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.2009年8月；27(8):1712-21.
doi:10.1002/stem.101。

miR-200调节PDGF-D介导的前列腺癌细胞的上皮-间质转化、粘附和侵袭

德胡安·孔 1, 李一伟, 王志伟, 桑吉夫·巴纳吉, 阿米尔·艾哈迈德, Hyeong-Rhe Choi Kim先生, 法兹鲁·萨卡尔
附属公司

miR-200调节PDGF-D介导的前列腺癌细胞的上皮-间质转化、粘附和侵袭

德胡安·孔等。 干细胞. 2009年8月.

摘要

微RNA与肿瘤进展有关。最近的研究表明，miR-200家族通过靶向锌指E-box结合同源异型盒1（ZEB1）和ZEB2来调节上皮-间充质转化（EMT）。我们实验室和其他实验室的新证据表明，EMT的过程可以由多种生长因子触发，例如转化生长因子β和血小板衍生生长因子D（PDGF-D）。此外，我们最近报道了前列腺癌细胞（PC3 PDGF-D细胞）中PDGF-D的过度表达导致EMT表型的获得，该模型为研究PDGF-D-信号转导和EMT之间的分子相互作用提供了机会。在这里，我们首次报道了PC3 PDGF-D细胞以及接触纯化活性PDGF-D-蛋白的PC3细胞中miR-200家族的显著下调，导致ZEB1、ZEB2和Snail2表达上调。有趣的是，miR-200b在PC3 PDGF-D细胞中的重新表达导致EMT表型的逆转，这与ZEB1、ZEB2和Snail2表达的下调有关，这些结果与上皮标记物的更高表达水平一致。此外，用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞可抑制细胞迁移和侵袭，同时抑制细胞对培养表面的粘附和细胞分离。从这些结果中，我们得出结论，PDGF-D诱导PC3细胞EMT表型的获得在一定程度上是miR-200抑制的结果，任何上调miR-200的新策略都将成为治疗侵袭性前列腺癌的一种有希望的方法。

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数字

图1
图1
PDGF-D过度表达诱导PC3细胞EMT。（A） Western blot分析显示第15代和第20代PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞中PDGF-D、转录抑制因子和其他间充质及上皮标记物的表达。（GAPDH蛋白用作蛋白质负荷控制）。（B） 从第8、15和20代PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞制备总细胞裂解物、胞浆和核提取物。Western blot结果显示ZEB1表达，主要定位于细胞核。GAPDH用于细胞裂解物和细胞溶质提取物的蛋白质负载控制，而视网膜母细胞瘤（RB）蛋白用于核提取物的蛋白质加载控制。（C） 细胞的显微照片显示：PC3-Neo细胞呈圆形上皮细胞形状（上面板），PC3-PDGF-D细胞呈成纤维细胞型表型（下面板）；原始放大倍数，200×。（N:PC3-Neo细胞，D:PC3-PDGF-D细胞，p8：第8代）。
图2
图2
PC3细胞中PDGF-D的过度表达上调转录因子的表达，下调上皮特异性基因的表达。（A） 采用实时RT-PCR测定PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞上皮标记物的mRNA水平。相对mRNA水平根据GAPDH标准化。（B） 采用实时RT-PCR定量分析PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞中ZEB1、ZEB2和波形蛋白mRNA的表达。GAPDH用于内部控制，以校正RNA负载的潜在变化。（C） 实时RT-PCR结果显示，与对照siRNA相比，转染ZEB1 siRNA的PC3 PDGF-D中E-cadherin、F11R、CRB3和sciellin的mRNA水平增加。相对mRNA水平归一化为GAPDH。（D） 与对照siRNA相比，转染ZEB1 siRNA的PC3 PDGF-D中ZEB1、ZEB2和波形蛋白的mRNA水平降低。相对mRNA水平归一化为GAPDH。（E） 用ZEB1或对照siRNA转染PC3-PDGF-D细胞并孵育72小时。使用针对ZEB1和GAPDH的一级抗体进行蛋白质印迹分析。GAPDH用于蛋白质负荷控制。*，与对照细胞相比，p<0.05，**，p<0.01。（Neo:PC3 Neo细胞，PDGF-D:PC3 PDGF-D细胞，Con：对照，E-cad:E-钙粘蛋白，Vim：波形蛋白）。
图3
图3
miR-200调节与细胞极性、紧密连接、桥粒、缝隙连接和细胞表面受体相关的转录因子和蛋白表达。（A） 使用miRNA-特异性Taqman MGB探针和引物测定PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞中miR-200a、miR-200b、miR-200 c和miR-16的水平。miRNA的相对量归一化为RNU6B。（B） Western blot结果显示，与转染对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞相比，转染miR-200b的PC3细胞中ZEB1、ZEB2、snail2和vimentin的表达受到明显抑制，而E-cadherin的表达增加。（C） 与阴性对照miRNA转染相比，使用实时RT-PCR定量转染miR-200b的PC3 PDGF-D细胞中ZEB1、ZEB2、snail2和vimentin的mRNA水平以及E-cadherin、stratifin、EpCAM、F11R和connexin 26的mRNA。相对mRNA水平归一化为GAPDH。（N：阴性对照miRNA，M：miR-200b，Neg：阴性对照micRNA，200a，200b，200c:miR-200a，miR-200bmiR-200c）。
图4
图4
MiR-200b逆转PC3 PDGF-D细胞的EMT表型。（A） 细胞照片显示：转染阴性对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞表现为成纤维细胞型表型（上图），转染miR-200b的PC3 PDGF-D电池表现为圆形上皮细胞形状，细胞形成簇状（下图）。原始放大倍数，200倍。转染21天后，用阴性对照miRNA或miR-200b转染的PC3 PDGF-D细胞进行E-cadherin（B）、ZO-1（C）、vimentin（D）表达的免疫染色，或用Alexa Fluor 594指骨样蛋白进行F-actin（E）染色，用DAPI进行DNA染色以显示细胞核，如方法部分所述。箭头指示上皮和间充质标记的表达或位置的变化。原始放大倍数，200×。
图5
图5
MiR-200b抑制PC3 PDGF-D细胞的迁移和侵袭，减少其粘附和脱落。（A） 使用24孔Transwell渗透支架和8μM孔测定miR-200b对PC3 PDGF-D细胞迁移和侵袭的影响。在侵袭试验中，将转染miR-200b或对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞接种到涂有生长因子减少型Matrigel的Transwell插入物中。对于迁移试验，将转染miR-200b或对照miRNA的PC3 PDGF-D细胞接种到未涂有Matrigel的Transwell插入物中。培养24小时后，用4μg/ml Calcein AM在37°C的PBS中染色1小时。在ULTRA多功能微孔板阅读器中以485/530 nm的激发/发射波长读取插入物下侧细胞的荧光。显示了相对荧光值。这些值表示入侵或迁移细胞的相对数量。面板（B）和（C）显示PDGF-D的过度表达分别显著增加PC3细胞的粘附和脱落。（D） 用miR-200b转染PC3 PDGF-D细胞可显著抑制转染15天后PC3 PDGF-D细胞的附着和脱落。n=4.*，与对照细胞相比，p<0.05，**，p<0.01。
图6
图6
纯化的活性PDGF-D治疗下调miR-200家族的表达并诱导EMT。（A） 使用Trizol试剂分离总RNA。通过使用miRNA特异性Taqman MGB探针和引物测定miRNA水平。miRNA的相对量归一化为RNU6B。（B） 用实时RT-PCR定量检测纯化活性PDGF-D蛋白处理4周的PC3细胞与对照组PC3细胞中ZEB1、ZEB2、snail2、E-cadherin和vimentin mRNA的表达。将相对mRNA水平标准化为GAPDH。用纯化的活性PDGF-D处理Panel（C）和（D）PC3细胞10或20天，然后制备细胞裂解物。Western blot分析显示，ZEB2表达增加，E-cadherin表达降低，呈剂量依赖性。（E） 测定纯化活性PDGF-D处理对PC3细胞脱附的影响，结果表明，PDGF-D4周处理后PC3细胞的脱附明显增加。（F） 使用24孔Transwell渗透支架和8μM孔测定纯化活性PDGF-D处理对PC3细胞迁移的影响。显示了相对荧光值。这些值表示迁移的单元格的相对数量。*，与对照组相比，p<0.05，**，p<0.01。
图7
图7
PDGF-D在LNCaP细胞中过度表达可诱导EMT特征。（A） Western blot分析显示，与LNCaP-Neo细胞（GAPDH蛋白用作蛋白负荷控制）相比，LNCaP PDGF-D细胞（PDGF-D-过表达细胞）中ZO-1、波形蛋白、纤维连接蛋白的表达以及PDGF-D的水平。（B） 使用miRNA-特异性Taqman MGB探针和引物测定LNCaP PDGF-D细胞（PDGF-D）和LNCaP-Neo细胞（Neo）中miR-200a、miR-200b和miR-200c的水平。将miRNA的相对量标准化为RNU6B。（C） 实时RT-PCR检测PC3和LNCaP细胞PDGF-D mRNA水平。相对mRNA水平根据GAPDH标准化。（D） 使用miRNA-specific Taqman MGB探针和引物测定PC3和LNCaP细胞中miR-200a、miR-200b和miR-200c的水平。miRNA的相对量归一化为RNU6B。（E） 在侵袭试验中，将转染抗miR-200a、miR-200b和miR-200c（抑制剂）或抗miRNA对照的LNCaP细胞接种到涂有生长因子减少型Matrigel的Transwell插入物中。培养24小时后，用4μg/ml Calcein AM在37°C的PBS中染色1小时。插入物底部细胞的荧光在485/530 nm激发/发射波长的ULTRA多功能微板阅读器中读取。显示了相对荧光值。这些值代表入侵细胞的比较值。[*，p<0.05，**，与对照组相比p<0.01。N:LNCaP Neo细胞，D:LNCa p PDGF-D细胞，con:抗miRNA对照，200abc:ant-miR-200a，miR-200b和miR-200c（miRNA抑制剂）]。
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