关键microRNA对长寿突变小鼠IGF1R的转录后调节

总结

介绍

在过去十年中，生长激素信号通路的胰岛素样生长因子（IGF）轴已成为小鼠寿命的主要决定因素；在进化上距离较远的物种中可以看到一种平行的调节分子机制，包括秀丽线虫和果蝇(粗纱等。2009). 一直以来，在从蠕虫到小鼠的每一种长寿生物体中，调节寿命的一个共同主题是IGF信号功能的丧失，导致寿命延长(Bartke 2011年). 在小鼠中，垂体前叶的生长激素（GH）脉冲爆发确保了GH的生物活性，包括与GH受体的结合，导致IGF1的合成和分泌(勒·罗思等。2001). IGF1诱导的细胞内信号传导可能是对抗性多效性衰老范式的典型例子：生命早期所需的基因可能在生殖后或老年时有害(Aleman&Torres-Aleman 2009年)自相矛盾的是，IGF信号对促进发育过程中的生长和分化是必要的，但其活性的降低与多种动物甚至长寿人类的寿命延长有关(Bartke 2011年). 因此，从发育对IGF作用的需求转变为成年期活动减少，成为决定寿命的关键分子调节器，对GH诱导的效应提供特定控制，并影响各种信号通路。

艾姆斯侏儒鼠的螺旋桨-1导致GH、催乳素和甲状腺刺激激素缺乏的基因座(桑森等。1996). 这些突变体对胰岛素过敏，保持较低的空腹血糖浓度(多米尼西等。2002). 然而，艾姆斯矮人GH损失的影响，与其他两种激素的损失交织在一起，增加了对更清洁的小鼠模型的需求；这是由GHR/结合蛋白基因被破坏的小鼠菌株（GHRKO）实现的(周等。1997). 这只老鼠寿命很长(科斯奇加诺等。2000)，在表型和生理上与艾姆斯侏儒相似，但没有催乳素和促甲状腺素缺乏的并发症(Hauck&Bartke 2000公司). 因此，这些长寿的矮小小鼠具有GH信号缺失、低循环IGF1和高胰岛素敏感性的共同特征。

由于在等位基因缺失方面的开创性工作秀丽线虫对于激素缺乏突变小鼠来说，IGF1信号的丢失及其对寿命的影响已成为寿命研究的中心主题(弗鲁基等。2001); 目前的趋势是通过雷帕霉素（TOR）信号靶点研究其对代谢的影响(Martin&Hall 2005年). GH和IGF1之间的串扰创造了迷人的复杂性，将数十或数百个网络在生物体寿命决定中的许多有趣功能联系在一起(多米尼西等。2005). 尽管有这种复杂的情况，中心轴仍然是交织网络的核心：也就是说秀丽线虫对小鼠来说，IGF1与IGF1R结合，激活细胞内激酶，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K），进而促进蛋白激酶B（PKB/Akt）的磷酸化(坎特利2002;Vivanco&Sawyers 2002年). 这种激活的PI3K/Akt通路改变了Forkhead转录因子家族（FoxO蛋白）的一个亚群的磷酸化状态，这些转录因子有助于调节参与凋亡、代谢和细胞周期过程的基因(Tran公司等。2003). Akt磷酸化转录因子FoxO3a，加强其细胞质定位，从而防止其核移位，并截断数百个基因的转录激活(布鲁内特等。1999). 核FoxO3a促变性功能的一个有趣方面是，它通过激活线粒体超氧化物歧化酶（MnSOD）、过氧化氢酶、，等。

激素缺乏突变小鼠和线虫通过基因突变使我们认识到，在不完全敲除IGF1信号通路成员的一个等位基因的情况下，可以实现对寿命的控制。然而，在我们对GH诱导的信号缺陷和上述分子事件级联的信号减少的理解中，一个缺失的环节是功能丧失实际上是如何发生的，以及什么是将基因转换为低活性模式的关键因素。在秀丽线虫，IGF1信号传导的调节被广泛报道为受各种分子因子的调节，这些分子因子维持衰老和抗衰老之间的平衡，依赖于或不依赖于FoxO3a转录因子的活性(Gems&McElwee 2003;麦克尔韦等。2006;阿亚德瓦拉等。2009;Shmookler Reis公司等。2011). 毫不奇怪，最近有报道称microRNAs（miRNAs）在调节GH/IGF信号传导中的作用(于等。2008;梅斯等。2009;掸邦等。2009)控制这些非编码RNA的表达与其目标基因表达水平之间的平衡。我们和其他人已经报道了miRNA表达谱在衰老过程中发生变化，其靶基因参与许多重要的细胞功能；这在正常老化过程中的退化过程中有很好的记录(锂等。2009;梁等。2009;梅斯等。2009;贝茨等。2010;兰西塔等。2010;坎纳等。2011;锂等。2011). 从概念上讲，生长激素信号传导减少及其对IGF1轴相关基因表达的影响之间的中间调节步骤最好完成通过一个或多个具有高效和多功能操作模式的分子因子家族。正如我们小组早些时候报道的那样，艾姆斯侏儒小鼠肝脏中miR-27a表达增加抑制了与肿瘤发生有关的基因，与侏儒鼠肿瘤发病率的降低相关(贝茨等。2010). 本论文是关于Ames侏儒小鼠肝脏的论文的续篇，旨在揭示与长寿小鼠相关的其他表型的miRNA定向调控，即神经元功能的获得，主要体现在认知稳健性上。

在本报告中，我们包括GHRKO突变小鼠，这不仅是因为它直接影响了特定生长激素信号缺陷的IGF1通路，而且还用于比较分析Ames矮小突变体中的平行miRNA-定向调控。使用内部设计的miRNA微阵列芯片分析（MM Chips），我们通过定量PCR（qPCR）和就地前三种miRNAs在脑组织中的杂交（ISH）。定量PCR和ISH研究表明，miR-470、−669b和−681在GHRKO大脑中也上调。这三种miRNA表达的增加对应于IGF1、IGF1R和PI3激酶及其下游成员AKT和FoxO3a的磷酸化形式的减少。转染研究表明，miR-470、−669b或−681比其他相关蛋白更显著地抑制IGF1R；这进一步通过其抑制该基因3′-非翻译区（3′UTR）报告结构表达的能力得到验证。最后，通过在表达任何一种miRNA的IGF1应答培养物中刺激IGF1来测试这三种miRNA对IGF1R和该信号通路的其他相关基因的直接影响。我们的结果表明，在IGF1刺激下，miRNA过表达培养物主要表现为IGF1R的表达受到抑制，同时AKT也受到一定程度的抑制，其中最显著的是miR-681。最重要的是，表达这三种miRNAs中任何一种的培养物显示磷酸化AKT和FoxO3a水平显著降低。这些结果使我们认为，这三种miRNAs，miR-470、−669b和−681，在功能上都能够抑制IGF1R和AKT的表达，诱导FoxO3a磷酸化状态降低，从而通过对长寿小鼠突变体大脑的转录后控制抑制IGF1途径。

结果

Ames侏儒小鼠大脑中主要miRNA的鉴定

MM-Chips在艾姆斯侏儒小鼠及其不同年龄组的野生型对应物的脑样本中筛选出感兴趣的miRNAs的比较表达：对于2个月龄、24个月龄和33个月龄的侏儒鼠，以及对于其野生型同窝对照鼠，分别为2个月和24个月。对照组小鼠的中位生存期为~28个月，艾姆斯侏儒鼠的中位存活期为~38个月；因此，前者选择24个月和33个月作为老年，后者选择老年，以避免生命末期的病理并发症。我们已经确定了一份侏儒小鼠大脑中最显著上调和下调的miRNAs的列表，这些miRNAs-在年轻和老年组之间(补充表S1A和S1B). 从MM芯片筛选结果中，我们选择了5个铅上调和2个下调的miRNAs，通过引物特异性多重定量PCR分析进一步独立验证，使用相同的样本进行分析。所有五种上调的miRNAs，miR-470、−681−669b、let-7g和−501-5p，都可能以生长轴的IGF1R为靶点。qPCR结果证实，与突变型和野生型对照相比，不同年龄组中miR-470、−681和−669b三种miR显著增加(图1A).

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图1

关键miRNAs在Ames侏儒和同窝野生型小鼠脑中的表达

利用MM芯片鉴定的关键miRNAs的定性PCR，以及Ames侏儒组和同卵对照组在相同年龄组内各自的折叠变化值，对表达水平进行图形表示。D2、D24、D33、C2和C24:D代表侏儒，C代表2个月龄、24个月龄和33个月龄的同窝WT对照小鼠。面板（A）显示了由MM芯片识别的关键上调miRNA，以及面板（B）显示了关键的下调miRNAs。（*p<0.01，**p<0.0001；所有直方图代表平均±标准偏差；n=3，每个基因型每个年龄组的三个样本。）

qPCR也验证了两种铅下调miRNAs miR-96和−709的折叠变化，如图1B然而，当使用来自相同年龄组的组织样本进行比较时，这两种miRNA在肝脏中也下调。这两种miRNAs在抗凋亡基因家族中都有靶点；在我们之前的论文中，包括老矮人小鼠肝脏研究，详细描述了它们在衰老过程中在肝脏中的下调(梅斯等。2008;贝茨等。2010). 它们在大脑中的下调表达表明这两种miRNAs可能以一种全身性的方式发挥作用。由于它们在IGF1信号转轴中没有候选靶点，我们还没有进一步研究这两个miRNAs。

使用五种上调miRNAs进行的MicroRNA过表达质粒转染试验显示，miR-470、−669b和−681对IGF1R蛋白表达的抑制最为显著，降低了30%以上，而let-7g和miR-501-5p显示了约10%的抑制(补充图S1和补充表S2). 尽管根据生物信息数据挖掘（数据未显示），let-7和miR-501-5p在IGF1R的3′UTR中都有潜在的结合位点，但转染分析显示其功能作用不如其姐妹miRNAs miR-470、−669b和-681显著。同样，除miR-501-5p外，其他四种miRNAs均在IGF1的3′UTR上有结合位点；该基因的抑制水平要么完全没有，要么<15%。此外，只有miR-470和−501-5p在PI3kinase的3′UTR上有结合位点；该基因的抑制水平为20%或更低，与let-7g相似。综上所述，这些转染分析使我们将研究重点放在IGF1R和显示最显著靶向阻遏的三种miRNAs miR-470、−681和−669b上。下面显示的结果描述了与野生型对照组相比，我们对长寿小鼠脑中IGF1轴中选定的三种miRNA及其共享靶点IGF1R的关注，以及它们对IGF信号的直接影响。

现场Ames侏儒小鼠脑内miRNAs的检测

现场miR-470、−669b和−681的杂交（ISH）显示，使用LNA（锁定核酸）探针，它们的表达在不同年龄的Ames侏儒小鼠大脑中的海马显著定位，分别如图2A、2B和2C所示。采集图像中的密度测定值根据杂交对照的值进行标准化，其中使用了加扰LNA探针。同样，在相同的大脑标本的皮层中也可以看到LNA探针染色的增加。海马体的强烈定位表明，这一对认知能力至关重要的区域确实含有更多这三种上调的miRNAs。这些ISH数据不仅验证了MM芯片和qPCR所示的表达谱，还提供了miRNA表达的进一步个体神经元定位，以及它们在完整大脑中的地形图(图2).

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图2

现场Ames侏儒和GHRKO小鼠脑中铅miRNAs的检测

现场杂交（ISH）检测Ames侏儒小鼠（D）2个月、24个月和33个月时脑组织中的miRNAs（miR-470、−669b和−681），分别描述为D2、D24和D33，以及2个月和24个月时的窝友对照（C），标记为C2和C24年龄组（A、B、C）。（D）与WT同窝小鼠相比，所有年龄组的艾姆斯矮小小鼠中这些miRNAs的杂交信号增加。（*p＜0.01，**p＜0.0001；所有直方图代表平均值±标准偏差；n=3，每个基因型每个年龄组的三个样本。）（E） 现场杂交（ISH）检测2个月龄GHRKO小鼠和同窝对照小鼠脑组织中这三种miRNAs。（F）显示了它们在大脑皮层和海马体中表达的密度分析的图形表示。（*p<0.01，**p<0.0001；所有直方图代表平均±标准偏差；n=3，每个基因型每个年龄组的三个样本。）

GH/IGF1轴关键成员的免疫印迹

在上述研究所用的相同组织标本中，通过免疫印迹法评估三种先导miRNA与其IGF1信号通路候选靶点之间的假定反向关系，以确定其表达水平。我们不仅检测了关键成员，如IGF1、IGF1R、PI3kinase、AKT和FoxO3a，还检测了最后两个成员的磷酸化形式，因为PI3激酶活性的降低，由于其自身下调或上游IGF1和/或IGF1R表达的降低，导致磷酸化AKT的下调，使其不能磷酸化FoxO3a，并使后者保持功能性和非磷酸化。在我们的Western blotting中，如所示图3，前三个成员IGF1（14kDa）、IGF1R（由95kDaβ亚基、细胞质域表示）和PI3K（85kDa(图3A); 在用β-肌动蛋白（42kDa）带标准化后，用三个不同的小鼠大脑对三个重复序列进行密度测量，进一步证实了这一点(图3C). 有趣的是，通过pan-AKT抗体和总FoxO3检测到的AKT总库水平（pan-AKT，56kDa，包括AKT1、AKT2和AKT3）在所有五组的比较中没有显示出显著差异；但与野生型（WT）窝鼠相比，氨基酸残基308（T308）处磷酸化的AKT和氨基酸残基253（S253）处磷酸化合的FoxO3a和磷酸化的硒显著减少(图3A&C). 由于AKT的苏氨酸308被磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）磷酸化，pAKT（T308）的降低表明PI3K水平较低是AKT磷酸化较少的原因。AKT激活较少，可能是AKT2(坎特利2002;Vivanco&Sawyers 2002年)导致FoxO3a在Ser253的磷酸化减少，使更多的FoxO3a转位到细胞核以激活其靶基因，如抗氧化基因。综上所述，这些结果表明IGF1级联的三个成员，IGF1、IGF1R和PI3激酶，确实都下调；然而，AKT和FoxO3a仅在其磷酸化形式pAKT（T308）和pFoxO3a（S253）中下调。

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图3

Ames侏儒和GHRKO小鼠脑内GH信号的改变

艾姆斯侏儒小鼠脑组织（A）与同窝WT对照小鼠相比，观察到IGF1（14kDa）、IGF1R（95kDaβ亚单位）、PI3K（85kDa。与同窝WT对照组相比，在2个月大的GHRKO小鼠脑组织中观察到这些蛋白的类似减少（B）而总pan-AKT和总FoxO3a没有显著变化。（C）Ames侏儒小鼠大脑Western blots密度分析的图形表示。（*p<0.01，**p<0.0001；所有直方图表示平均值±标准偏差；n=3，每个基因型的每个年龄组有三个样本。）使用的年龄组是2个月、24个月和33个月的艾姆斯侏儒，带有D2、D24和D33标签，2个月和24个月的野生型对照分别表示为C2和C24。（D）GHRKO小鼠大脑Western blots密度分析的图形表示。（*p＜0.01，**p＜0.0001；所有直方图代表平均值±标准偏差；n=3，每个基因型每个年龄组的三个样本。）

主要miRNA的功能测定及其对靶点的影响

通过阵列筛选和qPCR验证的三种铅上调miRNAs对GH/IGF1轴基因的抑制作用，以及就地杂交后，我们在IGF1反应的人成纤维细胞模型细胞培养物（WI-38）中以早期群体倍增水平过度表达miR-470、−669b和−681。具体而言，我们检测了这些miRNA对IGF1诱导的信号传导的影响。用过表达miR-470、−669b和−681的慢病毒转导的培养物缺乏血清，随后受到生理水平为100 ng/ml的IGF1的刺激。不表达这三种miRNAs中任何一种的转导培养物以及未转导的WI-38培养物用作对照，标记为“单独载体”和“未感染”分别如图所示。尽管pFoxO3a（S253）在IGF1刺激后30分钟达到峰值，但基于pAKT（T308）水平，在90分钟时实现了最佳IGF1刺激信号(图4A). 该观察总结了关于在IGF1刺激下大鼠颗粒细胞中pAKT（T308）增加而FoxO3a（S253）下降的报告(理查兹等。2002). 由于AKT是FoxO3a磷酸化的上游，我们选择90分钟作为实验的时间点，转导表达率>90%(图4B,补充图S3). 这些miRNAs减少IGF1R（由95kDaβ亚单位表示，该蛋白的细胞质域）和AKT，产生涉及FoxO3a的下游链效应(图4B). 如图所示图4B三个重复转导实验的定量显示pAKT（T308）和pFoxO3a（S253）减少，miR-470、miR-669b或miR-681转导发生显著变化。特别是，转导用于miR-681表达的培养物显示出非常低的总AKT水平，相应的pAKT水平较低（T308）。用β-肌动蛋白值对获得的印迹图像中的所有密度测定值进行归一化，用作内部对照，并绘制成图4B。所有三种miRNAs降低IGF1R导致我们在共同转染研究中将报告者分析的重点放在该基因的3′UTR上，如下所述。

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图4

GH信号关键基因的MiRNA-依赖性表达改变

（A）IGF1刺激无血清WI-38细胞后不同时间点细胞总蛋白的Western blot分析。IGF1刺激的结果是，90分钟时出现最大磷酸化Akt。以直方图的形式显示IGF1信号在不同时间点的影响的密度测量数据的图形表示用归一化值显示。β-actin作为内部对照。（B）miRNA（miR-470，−669b和−681）抑制血清饥饿和IGF1刺激的WI-38细胞GH/IGF轴基因内源性表达的Western blot分析。观察到三种关键miRNAs（miR-470、−669b和−681）显著抑制IGF1R（以95kDaβ亚单位表示）、pAKT（T308）和pFoxO3a（S253）。除了miR-681转导的细胞外，未观察到AKt总表达的显著变化。未观察到FoxO3a总表达的显著变化。密度测量数据以直方图的形式用标准化值表示。β-actin作为内部对照。（*p<0.01，**p<0.0001；所有直方图代表平均值±标准偏差；n=3，三个实验各取三个样本。）

对于联合转染分析，我们按照方法中描述的方案，构建了一个具有IGF1R全长3′UTR的红色荧光报告体。为了了解这三种miRNAs的高表达是如何影响GH/IGF1轴信号传导的，我们利用绿色荧光报告结构标记的miR-470、−681或−669b进行了瞬时共转染实验。在转染后72小时，与使用带有混乱序列的控制载体的联合转染实验相比，对显示出强绿色荧光的细胞（对应于miRNA结构）和3′UTR结构报告表达的褪色红色荧光的培养物进行评分。携带任何特定miRNAs或IGF1R 3′UTR结构的细胞显示绿色，但完全没有红色荧光，或反之亦然(图5A). 通过记分细胞（n=1000）显示绿色荧光，红色表达减少，对miRNA表达质粒和报告构建物之间的强度进行图像分析。我们通过对来自三个不同实验的不同场（n=10）的细胞（n=100）进行图像强度分析来进行累积密度测定；然后对所有值进行显著性水平的统计分析(图5B). 在所有的测定中，对照质粒携带一个混乱的序列；因此，以等强度的绿色和红色荧光作为对照。如图所示，IGF1R 3′UTR报告强度的抑制在miRNA过表达质粒共转染细胞中显著，减少了3倍，但在对照组中没有。与单个miRNA转染相比，用于评估两个或三个miRNA的假定加性效应的组合转染方法并没有显著增加抑制作用(补充图S4).

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图5

MiRNA对HEK-293细胞IGF1R 3′UTR的抑制作用

（A）用三种关键小鼠miRNAs（miR-470、−669b或−681）和IGF1R 3中的一种共同转染HEK-293细胞′UTR报告，显示IGF1R的3′UTR被转染的miRNAs抑制，而不是被扰乱控制和IGF1R 3′UTR-联合转染的细胞抑制。这表明这些miRNAs通过IGF1R的3′UTR抑制靶蛋白（红色荧光）。当使用携带乱序序列的质粒时（用箭头表示），这种效应不存在。（B）显示了颜色强度密度分析的图形表示。（*p<0.01，**p<0.0001；所有直方图表示平均值±标准偏差；n=3，三个实验中每个实验取三个样本。）

讨论

我们的结果来自阵列筛选，随后是qPCR研究和进一步的单个细胞定位就地杂交分析揭示了三种领先的miRNAs，即miR-470、−681和−669b在长寿变种艾姆斯矮小小鼠中的表达增加。它们的表达与IGF1信号通路的三个关键基因IGF1、IGF1R和PI3K在Ames侏儒小鼠所有年龄组的脑组织中的表达呈负相关。这三个基因下游的总AKT和FoxO3a没有这种反向关系，但它们的磷酸化形式有这种反向关系。在年轻的GHRKO小鼠大脑中也观察到这三个miRNAs与IGF1、IGF1R和PI3K以及磷酸化AKT和磷酸化FoxO3a之间的类似反向关系，但不是在他们的野生型室友身上。功能研究表明，所有三种miRNAs的主要靶点都是IGF1R，在瞬时转染细胞中，这三种miRNA的减少幅度最大，而其他两种主要miRNA（let-7和miR-501-5p）的减少幅度最小。这些非编码RNA的转导表达的培养物对IGF1刺激的磷酸化AKT和FoxO3a的诱导表达没有反应。有趣的是，在转导表达miR-681的培养物中，AKT的总水平也显著降低；因此，其磷酸化亚型的低水平可能是由于该基因和IGF1R的阻遏作用的共同作用。miR-470、−681或−669b与IGF1R 3′UTR构建体的共转染表明报告基因的表达确实受到抑制。因此，三种miRNAs，miR-470、−681和−669b，具有相同的抑制关键蛋白IGF1R的能力；这就是生长激素信号缺失如何降低eIGF1信号活性的关键核心。

所有三种miRNAs，miR-470，−669b，−681，都能够抑制GH信号通路的IGF1R，这一事实可能支持三种miRNA协同工作以增加GH信号抑制增益的概念。事实证明并非如此，因为我们使用两个或三个miRNA的组合转染方法并没有比单个miRNA转染显著增加抑制作用(补充图S2). 这表明这三种miRNAs在功能上独立抑制IGF1R，因为它们的结合位点是不同的结构域，没有重叠。此外，IGF1R的3′UTR非常长；我们不得不用一种独特的重组方法来克隆它(线路接口单元等。2003)获得用于抑制研究的全长克隆。IGF1R信息的三级结构可能导致特定的化学计量构型，限制miRNA与不同结合位点结合的空间暴露。因此，共享同一靶点IGF1R的三个miRNAs可能只是反映了大自然的设计增加了可能的结合机会，而不是三者之间的协同加性效应。事实上，情况似乎如此，因为IGF1R 3′UTR中有14个可能的位点用于miR-470结合；这一事实确实导致了最大的压制，如补充图S2最后，在对特定miRNAs与其靶点结合的活体图像分析可行之前，我们对miRNAs-与特定靶点结合中的时间因素的数据解释是有限的。

综上所述，我们的结果表明：1两个月大的Ames侏儒和GHRKO小鼠大脑之间、三个关键miRNAs miR-470、−669b和−681以及IGF1轴的关键成员之间也存在类似的反向关系模式；和2调节IGF1信号功能丧失的共同途径可能是由于生长激素信号缺乏，因为GHRKO小鼠没有艾姆斯侏儒小鼠中出现的其他两种激素（催乳素和甲状腺刺激激素）丧失的并发症。还有其他长寿的突变株具有类似的生长激素信号缺陷；例如Snell侏儒小鼠，一种与艾姆斯侏儒鼠密切相关的突变型坑-1基因敲除，表现出相似的寿命。寿命延长的另一个例子通过IGF1功能的丧失是杂合子IGF1R基因敲除小鼠，其纯合子同胞因严重生长迟缓表现出高死亡率(弗鲁基等。2001). 通过本报告中揭示的线索，我们将能够解决这样一个问题，即同一三个miRNAs，可能与其他关键miRNAs一起，是否也在一些其他模型系统中调节IGF1信号轴的转录后抑制。

IGF1R的同源性秀丽线虫是daf-2型是首批被发现对延长蠕虫寿命有影响的基因之一通过遗传突变(拉贾赫等。1997). 从蠕虫到小鼠，IGF1受体存在于中枢和外周神经系统中，解释了各种神经元功能的不同分子机制(拉贾赫等。1997). 已知许多细胞类型产生IGF1；在大脑中，来源主要是海马细胞和相关的血管(山本和墨菲1995;洛佩斯·费尔南德斯等。1996). 在功能上，IGF1支持体细胞组织的发育，但不是生存所必需的。例如，纯合敲除小鼠，如IGF1级^−/−或IGF2型^−/−突变体是可行的，尽管大约比野生型同窝伴侣小40%(线路接口单元等。1993). 相反，IGF1R是小鼠生存所必需的；纯合的IGF1R型^−/−小白鼠出生时死亡，比同窝小白鼠小55%左右(线路接口单元等。1993). 杂合的IGF1R型^+/−雌性不仅能活到成年，而且寿命也会延长。另一方面，IGF1R信号通路的过度激活第44页^+/+转基因小鼠导致衰老加速和最大寿命缩短(迈尔等。2004). 总之，IGF1Re表达水平可能是长寿的关键；它的缺乏导致致命性，降低水平确保延长寿命，而过度激活导致加速老化和缩短寿命。

中枢神经系统中IGF1信号转导与认知功能的关系是复杂的，尚未完全理解。虽然IGF1的神经刺激和神经保护作用已有很好的记录，但在GH耐药和GH缺乏的小鼠突变体中对循环IGF1水平的深度抑制不会导致认知缺陷。此外，这些突变体在学习和记忆方面显著免受与年龄相关的衰退的影响(金尼等。2001年a;金尼等。2001亿). 这些长寿突变体中认知功能的维持与大脑中IGF1的正常或增加表达有关，特别是海马体(卢普等。2001;太阳等。2005年a)齿状回的神经发生增加(太阳等。2005年b). 其中一些报告与目前的研究结果之间的明显差异可能与方法上的差异有关，包括对整个大脑中基因表达的测量与。解剖海马体。更重要的是，IGF1受体的调节可能与IGF1表达的变化有根本不同。最近，科恩等。(科恩等。2009)据报道，在阿尔茨海默病模型小鼠中IGF1R基因的杂合性缺失可以保护它们免受行为损伤、神经炎症和神经元丢失的影响。目前的研究结果是关于长寿命突变体大脑中IGF1R的抑制补充了这些结果。

尽管其他miRNAs的折叠变化大于25%，即miR-292-3p，28%；miR-488，33%；miR-717，27%；miR-705，79%；miR-98，42%；miR-494，33%，等。，我们选择了三种miRNA，miR-470、−681和−669b作为本研究的重点，因为这三种miRNA都是：a）靶向IGF1R；b）随着年龄的增长表现出上调，而其他六个则没有。根据我们之前在热量限制和大鼠肝脏论文中的观察，一些miRNAs可能调节一个共同的信号通路(坎纳等。2011;锂等。2011). 减少miR-34a、−30e和−181a-1*的表达可能有助于限制热量小鼠神经元存活率的提高(坎纳等。2011). 同样，miR-34a、miR-93、，等可能在功能上影响老年大鼠肝脏氧化防御的信号通路(锂等。2011). 因此，我们选择这三种miRNAs作为我们的研究重点是基于它们对同一基因IGF1R的共同功能影响，而不是传统的选择变化最大的miRNA的方法。同样，尽管在miR-681转导的人成纤维细胞培养物中观察到AKT的抑制，但其他两种miRNAs，即miR-470和−669b，并不共享AKT。未来的实验将特别关注miR-681和AKT抑制之间的功能关系，测试这一单一miRNA在本文讨论的三种miRNA中是否占主导地位，以及它是否对控制IGF信号通路发挥额外作用。

我们目前的结果表明图6显示了Ames侏儒和GHRKO小鼠大脑中GH缺乏信号传导中基于miRNA的分子途径。我们的结果首次提出了一种机制，通过三种miRNAs（miR-470、−669b和−681）直接抑制IGF1R，以调节功能丧失操作模式中的信号级联。这三种miRNAs在这两种突变小鼠GH信号缺失环境中上调的原因和方式尚待进一步研究。在GH缺乏的长寿小鼠中发现激活这些miRNAs的转录因子可能为在野生型小鼠中表达它们提供未来的线索，从而获得像长寿突变体那样的认知稳健性和健康寿命，这是长寿研究的最终梦想。

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图6

MiRNA介导的长寿小鼠重叠生长激素信号转导的改变

该示意图显示了两种长寿小鼠模型（Ames侏儒小鼠和GHRKO小鼠）中常见的基于miRNA的调节。它描述了靶向GH/IGF1轴关键基因IGF1R的三种关键miRNAs（miR-470、−669b和−681）的作用，并改变GH信号，从而促进长寿。

实验程序

补充材料

致谢

脚注

工具书类