AMPK与ULK1的联合调节自噬

摘要

介绍

自噬是一种细胞内分解代谢系统，它将细胞质内容物（如蛋白质、脂质和细胞器）传递给溶酶体进行降解[1]真核细胞自噬有三种主要途径，即大自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。大自噬（以下简称自噬）涉及双膜小泡的从头形成，称为自噬体，吞噬完整的细胞器（如线粒体）和部分胞浆。自噬体的外膜与内体和/或溶酶体融合形成自溶体，其中细胞质衍生物质与自噬体内膜一起被溶酶体水解酶降解。由此产生的大分子作为营养物质的内部来源被输送回胞浆，以支持能量生产或生物合成。从酵母到人类，这种自我控制过程都得到了很好的保护，对发育、免疫防御、程序性细胞死亡、神经退化、癌症和衰老都有影响[1]，[2].

雷帕霉素（TOR）的靶点是一种参与调节细胞生长和代谢的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[3]越来越多的证据表明，TOR及其哺乳动物同源物mTOR在生长因子和丰富营养素的存在下是自噬的主要抑制控制器[4]雷帕霉素是TOR的抑制剂，即使在营养丰富的条件下也能诱导自噬。在哺乳动物细胞中，mTOR是两种结构和功能不同的多蛋白复合物mTORC1（包含mTOR、GβL、PRAS40和raptor）的一部分，它们对雷帕霉素和细胞营养物质的可用性高度敏感，而mTORC2（包含mTO、GβL、mSin1和rictor）对雷帕霉素不敏感[3]，[5]猛禽是mTOR信号传导的基本蛋白，在mTORC1中发挥积极作用，作为向mTORC2复合物招募下游底物的支架，如核糖体S6激酶（p70S6K1）和真核生物起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）。营养丰富的条件通过小GTPase Rheb激活mTORC1，而营养不良的条件通过AMP-activated protein kinase（AMPK）激活mTORC。

AMPK是在所有真核生物中发现的一种中央代谢传感器，它控制葡萄糖和脂质代谢，以响应营养素和细胞内能量水平的变化。这种丝氨酸/苏氨酸激酶是由一个催化（AMPKα）亚基和两个调节（AMPK-β和AMPKγ）亚基组成的异源三聚体，当细胞内ATP水平下降而AMP水平升高时，如在营养和能量耗尽或缺氧时，通过上游激酶LKB1激活[6]活性AMPK直接磷酸化TSC2肿瘤抑制因子，导致Rheb失活，Rheb直接结合并激活mTORC1激酶[7]，[8]另外，最近的一项研究表明，AMPK通过直接磷酸化两个保守的丝氨酸残基Ser722和Ser792上的猛禽来调节mTOR信号[9]AMPK对猛禽的磷酸化诱导14-3-3与猛禽结合，这是抑制mTORC1和能量应激诱导的细胞周期阻滞所必需的[9].

丝氨酸/苏氨酸激酶Atg1是第一个通过酵母菌基本自噬基因的遗传筛选确定的自噬调节因子[10].Atg1与自噬调节蛋白Atg13和Atg17相互作用，这种复合物被认为在TOR下游发挥作用[11]，[12]Atg13在营养丰富的条件下以TOR依赖的方式过度磷酸化，并在营养缺乏或雷帕霉素处理后迅速去磷酸化，这增强了它与Atg1的相互作用。Atg13和Atg17都是Atg1激酶活性、自噬诱导和细胞质-空泡靶向所必需的[12].英寸果蝇属，Atg1与TOR和Atg13发生物理相互作用，并且在富含营养的条件下，Atg2和Atg3均以TOR和Atg1依赖的方式磷酸化[13]与酵母相比，果蝇属Atg13在自噬条件下过度磷酸化，主要通过Atg1依赖性途径[13]在哺乳动物中，有两种Atg1同源物，即类UNC-51激酶1和2（ULK1和ULK2）。虽然ULK1在调节自噬中起着重要作用，但ULK2在自噬过程中的作用尚未明确。与酵母Atg1类似，ULK1与哺乳动物Atg13（mAtg13）和酵母Atg17的功能类似物FIP200形成复合物[14]，[15]，[16]在该复合物中，mAtg13介导FIP200和ULK1之间的相互作用，并且是ULK1在饥饿时磷酸化FIP200所必需的[15]此外，ULK1的稳定性和完整激酶活性需要FIP200[14]，[16].

有趣的是，最近研究表明，mTORC1通过猛禽和ULK1之间的相互作用与ULK1-mAtg13-FIP200复合物结合，并磷酸化ULK1和mAtg13以抑制ULK1的激酶活性，从而抑制自噬的启动[15]，[16]，[17]然而，控制mTOR激活ULK1活性以诱导自噬的机制尚未明确阐明。

在本研究中，我们将AMPK鉴定为一种新的ULK1-结合蛋白，并证明AMPK对猛禽的磷酸化在自噬诱导中起着重要作用，可能是通过在营养或能量应激条件下抑制mTORC1对ULK1自噬复合体的抑制作用。

结果

AMPK作为ULK1结合蛋白的鉴定

迄今为止，已在哺乳动物中报告了几种ULK1相互作用蛋白，包括GABARAP、GATE-16、SynGAP、Syntenin、mAtg13、FIP200、Atg101、p62/SQSTM1和mTORC1[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，[19]，[20]，[21]为了进一步了解ULK1的作用机制，我们采用蛋白质组学方法结合串联亲和纯化（TAP）[22]在稳定转染TAP-ULK1的293细胞中鉴定额外的ULK1-结合蛋白。ULK1免疫复合物的串联质谱（MS/MS）分析显示AMPKγ1，一种AMPK亚基，是一种新的ULK1结合蛋白（数据未显示）。AMPK是由一个催化亚基（AMPKα）和两个调节亚基（AMPKβ和AMPKγ）组成的异源三聚体复合物，每个亚基以不同的亚型（α1、α2、β1、β2、γ1、γ2、γ3）存在。在准备出版这份手稿的过程中，Behrends等人[23]报道了通过蛋白质组学分析检测ULK1和ULK2免疫复合物中AMPK的催化和调节亚单位。通过联合免疫沉淀分析，293细胞中所有三种内源性AMPK亚单位（AMPKα、AMPKβ和AMPKγ）均与HA-ULK1相关(图1A). 在联合转染Flag-AMPKα2和HA-ULK1的293T细胞中进一步证实了AMPK和ULK1之间的相互作用(图1B). 我们还观察到内源性ULK1与标记的AMPKα2或AMPKβ1之间的关联(图1C). 此外，内源性ULK1与内源性AMPKα在293T细胞中共同免疫沉淀(图1D). 这种相互作用是特定的，因为ULK1的敲除消除了ULK1与AMPK的共同免疫沉淀(图1E). 此外，纯化的重组His6标记的AMPKα/β/γ亚基可以与纯化的重组His6-ULK1而不是His6-Bcl-XL蛋白形成复合物在体外表明AMPK和ULK1之间的相互作用是一种直接和特定的关联(图1F). 综上所述，这些数据表明AMPK是ULK1的新绑定伙伴。

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图1

AMPK与ULK1直接交互。

（A） 用Flag-ULK1或对照空载体转染293T细胞，用抗Flag抗体进行免疫沉淀，然后用所示抗体进行免疫印迹分析。（B） 将Flag-AMPKα2和HA-ULK1联合转染293T细胞。细胞裂解物使用抗旗帜抗体进行免疫沉淀，然后使用抗HA和抗旗帜抗体对其进行SDS-PAGE/免疫印迹分析。（C） 用Flag-AMPKα2或Flag-AAMKβ1瞬时转染293T细胞。24小时后，使用抗Flag或对照抗HA抗体进行免疫沉淀，并使用抗ULK1和抗Flag-多克隆抗体进行免疫印迹分析。（D） 293T细胞裂解物用抗ULK1多克隆抗体或对照免疫前兔血清（NRS）进行免疫沉淀，然后用抗ULK1和抗AMPKα抗体进行免疫印迹分析。（E） 用ULK1 shRNA或对照shRNA慢病毒感染293T细胞，用对照兔IgG或抗AMPKα抗体进行免疫沉淀，然后用抗ULK1和抗AMPK-α抗体免疫印迹。（F） 将纯化His6-AMPKα1/β1/γ1融合蛋白（250 ng）与纯化His6-标记的ULK1（1µg）或Bcl-XL（200 ng）蛋白混合在含有蛋白酶抑制剂的1%Triton X-100裂解缓冲液中，并用抗ULK1抗体进行免疫沉淀。用抗His-Tag多克隆抗体免疫印迹法分析所得蛋白复合物和10%的输入蛋白。

AMPK绑定到ULK1的PS域

为了确定ULK1的哪个区域是与AMPK相互作用所必需的，我们生成了一系列ULK1缺失突变体。免疫共沉淀分析显示，AMPK与ULK1富含脯氨酸丝氨酸（PS）结构域内的654–828氨基酸结合(图2A-C). 然而，与上一份报告相比[17]，mTORC1-结合位点被映射到ULK1的激酶域（氨基酸1–278）(图2A、B). 此外，AMPK、Raptor和mTOR可以与ULK1的野生型和激酶缺失突变体（K46N）相互作用(图2B)表明ULK1与AMPK和mTORC1相互作用不需要激酶活性。综上所述，我们的结果表明AMPK与ULK1的PS结构域结合，而mTORC1通过猛禽结合ULK1激酶结构域与ULK1。

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图2

AMPK和mTORC1分别通过ULK1的PS域和激酶域与ULK1相互作用。

（A） ULK1的示意图，说明其激酶结构域、脯氨酸/丝氨酸富集结构域、C末端（CT）结构域以及与AMPK和mTORC1结合的区域。（B，C）293T细胞转染ULK1的空载体或HA标记野生型（WT）或缺失突变体，并用抗HA抗体进行免疫沉淀。用mTOR、raptor、AMPKα或HA-tag特异性抗体通过免疫印迹分析产生的免疫复合物。

AMPK结合结构域是ULK1诱导自噬所必需的

为了确定AMPK-ULK1相互作用是否调节自噬，我们生成了一个缺失突变ULK1（Δ654-828），该突变缺乏AMPK结合域，但保留了与mTORC1相互作用的能力(图3A). 将小鼠ULK1转染到表达靶向人类ULK1的shRNA的U-2OS细胞中，可恢复AMPK激活剂二甲双胍诱导的GFP-LC3点状病灶形成（一种特征良好的自噬体标记物）(图3B、C). 相反，ULK1（Δ654–828）突变体的表达未能恢复ULK1敲低的U-2OS细胞中二甲双胍诱导的自噬体形成(图3B、C). 此外，营养缺乏后，U-2OS细胞中AMPK结合ULK1片段的过度表达以剂量依赖性方式抑制GFP-LC3点状病灶的形成(图3D). 总之，这些观察结果表明AMPK与ULK1结合在诱导自噬中起着重要作用。

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图3

AMPK-ULK1相互作用对ULK1介导的自噬很重要。

（A） 用空载体或HA标记野生型（WT）或缺失突变型（Δ654–828）ULK1转染293T细胞，并用抗HA抗体进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹。（B） 稳定表达GFP-LC3的U-2OS细胞被表达人Ulk1 shRNA的慢病毒（shhUlkl）或打乱的shRNA（shScr）感染，并用1µg/ml嘌呤霉素筛选5天。然后用野生型小鼠Ulk1（mUlkl）、mUlk 1Δ654–828或对照空载体转染细胞24 h，在无血清DMEM中培养过夜，并在含有或不含10 mM二甲双胍的完整培养基中培养20 h。使用荧光显微镜获得图像。比例尺代表10µm。（C） 定量（B）中每个GFP阳性细胞的GFP-LC3点数（平均值±标准差；n=81）。（D） 稳定表达GFP-LC3的U-2OS细胞转染0、2或4µg编码HA标记ULK1缺失突变体的pcDNA3（554-828）。每次转染使用的质粒DNA总量用空载体标准化为4µg。转染24 h后，细胞在无营养培养基中饥饿1.5 h，固定在4%多聚甲醛中，并用荧光显微镜进行分析。量化每个GFP阳性细胞的GFP-LC3点数（平均值±标准差；n=100）。统计显著性由Student’st吨-测试和星号表示P（P）<0.0001.

AMPK激活后向ULK1-mTORC1复合物招募14-3-3

由于AMPK与ULK1-mTORC1复合物相关，14-3-3与猛禽的结合对AMPK抑制mTORC1至关重要[9]接下来，我们研究了AMPK激活后14-3-3是否被招募到ULK1复合体。如所示图4AICAR激活AMPK导致14-3-3τ补充到ULK1-mTORC1复合物，这与ULK1-bound Ser792磷酸化猛禽的水平相关。通过测量ACC（Ser79）磷酸化和S6K（Thr389）去磷酸化，分别测定AICAR诱导的AMPK激活和mTORC1失活。尽管AICAR治疗适度地导致PRAS40去磷酸化和14-3-3解离（数据未显示），但已经证明PRAS40的结合并不是决定猛禽磷酸化对mTORC1激酶活性影响的关键事件[9]总之，这些结果表明，能量应激对AMPK的激活将14-3-3募集到猛禽，从而抑制ULK1复合物中的mTORC1活性。

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图4

AICAR诱导猛禽AMPK磷酸化，并向ULK1-mTORC1复合物招募14-3-3。

将稳定表达HA-ULK1的293个细胞用1mM AICAR处理指定时间，并用抗HA或对照抗FLAG抗体进行免疫沉淀。用所示抗体通过免疫印迹分析产生的免疫复合物。

猛禽AMPK磷酸化调节自噬诱导

尽管AMPK激活被证明可以抑制肝细胞的自噬[24]，普遍认为AMPK是自噬所必需的[25]为了确定AMPK对猛禽的磷酸化对自噬诱导是否重要，我们利用TSC2-缺陷的MEF细胞，其中内源性猛禽被缺乏AMPK磷酸化位点的人类野生型猛禽或突变型猛禽（S722A/S792A，以下简称AA突变体）稳定替换[9]用GFP-LC3转染野生型猛禽和AA突变体猛禽细胞，并用AICAR处理以激活AMPK。通过GFP-LC3点的形成评估自噬。虽然在AICAR处理后，带有野生型猛禽的TSC2-deficient MEF细胞中每GFP阳性细胞中GFP-LC3点的数量急剧增加，但表达AA突变猛禽的细胞即使在AICAR处理后也只有少数可检测到的GFP-LC3点(图5A、B). 除LC3外，p62/SQSTM1是另一种广泛使用的自噬通量标记物。研究表明，p62的稳态水平反映了自噬活性[26]，[27]为了研究AMPK磷酸化对自噬通量的影响，我们监测了AICAR治疗期间这些细胞中p62的降解。免疫印迹分析显示，AA突变猛禽抑制了TSC2-缺陷细胞的自噬通量(图5C). 与之前的报告一致[9]根据S6K（Thr389）磷酸化测定，AICAR诱导的猛禽（Ser792）磷酸化并抑制了用野生型猛禽而非AA突变型猛禽重建的TSC2-deficient细胞中的mTOR活性(图5C). 因此，这些数据表明，AMPK介导的猛禽磷酸化对自噬诱导很重要，可能是通过抑制mTORC1抑制活性激活ULK1。

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图5

AMPK的猛禽磷酸化是AICAR诱导TSC2自噬所必需的^−/−MEF细胞。

（A） TSC2系统^−/−，p53^−/−用野生型猛禽或S722A/S792A突变体猛禽稳定重组的MEF转染GFP-LC3，用2mM AICAR或对照载体处理4h，然后用荧光显微镜进行分析。计算每个GFP阳性细胞的GFP-LC3点数（平均值±s.d.；n=60）。比例尺代表10µm。（B） TSC2系统^−/−，p53^−/−用2 mM AICAR处理用野生型猛禽或S722A/S792A突变体猛禽稳定重组的MEF指定时间。在RIPA缓冲液中制备细胞裂解物，并用所示抗体进行免疫印迹分析。p62的水平是相对于未经处理的WT猛禽细胞的水平列出的，设置为1。（C） AMPK介导的mTORC1对ULK1自噬复合物抑制作用的抑制示意图。

讨论

在本研究中，我们证明了AMPK与ULK1的PS结构域结合，在ULK1介导的自噬中起着重要作用。我们的研究结果表明，AMPK可能通过ULK1自噬复合体中猛禽的磷酸化抑制mTORC1活性来激活ULK1诱导自噬(图5D). 据报道，AMPK可以通过TSC2和猛禽的直接磷酸化来抑制mTORC1信号传导[7]，[9]有趣的是，FIP200是一种ULK1结合蛋白，已被证明通过TSC1与TSC1/TSC2复合物相互作用[28]因此，尚需确定ULK1复合物中是否存在TSC1/TSC2，如果存在，AMPK是否不仅通过猛禽的磷酸化，还通过ULK1-mTORC1复合物中TSC2的磷酸化来抑制mTORC1活性。

在酵母中，Atg13与Atg1结合的能力由其磷酸化状态调节[12]虽然Atg13在富含营养的条件下以TOR依赖的方式过度磷酸化，但在缺乏营养的条件下它会迅速去磷酸化。Atg13的去磷酸化增强了其与Atg1的结合。Atg17通过Atg13与Atg1相互作用，Atg13和Atg17都是Atg1激酶活性、自噬诱导和胞浆-空泡靶向所必需的[12]，[29]然而，在哺乳动物细胞中，无论营养状况如何，ULK1都与mAtg13和FIP200形成稳定的蛋白质复合物[17]有趣的是，mTORC1在营养饥饿条件下从ULK1-mAtg13-FIP200复合物中分离，这种分离被推测为导致ULK1活化和自噬诱导的关键事件[17]因此，猛禽的AMPK磷酸化和随后14-3-3向猛禽的补充可能导致mTORC1从ULK1多蛋白复合物中分离。AMPK也可能磷酸化ULK1，导致构象改变，干扰ULK1和mTORC1之间的相互作用。或者，AMPK可以通过ULK1的直接磷酸化激活ULK1以诱导自噬。事实上，纯化的AMPK激酶可以磷酸化重组ULK1蛋白在体外（数据未显示）。

AMPK在自噬调节中的作用仍有争议。研究表明，AICAR激活AMPK可以阻断肝细胞的自噬[24]，[30]相反，许多研究表明，化合物如AICAR和二甲双胍对AMPK的药理激活以AMPK依赖的方式诱导自噬[25]，[31]，[32]，[33]，[34]此外，最近的一份报告表明，通过抑制mTORC1活性，需要AICAR激活的AMPK对猛禽进行磷酸化以阻止细胞周期[9]与这些观察结果一致，我们的研究提供了证据表明，AMPK对猛禽的磷酸化在自噬诱导中发挥作用，可能是通过抑制ULK1复合体中的mTORC1抗自噬活性。

此外，最近的一项研究表明，ULK1复合物在调节mTORC1活性中发挥作用[15]在mAtg13、ULK1或ULK2敲除细胞中观察到S6K1磷酸化在Thr389处上调，Thr388是mTORC1活性的指标[15]之前的研究结果也支持了这一结果，即Atg1在果蝇属脂肪体对S6K1磷酸化有负面影响，哺乳动物细胞中ULK1或ULK2的敲除增加了S6K1的磷酸化[35]，[36]因此，在细胞生长控制和自噬的背景下，通过猛禽的磷酸化来确定AMPK是否与ULK1合作调节S6K1将是一件有趣的事情。

总之，我们已经鉴定出一种新的ULK1-结合蛋白AMPK，它是一种与细胞生长控制耦合的能量传感器。AMPK与ULK1-mTORC1复合物相关，并通过ULK1自噬复合物中猛禽的磷酸化抑制mTOR，从而至少部分促进自噬。显然，未来的研究需要进一步证明AMPK是否也调节ULK1-mAtg13-FIP200复合物中的mAtg13或FIP200，例如磷酸化，以及ULK2是否也在AMPK介导的自噬诱导中发挥作用。此外，我们发现AMPK可以磷酸化ULK1（数据未显示）。因此，进一步研究ULK1和AMPK之间的相互作用和磷酸化调控将有助于我们了解AMPK-ULK1-mTORC1复合物在自噬诱导和自噬相关疾病（包括癌症和神经变性）中的机制。

材料和方法

致谢

脚注

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