和其他间充质及上皮标记物的表达。（GAPDH蛋白用作蛋白质负荷控制）。（B） 从第8、15和20代PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞制备总细胞裂解物、胞浆和核提取物。Western blot结果显示ZEB1表达，主要定位于细胞核。GAPDH用于细胞裂解物和细胞溶质提取物的蛋白质负载控制，而视网膜母细胞瘤（RB）蛋白用于核提取物的蛋白质加载控制。（C） 细胞的显微照片显示：PC3-Neo细胞呈圆形上皮细胞形状（上面板），PC3-PDGF-D细胞呈成纤维细胞型表型（下面板）；原始放大倍数，200×。（N:PC3-Neo细胞，D:PC3-PDGF-D细胞，p8：第8代）。
PDGF-D过度表达抑制上皮特异性基因的表达
在本研究中，我们发现PDGF-D的过表达显著下调上皮特异性基因的表达，如E-cadherin、EpCAM、sciellin、stratifin、CRB3、connexin 26和F11R()伴随着ZEB1和ZEB2 mRNA水平的增加().
PC3细胞中PDGF-D的过度表达上调转录因子的表达，下调上皮特异性基因的表达。（A） 采用实时RT-PCR测定PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞上皮标记物的mRNA水平。相对mRNA水平根据GAPDH标准化。（B） 采用实时RT-PCR定量分析PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞中ZEB1、ZEB2和波形蛋白mRNA的表达。GAPDH用于内部控制，以校正RNA负载的潜在变化。（C） 实时RT-PCR结果显示，与对照siRNA相比，转染ZEB1 siRNA的PC3 PDGF-D中E-cadherin、F11R、CRB3和sciellin的mRNA水平增加。相对mRNA水平归一化为GAPDH。（D） 与对照siRNA相比，转染ZEB1 siRNA的PC3 PDGF-D中ZEB1、ZEB2和波形蛋白的mRNA水平降低。相对mRNA水平归一化为GAPDH。（E） 用ZEB1或对照siRNA转染PC3-PDGF-D细胞并孵育72小时。使用针对ZEB1和GAPDH的一级抗体进行蛋白质印迹分析。GAPDH用于蛋白质负荷控制。*，与对照细胞相比，p<0.05，**，p<0.01。（Neo:PC3 Neo细胞，PDGF-D:PC3 PDGF-D细胞，Con：对照，E-cad:E-钙粘蛋白，Vim：波形蛋白）。
为了进一步验证ZEB1是否可以抑制这些上皮标记物的表达，我们用ZEB1特异性siRNA转染PC3 PDGF-D细胞来敲除ZEB1。我们的结果表明，敲除ZEB1显著增加了E-cadherin、F11R、CRB3和sciellin的mRNA水平()表明ZEB1负责调控这些与PC3 PDGF-D细胞EMT表型获得相关的基因。此外，结果表明，用ZEB1 siRNA转染细胞可有效降低ZEB1在mRNA和蛋白质水平的表达；然而，由于目前尚不清楚的原因，我们发现ZEB1的敲除降低了ZEB2的mRNA表达，尽管这一发现与其他研究者的结果一致(29).
miR-200有助于调节PC3 PDGF-D细胞中的上皮标记基因，部分是通过调节ZEB1、ZEB2和蜗牛2
为了测试miR-200是否有助于PC3-PDGF-D细胞中上皮标记基因的调节，我们首先测定了miR-200在PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞中的表达水平。我们发现，与PC3-Neo细胞相比，miR-200a、miR-200b和miR-200c在PC3-PDGF-D细胞中的表达显著下调，而miR-16水平的表达没有显著变化().
miR-200调节与细胞极性、紧密连接、桥粒、缝隙连接和细胞表面受体相关的转录因子和蛋白表达。（A） 使用miRNA-特异性Taqman MGB探针和引物测定PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞中miR-200a、miR-200b、miR-200 c和miR-16的水平。miRNA的相对量归一化为RNU6B。（B） Western blot结果显示，与转染对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞相比，转染miR-200b的PC3细胞中ZEB1、ZEB2、snail2和vimentin的表达受到明显抑制，而E-cadherin的表达增加。（C） 与阴性对照miRNA转染相比，使用实时RT-PCR定量转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中ZEB1、ZEB2、snail2和vimentin的mRNA水平以及E-cadherin、stratifin、EpCAM、F11R和connexin 26的mRNA。相对mRNA水平归一化为GAPDH。（N：阴性对照miRNA，M：miR-200b，Neg：阴性对照micRNA，200a，200b，200c:miR-200a，miR-200bmiR-200c）。
为了从机理上研究miR-200在EMT过程中对ZEB1和ZEB2的调节作用，我们用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞，随后测定转录抑制因子和上皮标记基因的表达状态。我们发现，与转染对照miRNA的细胞相比，转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中不仅ZEB1和ZEB2的表达也显著降低，这与上皮标记基因如E-cadherin、stratin、EpCAM、F11R和connexin 26的表达增强相一致(). 这些结果清楚地表明，miR-200b的缺失有助于ZEB1、ZEB2和蜗牛2的诱导；导致PDGF-D过表达PC3细胞EMT表型获得过程中上皮标记因子负调控。
miR-200b的再表达诱导PC3-PDGF-D细胞的间充质-上皮转化（MET）
由于miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞导致上皮标记基因表达上调，我们试图评估这些细胞中EMT表型是否逆转。正如预期的那样，我们发现转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞在转染3天后表现出圆形形态并粘附在一起(). 免疫荧光染色结果显示，E-cadherin的表达显著增加，主要位于细胞-细胞连接处的细胞膜上(). 同时，我们发现在miR-200b转染的PC3 PDGF-D细胞中，ZO-1蛋白定位于紧密连接处的细胞膜上。相反，ZO-1在转染对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞的紧密连接处被破坏，如此外，转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中间充质标志物的表达和分布模式发生了改变。我们发现转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中波形蛋白的表达显著降低(). 我们还发现F-actin的表达模式发生了变化。在转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中观察到具有上皮表型特征的皮质肌动蛋白模式，而肌动蛋白应激纤维与转染对照miRNA的PC3 PD GF-D的间充质表型特征一致(). 这些结果表明，在PC3 PDGF-D细胞中发现的miR-200表达缺失有助于ZEB1、ZEB2和snail2的上调，导致上皮标记基因的下调表达和EMT表型的获得，并且这个过程可以逆转（MET表型的获取）通过在PC3 PDGF-D细胞中重新表达miR-200b。
MiR-200b逆转PC3 PDGF-D细胞的EMT表型。（A） 细胞照片显示：转染阴性对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞表现为成纤维细胞型表型（上图），转染miR-200b的PC3 PDGF-D电池表现为圆形上皮细胞形状，细胞形成簇状（下图）。原始放大倍数，200倍。转染21天后，用阴性对照miRNA或miR-200b转染的PC3 PDGF-D细胞进行E-cadherin（B）、ZO-1（C）、vimentin（D）表达的免疫染色，或用Alexa Fluor 594指骨样蛋白进行F-actin（E）染色，用DAPI进行DNA染色以显示细胞核，如方法部分所述。箭头指示上皮和间充质标记的表达或位置的变化。原始放大倍数，200×。
miR-200b抑制PC3 PDGF-D细胞的粘附和侵袭
为了证明miR-200b是否会影响PC3 PDGF-D细胞的行为，我们测试了细胞迁移和侵袭，我们发现用miR-200a转染PC3 PDGF-D细胞可以显著抑制PC3 PDGD细胞的迁移和侵袭(). 众所周知，细胞在生长环境中从基质中脱离，并附着在次级部位是转移过程中细胞迁移和侵袭的“标志”。有趣的是，我们发现PC3 PDGF-D细胞表现出更强的分离和附着(). 更重要的是，与对照miRNA转染相比，用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞显著减少了细胞的分离和附着(). 这些结果清楚地表明，miR-200b的重新表达通过EMT向MET表型的逆转抑制PC3 PDGF-D细胞的迁移和侵袭。因此，我们相信，通过新的治疗策略，miR-200b可以在侵袭性前列腺癌中重新表达，这将成为未来治疗侵袭性和转移性前列腺癌的有用方法。然而，问题仍然存在，PDGF-D实际上是否负责PC3细胞EMT特征的获得，以及miR-200的抑制是否与该过程有机械联系。因此，我们评估了纯化的活性PDGF-D蛋白处理对PC3细胞的影响。
MiR-200b抑制PC3 PDGF-D细胞的迁移和侵袭，减少其粘附和脱落。（A） 使用24孔Transwell渗透支架和8μM孔测定miR-200b对PC3 PDGF-D细胞迁移和侵袭的影响。在侵袭试验中，将转染miR-200b或对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞接种到涂有生长因子减少型Matrigel的Transwell插入物中。对于迁移试验，将转染miR-200b或对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞接种到未涂有Matrigel的Transwell插入物中。培养24小时后，用4μg/ml Calcein AM在37°C的PBS中染色1小时。在ULTRA多功能微孔板阅读器中以485/530 nm的激发/发射波长读取插入物下侧细胞的荧光。显示了相对荧光值。这些值表示入侵或迁移细胞的相对数量。面板（B）和（C）显示PDGF-D的过度表达分别显著增加PC3细胞的粘附和脱落。（D） 用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞可显著抑制转染15天后PC3 PDGF-D细胞的附着和脱落。n=4.*，与对照细胞相比，p<0.05，**，p<0.01。
PDGF-D蛋白治疗抑制miR-200家族的表达并诱导EMT特征
为了进一步验证PDGF-D是否确实通过调节miR-200家族的表达来诱导PC3细胞的EMT表型，我们测定了miR-200家系的表达水平，并评估了ZEB1、ZEB2、snail2、，用纯化的PDGF-D活性形式慢性处理PC3细胞中的波形蛋白和E-钙粘蛋白。用纯化的PDGF-D蛋白处理细胞导致miR-200a、miR-200b和miR-200c的表达显著抑制()这与从PC3 PDGF-D细胞获得的结果一致。此外，我们还发现PDGF-D蛋白治疗显著增加了ZEB2、蜗牛2和波形蛋白在mRNA水平的表达，同时降低了E-cadherin在mRNA和蛋白水平的表达(). 最重要的是，PDGF-D处理显著增强了PC3细胞的分离和迁移()这表明PDGF-D确实负责PC3细胞EMT表型的诱导，这在一定程度上是通过下调miR-200表达及其靶基因的调节来介导的。
纯化的活性PDGF-D治疗下调miR-200家族的表达并诱导EMT。（A） 使用Trizol试剂分离总RNA。通过使用miRNA特异性Taqman MGB探针和引物测定miRNA水平。miRNA的相对量归一化为RNU6B。（B） 用实时RT-PCR定量检测纯化活性PDGF-D蛋白处理4周的PC3细胞与对照组PC3细胞中ZEB1、ZEB2、snail2、E-cadherin和vimentin mRNA的表达。相对mRNA水平根据GAPDH标准化。用纯化的活性PDGF-D处理Panel（C）和（D）PC3细胞10或20天，然后制备细胞裂解物。Western blot分析显示，ZEB2表达增加，E-cadherin表达降低，呈剂量依赖性。（E） 测定纯化活性PDGF-D处理对PC3细胞脱附的影响，结果表明，PDGF-D4周处理后PC3细胞的脱附明显增加。（F） 使用24孔Transwell渗透支架和8μM孔测定纯化活性PDGF-D处理对PC3细胞迁移的影响。显示了相对荧光值。这些值表示迁移的单元格的相对数量。*，与对照组相比，p<0.05，**，p<0.01。
LNCaP细胞过度表达PDGF-D诱导EMT
为了证明PDGF-D能否在不同前列腺癌细胞系中诱导EMT，我们通过用PDGF-D质粒转染LNCaP细胞，建立了过表达PDGF-D的LNCaP-稳定细胞系。我们发现PDGF-D在LNCaP细胞中的过度表达导致ZO-1（上皮标记物）的表达显著降低，波形蛋白和纤维连接蛋白的表达增强()伴随着miRNA miR-200b和miR-200c水平的降低(). 更有趣的是，我们发现LNCaP细胞PDGF-D的mRNA水平显著低于PC3细胞()而LNCaP细胞中miR-200，尤其是miR-200c的水平显著高于PC3细胞(). 众所周知，LNCaP细胞比PC3细胞侵袭性小。为了研究miR-200是否有助于调节LNCaP细胞的侵袭，我们用抗miR-200a、miR-200b和miR-200c转染LNCaP细胞并进行侵袭实验。结果表明，与转染抗miRNA对照的细胞相比，转染抗-miR-200a、miR-200b和miR-200c的LNCaP细胞能显著增加细胞侵袭力(). 这些结果清楚地表明，PDGF-D的过度表达可以通过调节miR-200家族在PC3细胞和LNCaP细胞中的表达，部分诱导EMT介导。
PDGF-D在LNCaP细胞中过度表达可诱导EMT特征。（A） Western blot分析显示，与LNCaP-Neo细胞（GAPDH蛋白用作蛋白负荷控制）相比，LNCaP PDGF-D细胞（PDGF-D-过表达细胞）中ZO-1、波形蛋白、纤维连接蛋白的表达以及PDGF-D的水平。（B） 使用miRNA-特异性Taqman MGB探针和引物测定LNCaP PDGF-D细胞（PDGF-D）和LNCaP-Neo细胞（Neo）中miR-200a、miR-200b和miR-200c的水平。miRNA的相对量归一化为RNU6B。（C） 实时RT-PCR检测PC3和LNCaP细胞PDGF-D mRNA水平。相对mRNA水平根据GAPDH标准化。（D） 使用miRNA-specific Taqman MGB探针和引物测定PC3和LNCaP细胞中miR-200a、miR-200b和miR-200c的水平。miRNA的相对量归一化为RNU6B。（E） 在侵袭试验中，将转染抗miR-200a、miR-200b和miR-200c（抑制剂）或抗miRNA对照的LNCaP细胞接种到涂有生长因子减少型Matrigel的Transwell插入物中。培养24小时后，用4μg/ml Calcein AM在37°C的PBS中染色1小时。插入物底部细胞的荧光在485/530 nm激发/发射波长的ULTRA多功能微板阅读器中读取。显示了相对荧光值。这些值代表入侵细胞的比较值。[*，p<0.05，**，与对照组相比p<0.01。N:LNCaP Neo细胞，D:LNCa p PDGF-D细胞，con:抗miRNA对照，200abc:ant-miR-200a，miR-200b和miR-200c（miRNA抑制剂）]。
讨论
PDGF-D已被证明在许多肿瘤细胞系中表达(30，31)前列腺肿瘤组织中(21，22)提示PDGF-D在前列腺癌的发生发展中起重要作用。在我们之前的研究中，我们报道PDGF-D的持续过度表达是导致具有更大侵袭性特征的PC3细胞获得EMT表型和异种移植模型中肿瘤生长率增加的原因(23，32). 然而，PDGF-D在肿瘤发生和前列腺癌进展中的机制作用尚待阐明。上皮性肿瘤细胞EMT表型的获得被认为在肿瘤进展过程中增加肿瘤细胞的侵袭和转移行为中起着关键作用，这一过程令人想起“肿瘤干细胞”的特征。包括ZEB和snail家族在内的转录抑制因子与各种因素诱导的EMT表型的诱导密切相关。在我们当前的研究中，我们发现PC3 PDGF-D细胞中ZEB1、ZEB2和snail2/slug的表达显著增加，这与这些细胞的EMT特征一致，同时上皮标记物如E-cadherin、EpCAM、sciellin、stratifin、CRB3、connexin 26和F11R的表达减少。
为了进一步了解ZEB1是否能抑制上述上皮标记基因的表达，我们用ZEB1特异性siRNA转染PC3 PDGF-D细胞，从而抑制了ZEB1的表达。用ZEB1-siRNA转导PC3 PDGF-D细胞导致E-cadherin、CRB3、sciellin和F11R的表达增加，所有这些都是上皮细胞的标记。然而，通过特异性siRNA敲除ZEB1不仅降低了ZEB1的表达，而且下调了ZEB2的mRNA水平，这与其他研究人员报道的结果一致(24，29). 总之，这些结果表明，转录因子ZEB1、ZEB2和snail2/slug可以介导PC3 PDGF-D细胞中观察到的EMT表型的诱导，并且特定转录因子的下调可能被证明有助于EMT表型逆转。
人们还很容易推测，这些转录因子可以通过新的机制在细胞中进行调节。事实上，最近的研究表明，microRNA，特别是miR-200家族，可以通过靶向ZEB1和ZEB2 mRNA的3'UTR来抑制ZEB1与ZEB2的表达，从而调节EMT的过程(4，5，24，33). 细胞内成熟miRNA的水平受许多复杂步骤的调节，其中p68 RNA解旋酶是将初级microRNA加工成microRNA前体所必需的(34). 有趣的是，PDGF-B对Y593处p68 RNA解旋酶的磷酸化已被证明介导EMT的诱导(19)提示PDGF-B可以通过磷酸化p68 RNA解旋酶调节miRNAs的表达来诱导EMT。
这些诱人且新兴的证据表明，在EMT过程中，miRNAs对mRNAs的调节，促使我们研究miR-200家族是否在PDGF-D诱导的前列腺癌细胞EMT中发挥作用，并进一步评估我们的细胞培养模型系统中的EMT过程是否也受ZEB1的调节，ZEB2和蜗牛2转录因子。我们发现，与对照细胞相比，在LNCaP PDGF-D和PC3 PDGF-D细胞以及接触PDGF-D-蛋白的PC3细胞中，miR-200a、miR-200b和miR-200c的表达显著降低，表明miR-200家族可能调节我们模型中的EMT过程。ZEB1包含miR-200a的三个假定结合位点，miR-200b/miR-200c的五个推定结合位点(4，33)，ZEB2含有三个miR-200a的推定结合位点和六个miR-200b的推定结合位点(4). 此外，我们发现在PC3细胞中，miR-200b的水平比miR-200c高8倍，这表明miR-200b可能在ZEB1和ZEB2表达的负调控中发挥核心作用，因此miR-200b的缺失导致ZEB1和ZEB2的上调，导致PDGF-D诱导的EMT的获得。因此，我们选择通过转染研究在PC3 PDGF-D细胞中重新表达miR-200b，以进一步了解ZEB1和ZEB2的调节机制以及miR-200a重新表达对EMT表型及其生物学后果的影响。用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞可显著降低ZEB1、ZEB2和snail2在mRNA和蛋白水平的表达，同时上皮标记物如E-cadherin、stratifin、CRB3、EpCAM、F11R和connexin 26的表达也随之增加。此外，转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞显示出上皮表型，这表明miR-200a的缺失有助于EMT表型的获得，miR-200c的重新表达可能导致EMT表型向MET表型的逆转。
EMT的过程与细胞迁移和侵袭有关，在PC3 PDGF-D细胞中miR-200b的重新表达导致EMT表型的逆转。在本研究中，我们发现用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞可显著抑制PC3 PDGF-D细胞的迁移和侵袭。众所周知，癌细胞的转移过程需要细胞从起源部位分离、灌注、通过血管和淋巴管移位、外渗、附着到次要部位和定植。此外，细胞从基底膜（BM）脱离和重新附着在细胞迁移和侵袭以及肿瘤细胞转移过程中起着关键作用。有趣的是，我们发现PC3 PDGF-D细胞在细胞从培养表面脱落和附着到培养表面方面表现出显著增强。更重要的是，用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞显著降低了PC3 PDGF-D细胞附着于培养表面和从培养表面分离的能力，我们的结果与miR-200b在PC3 PDGD细胞中重新表达的作用一致，EMT逆转为MET特征，具有较小的侵袭性表型。更有趣的是，侵袭力较小的LNCaP细胞内源性PDGF-D表达较低，miR-200水平较高，并且PDGF-D在LNCaP细胞中的过度表达导致miR-200表达下调，这与EMT特征有关。
我们早期的研究结果表明，mTOR和NF-κB通路在PC3细胞PDGF-D过度表达诱导EMT中发挥关键作用(23). 在目前的研究中，我们发现miR-200，特别是miR-200b的丢失在一定程度上是PC3 PDGF-D细胞EMT诱导的原因。众所周知，NF-κB通过上调ZEB1和ZEB2的转录抑制物功能，在介导不同因子诱导的EMT过程中发挥重要作用(29，35)通过与miR-200启动子的E-box序列结合进而抑制miR-200家族的表达(27，33). 更有趣的是，miR-200可以通过与ZEB1和ZEB2 mRNA的3'-UTR相互作用下调ZEB1与ZEB2的表达(4，27). 此外，mTOR通路通过调节GSK-3β磷酸化间接调节NF-κB活性(23). 这些结果还表明miR-200和ZEB1/ZEB2之间存在双负反馈环，即使在诱导信号停止后，也可以维持EMT表型，诱导信号可能成为EMT逆转的关键靶点。总之，我们的结果与miR-200b的重新表达可以逆转PDGF-D诱导的EMT表型的发现相一致，在此过程中，mTOR通路可以通过调节GSK-3β磷酸化间接调节NF-κB活性，从而在miR-200的调节功能中建立了一个机制联系，尽管需要进一步的机制研究。
为了进一步证明PDGF-D是否确实能够通过调节miR-200家族的表达来诱导PC3细胞的EMT表型，我们分析了经纯化PDGF-D活性形式长期处理的PC3细胞中miR-200家族、转录抑制物和EMT分子标记的表达水平。我们发现，用纯化PDGF-D蛋白处理细胞后，miR-200a、miR-200b和miR-200c的表达受到显著抑制，并且显著增加了ZEB2、Snail2和vimentin在mRNA水平的表达，同时伴随着E-cadherin的表达降低。最重要的是，PDGF-D治疗显著增强了PC3细胞的细胞分离和迁移，表明PDGF-D确实负责PC3细胞EMT表型的诱导，这部分是通过下调miR-200表达和调节靶基因来介导的。然而，我们发现，与PDGF-D转染的PC3细胞相比，PC3细胞长期暴露于PDGF-D蛋白不足以诱导显著的形态学变化。该观察结果与我们之前的发现一致，即PDGF-D转染细胞在早期传代中保留了上皮特征，而EMT特征仅在后期传代中可见（大于第7代），提示慢性接触高浓度PDGF-D对PC3细胞EMT表型的诱导和维持是必需的。另一种解释可能是，PDGF-D的作用存在一种内源性机制，与PC3 PDGF-D细胞中细胞内合成的PDGF-D-相比，当细胞被纯化的PDGF-D外源性处理时，该机制可能不起作用。有趣的是，最近的研究表明，许多生长因子，如VEGF、FGF、EGF和PDGF，具有脑内信号转导机制(36–39)这可能是我们研究中PDGF-D过度表达导致EMT的机制之一。
总结
总之，我们开发了一个细胞培养模型，用于了解EMT的分子调控及其对MET表型的逆转。更重要的是，我们发现PDGF-D可以诱导EMT思维调节miR-200家族的表达，这与ZEB1、ZEB2和蜗牛2的放松调控有关。基于我们的新发现，我们认为通过创新方法在人类前列腺癌中重新表达miR-200b可能有助于设计治疗侵袭性和转移性前列腺癌的策略。
致谢
拨款支持：这项工作的部分资金来自NIH国家癌症研究所的拨款（5R01CA108535给FHS）。这项工作也部分由Puschelberg基金会资助。
脚注
孔德娟：构思和设计、执行、数据收集和数据分析、手稿撰写
李一伟：实验设计、数据分析、手稿撰写
王志伟：实验设计和执行以及数据分析
桑吉夫·班纳吉：实验设计、执行和数据分析
阿米尔·艾哈迈德：实验执行和数据收集
Hyeong-Rhe Choi Kim：LNCaP-PDGF-D和PC3-PDGF-D-细胞系的建立及实验设计
法兹鲁·萨卡尔（Fazlul H.Sarkar）：首席研究员、构思和设计、实验室设施和财务支持、实验设计、数据收集和解释、手稿撰写和手稿最终批准。
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