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神经科学杂志。2012年2月8日；32（6）：2062–2085。
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.5259-11.2012
预防性维修识别码：项目经理3556384
EMSID:EMS51164系列
PMID：22323720

帕金森病MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）小鼠模型脑室下区神经前体细胞的可塑性涉及炎症和Wnt/β-连环蛋白信号通路之间的相互作用：神经保护和修复的功能后果

弗朗西丝卡·圣公会,1 卡塔尔多·蒂洛洛,1 Nunzio Testa公司,1 Salvatore Caniglia公司,1 玛丽亚·莫拉莱,1 米歇拉·德莱迪,2 玛丽亚·塞拉皮德,三 斯特凡诺·普卢奇诺,2,4和比安卡·马切蒂通讯作者1,5
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

在帕金森病（PD）中，在灵长类、非人类和啮齿动物PD模型中，死后人类PD大脑脑室下区（SVZ）的神经发生受损无翼MMTV集成站点（Wnt）/β-catenin神经发生、神经保护和突触可塑性调节中的信号转导与我们最近的发现相结合，揭示了炎症和Wnt（重量）/β-连环蛋白MPTP诱导的黑质纹状体多巴胺能（DA能）神经元丢失和修复中的信号转导促使我们研究神经炎症和Wnt（重量）/β-连环蛋白MPTP-处理小鼠SVZ神经递质（NPC）反应中的通路。体内实验，使用溴脱氧尿苷和细胞特异性标记，以及体外时间进程分析表明，在小胶质细胞反应最大加重期，NPC增殖减少与新成神经细胞的生成呈负相关，而小胶质细胞促炎表型的改变与NPC的逐渐恢复相关。体外和在体外使用小胶质细胞-鼻咽癌共培养范式的实验表明NADPH-氧化酶（gpPHOX91)活性氮是小胶质细胞活性氧的主要来源，通过激活糖原合成酶3（pGSK-3β泰尔216)导致β损失-连环蛋白，一个主要的下游转录效应器。因此，MPTP/MPP+（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）引起β-catenin下调和pGSK-3βTyr216型过度表达，而操纵Wnt（重量）/β-连环蛋白RNA干扰介导的信号传导GSK-3型β敲除或GSK-3β拮抗逆转MPTP诱导的神经源性损伤离体/体外或体内.反过来，炎症的药理调节可阻止β-连环蛋白下调和恢复神经发生，表明有可能调节这种内源性系统，从而对DA能神经保护和自我修复产生潜在后果。

介绍

大脑脑室下区（SVZ）中新神经元的生成在成年人的一生中都在继续，可能有助于脑损伤和/或疾病后的内源性修复机制(Curtis等人，2007年). 帕金森氏病（PD）是一种神经退行性疾病，其特征是黑质致密部多巴胺能（DA能）神经元选择性变性，神经发生受损。在灵长类非人类、啮齿类动物1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）和6-羟基多巴胺模型中，人类帕金森病脑SVZ中神经干/祖细胞（NPC）的增殖减少归因于神经递质多巴胺的损失(贝克等人，2004年；Hoglinger等人，2004年；Freundlieb等人，2006年；O'Keeffe等人，2009年a；Lennington等人，2011年). 其他研究也提出了MPTP的多巴胺依赖性效应，但目前尚不清楚MPTP对SVZ细胞发挥直接作用的细胞因子和信号通路(He等人，2006年；Shibui等人，2009年). 在这里，我们以胶质细胞为重点，分析了MPTP、星形胶质细胞和小胶质细胞对PD的SVZ反应的影响。

事实上，NPC与周围的胶质细胞密切接触，形成所谓的SVZ“干细胞生态位”，可以影响NPC的增殖和分化(Lim和Alvarez-Buylla，1999年；Alvarez-Buylla等人，2001年；Song等人，2002年；哈萨克斯坦，2009年). 重要的是，在PD实验模型SVZ边缘的纹状体中，星形胶质细胞和小胶质细胞表现出显著的形态和功能变化，包括一系列促炎和抗炎细胞因子和趋化因子的表达，以及活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的产生 (Marchetti和Abbracchio，2005年；高和洪，2008；Hirsch和Hunot，2009年). 特别值得注意的是，MPTP依赖的炎症机制被认为是导致黑质纹状体D能退化和自我修复的原因(L'Episcopo等人，2010a). 然而，参与神经发生的神经炎症调节的潜在信号通路(Ekdahl等人，2003年,2009；Monje等人，2003年；Butovsky等人，2006年；Pluchino等人，2008年)PD中的定义不明确。

一种主要参与调节神经发生、神经保护和突触可塑性的有吸引力的途径是无翼MMTV集成站点（Wnt）/β-catenin信号系统(Kalani等人，2008年；Maiese等人，2008年；托莱多等人，2008年；Munji等人，2011年；Zhang等人，2011年). 这个Wnt（重量）/β-连环蛋白通路在中脑DA能神经元的生成、存活和保护中起着核心作用(Prakash等人，2006年；Inestrosa和Arenas，2010年；L'Episcopo等人，2011年a,b条). 有趣的是，作为对黑质纹状体损伤的反应，反应性星形胶质细胞表达重量1并通过激活Wnt（重量）/β-连环蛋白信号(L'Episcopo等人，2011年a,b条). 此外，反应性星形胶质细胞和Wnt（重量）/β-连环蛋白信号激活促进成年NPC的神经发生(L'Episcopo等人，2011年a).

这里，使用体内,体外、和在体外实验；不同胶质细胞-鼻咽癌共培养范式；结合药理拮抗/RNA沉默实验和功能研究，我们提供了证据支持反应性星形胶质细胞和小胶质细胞在MPTP/1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPP）后SVZ生态位重塑中的积极协同作用+)损伤，至少部分受炎症和Wnt（重量）/β-连环蛋白信号级联，对DA能神经保护和自我修复具有潜在后果。

材料和方法

小鼠和治疗

8至10周龄雄性C57BL/6小鼠（体重24–26 g；Charles River，Calco）接受n个=4次腹腔注射溶媒（生理盐水，10 ml/kg）或MPTP-HCl（20 mg kg−1自由基；Sigma-Aldrich）溶于盐水中，1天内间隔2小时，根据急性MPTP注射范式(杰克逊·莱维斯和普雷德博斯基，2007年). 在MPTP给药后的不同时间点（1-42 d）处死小鼠（参见图1A类). 研究按照实验动物护理和使用指南（NIH），并由机构动物护理和使用委员会批准。

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MPTP治疗后SVZ神经原细胞增殖和成神经细胞形成的丢失和恢复体内.A类，显示盐水和MPTP治疗后研究的时间点的实验设计方案（每个时间点7-8只小鼠）。对于体外对神经递质的研究，对SVZ区进行显微解剖并无菌制备以分离和培养NPC。对于免疫组织化学（IHC），对各组小鼠进行麻醉和经心灌注（每个时间点6只小鼠）。对于神经化学（NC）和Western blot（WB）分析（每个时间点5只小鼠），快速解剖大脑并将其储存在−80°C下。ICC，免疫细胞化学。B类，BrdU的典型共焦图像+（绿色）用核标记物PI（红色）复染，用GFAP（红色）和BrdU（绿色）双重染色，用GFAP（红色）、PCNA（绿色）和DCX双重染色+（红色）和BrdU（绿色）。C类、DCX和PCNA、EGF-R和PCNA以及GFAP和PCNA双重染色共聚焦显微图像的正交重建x–y,x–z轴、和y–z飞机。D类–J型，通过BrdU数量评估的增殖量化+和PCNA+单元格(D类); GFAP公司+单元格编号(E类)和GFAP百分比+表达BrdU(F类); DCX公司+单元格编号(G公司)和DCX百分比+表达BrdU(H（H）); 和EGF-R+单元格编号(我)和EGF-R百分比+表达BrdU(J型). 通过ANOVA分析差异，然后进行Newman–Keuls检验，当第页< 0.05. *第页<0.05与生理盐水相比；°第页在各组中，与1-14或1-7 dpt相比，<0.05。

在MPTP治疗后的指定天数，给小鼠注射溴脱氧尿苷（BrdU；50 mg kg−1，注射四次，间隔2小时）根据Ahlenius等人（2009年）最后一次注射后2小时死亡。

免疫组织化学

对小鼠进行深度麻醉并经心灌注，仔细取出大脑，过夜后固定，置于0.1的20%蔗糖中米磷酸盐缓冲液24小时，冷冻（−80°C），储存至进一步分析(Morale等人，2004年). 收集包含SVZ（前角0.74、0.5、0.14和0.02 mm）的冠状切片（14μm厚），根据Paxinos和Watson（1997）并安装在poly上-我-赖氨酸涂层载玻片。使用了以下预吸收的一级抗体：大鼠抗BrdU（1:200；Sigma-Aldrich）、山羊抗双皮质激素（DCX；1:400；Santa Cruz Biotechnology）、小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）（1:500；Dako）、鼠抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP；1:500；Sigma Aldrich，绵羊抗表皮生长因子受体（EGF-R；1:50；Millipore），山羊抗电离钙结合衔接子分子1（IBA1；1:200；Novus Biologicals），兔多克隆抗诱导型一氧化氮合酶（iNOS；1:200；Santa Cruz Biotechnology），兔抗3-硝基酪氨酸（3-NT；1:200；Millipore），大鼠抗多巴胺转运蛋白（DAT；1:500；Millipore）、小鼠抗神经元特异性核蛋白（NeuN；1:500；美国生物制品）和兔抗裂解半胱氨酸蛋白酶3（1:200；细胞信号技术）。PCNA的免疫组织化学要求通过在抗原回收液（10倍靶向回收液；Dako）中培养切片，将其稀释至蒸馏水中的1倍进行抗原回收。抗原回收溶液在80°C水浴中预热，然后添加切片30分钟。切片随后在室温下在PBS中清洗三次，然后进行免疫组织化学。合并的BrdU的可视化需要DNA变性，方法是将切片在65°C的HCl中培养30分钟。隔夜培养后，用CY3-偶联的驴抗鼠、驴抗兔和驴抗羊抗体（1:200；Jackson ImmunoResearch Laboratories）冲洗切片并在黑暗中培养2小时，将其安装在玻璃载玻片上，并用甘油基安装介质覆盖玻片。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）在载体实验室（Vector Laboratories）或碘化丙啶（PI）中对细胞核进行复染。在所有这些方案中，除了用PBS替换一级抗体外，空白样品与实验样品一样进行处理。

显微镜分析

对治疗情况进行盲法计数。使用徕卡LCS-SPE共焦显微镜检查免疫染色。简单地说，通过SVZ的四个冠状断面位于前角前0.74、0.5、0.14和0.02 mm处(Paxinos和Watson，1997年)，进行双边分析。BrdU的体视学估计+，PCNA+，DCX+、EGF-R+、GFAP+（SVZ每立方毫米的细胞数；Nv），使用半自动体视学系统（ExploraNova Mercator），使用传统体视学方程进行计算(冈德森和延森，1987年)，公式为：Nv=NC/(t吨+D类)，其中NC是每毫米的单元格数2,t吨是截面厚度，以及D类是细胞直径。定量每个表现型标记表达BrdU（即DCX）的百分比+/溴化铀+、EGF-R+/溴化铀+和GFAP+/溴化铀+使用LAS-SPE成像软件（Leica），在SVZ的高倍视野中对100个细胞在每个大脑的四个部分进行检测。三维重建z（z）-系列用于验证x–y（x–y）,y–z、和x–z轴平面（请参见图1C类).

纹状体多巴胺能终点的测定

利用计算机辅助图像分析软件（Leica）测量纹状体DAT-免疫活性（IR）纤维的荧光强度（FI），平均FI（平均值±SD）的变化表示为盐水注射对照组的百分比。在生理盐水和MPTP小鼠的Str中测定高亲和力突触项多巴胺摄取，多巴胺摄取水平（总高亲和力和不可抑制的马嗪多）表示为对照组的百分比，如所述(Morale等人，2004年；L'Episcopo等人，2010年b,2011年a,b条,c（c）).

SVZ解剖和细胞分离

用氟烷对动物进行深度麻醉，并因颈椎脱位而死。在指定的时间间隔【治疗后1–35天（dpt）】，从距离大脑前极2 mm（不包括视束）和之前切割后3 mm处的小鼠身上，取经溶媒和MPTP治疗的小鼠的脑冠状切片；参见图2]. 然后在显微镜下解剖SVZ。将解剖的组织转移到含有1 mg/ml木瓜蛋白酶（27 U/mg；Sigma-Aldrich）、0.2 mg/ml半胱氨酸（Sigma-Aldrich）和0.2 mg/ml EDTA（Sigma-Aldrich。然后将组织转移到含有0.7 mg/ml卵粘蛋白（Sigma-Aldrich）的DMEM/F-12培养基（1:1 v/v；Invitrogen）中，并进行机械分离。消化后，通过台盼蓝（Sigma-Aldrich）排除法测定活细胞数。绿色荧光蛋白阳性（GFP+)从SVZ中分离细胞，并按照前面的详细描述建立(Pluchino等人，2003年,2005；L'Episcopo等人，2011年a).

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分离的SVZ神经递质的固有特性分析体外来自车辆和MPTP小鼠。在指定的时间间隔内，取经溶媒和MPTP处理的小鼠的脑冠状切片，快速解剖SVZ并按所述进行处理。A类，定量分析幼年小鼠和MPTP处理小鼠的神经球克隆效率。数据表示为每种尺寸的菌落占总电镀细胞的平均百分比（±SEM），并从以下总数中获得n≥3个独立实验。B类，幼年和MPTP处理小鼠的神经球大小。数据以平均数（微米）（±SEM）表示，并从总计n≥3个独立实验。红色输入A类和B类代表来自幼年小鼠的神经球，而绿色代表来自MPTP处理的小鼠的神经小球。填充条形图A类和B类代表初级神经球，而宽向上的斜条代表次级神经球。C类，从幼年或MPTP治疗小鼠的SVZ建立的NPC株的生长率分析*第页≤0.005和**第页≤0.0001，与时间点匹配控制相比。p.n.，初级神经圈；s.n.，次级神经圈。

原代神经干/前体细胞培养

分析自我更新、持续在体外在神经圈生长培养基（DMEM/F-12，含2 m米 我-谷氨酰胺、0.6%葡萄糖、0.1mg/ml载脂蛋白转铁蛋白、0.025mg/ml胰岛素、9.6μg/ml腐胺、6.3 ng/ml黄体酮、5.2 ng/ml亚硒酸钠、2μg/ml肝素）补充EGF（20 ng/ml）和FGF2（10 ng/ml），如前所述，通过将扩增率（每250000个传代中获得的细胞总数）乘以前一传代中获取的细胞总数，计算出估计的细胞总数(Pluchino等人，2008年). 来自连续数据在体外繁殖实验表示为活细胞的绝对数量±SEM，总计n个≥3个独立实验。

体外神经球形成试验

从载体或MPTP处理小鼠的SVZ中分离出的原代细胞(n个≥4个/组），在密度为8000个细胞/cm的24孔无涂层板（0.5 ml/孔；康宁）中进行电镀2在生长培养基中，如所述(Gritti等人，2002年；Pluchino等人，2008年). 在这些条件下，神经球是由单个细胞衍生而来的，并作为体内神经干细胞(Morshead和van der Kooy，1992年；Morshead等人，1994年). 直径为的初级神经球数量(保存图片、插图等的外部文件。对象名为cjs1011.jpg)镀后7d计数每个孔≥100μm。为了确定自我更新能力，我们机械地将初级球体分离成单细胞悬浮液，并在与初级培养相同的条件下进行再培养。再次，我们在7天后测定次级神经球的数量。在倒置显微镜下测量单个初级和次级神经球直径（Axiovert S100TV）。数据表示为平均克隆效率（即集落形成细胞占总细胞的百分比）或平均直径（以微米为单位），两者均为n个≥3个独立实验。

体外微分条件

为了分析增殖，从生理盐水或MPTP小鼠建立的单个球体（例如，初级、次级；GFP+-表达细胞）被机械分离，单个细胞以1×10的最终密度被电镀5poly上的cells/cm-d日-赖氨酸涂层24孔板在分化培养基中，分化培养基由F-12和MEM的1:1混合物组成，含有HEPES和谷氨酰胺，以及N2补充剂（Invitrogen）和1%胎牛血清（FCS）。通过添加核苷酸类似物BrdU（5μ米)在2 DIV时，细胞培养中暴露于不同的处理/共培养模式，24小时后细胞固定（即在3 DIV时）。对于神经元分化研究，在不存在或存在不同的治疗/共培养范式的情况下，允许在分化培养基中电镀的神经球分化5-10 DIV，如所述。神经毒素MPP的直接作用+在生长有或没有胶质细胞的NPC中，以及在缺乏或存在Wnt/β-catenin信号的激活剂/抑制剂的情况下（参见图4,​,6,6,​,7),7)，如下所述。

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MPP的影响+有无胶质细胞共培养对鼻咽癌生存、增殖和分化的影响在体外.增加MPP剂量的影响+(5–50 μ米)在扩散中(A类)，差异化(B类)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3激活(C类)来自单独培养的成年SVZ的成年表达GFP的NPC(D类)或与纯化星形胶质细胞、纯化小胶质细胞或混合星形胶质细胞-小胶质细胞制剂共培养(E类,F类).A类以BrdU作为细胞增殖标志物，检测鼻咽癌细胞增殖情况。B类,F类，使用Tuj1在6 DIV时测量分化+(B类)使用Map2a在10 DIV处(F类)作为神经元分化标志物。C类用荧光底物DEVD-AFC测定细胞死亡标志物Caspase3活性。差异按照描述进行分析，并在以下情况下被视为显著差异：第页< 0.05. 仅在NPC中，GFP的百分比+表达BrdU（红色）的（绿色）细胞和Tuj1的百分比+GFP上的（红色）神经元+单元格(A类,B类,D类)MPP剂量依赖性降低+与PBS处理的对照组相比。类DEVD荧光信号(C类)在施用10和25μ米MPP公司+，但不是5μ米NPC与纯化的小胶质细胞或纯化的星形胶质细胞直接共培养显著增加了BrdU的比例+(A类)，图1+GFP中的（红色）细胞+（绿色）单元格(F类)和Map2a+单元格(B类,F类)与单独培养的NPC相比(B类,D类). NPC-Astro共培养接触MPP+有效防止MPP+-诱发的Tuj1降低+(F类)、BrdU(A类)、和Map2a表达式(B类,F类)而在NPC微共培养中，MPP+抑制作用没有逆转(A类,B类,F类). 使用间接共培养范式测量Caspase3活性(C类). **第页与单独的NPC相比<0.05*第页与PBS相比<0.05。星形胶质细胞植入可有效逆转MPP+-在10和20μ米而小胶质细胞植入物不能保护鼻咽癌(C类). 在混合星形胶质细胞-小胶质细胞培养物（NPC-glia，F类)增加星形胶质细胞与小胶质细胞的比率导致星形胶质细胞依赖性逆转小胶质细胞对鼻咽癌增殖、分化和生存的抑制作用，这由Caspase3活性决定（图。A类–C类,F类).

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MPTP诱导的神经发生受损体外和在体外与Wnt/β-catenin信号调节异常有关。NPC被严重隔离体外MPTP或生理盐水注射后7天，按照描述进行扩张，并使用BrdU、Tuj1和Map2a测量增殖/分化。A类，单独培养和从生理盐水或MPTP中分离的NPC的代表性免疫细胞化学图像，在没有或存在不同的处理，如所述。在MPTP小鼠的NPC中，观察到Map2a（绿色）和BrdU（红色）的急剧丢失。B类、分离的NPC在3 DIV时测得的增殖和在7 DIV时的分化体外来自生理盐水和MPTP小鼠，以及MPP的作用+ 在体外如前所述，将所示组的NPC暴露于不同的治疗，以及BrdU的百分比+或Map2a+测量DAPI染色细胞核上的细胞。C类，使用间接共培养范式通过Western blotting研究NPC中β-catenin和P-TyrGSK-3β的变化。研究了来自盐水和MPTP小鼠的NPC中的蛋白质水平(体外)以及直接接触MPP的盐水小鼠的NPC+(在体外). 使用β-肌动蛋白抗体进行检测，作为内部控制。这些值表示与对照组相比的β-catenin和P-TyrGSK-3β信号强度。Wnt激动剂的作用重量1（100 ng/ml）或GSK-3β拮抗剂（AR，5 n米)也进行了说明。分离的NPC中β-连环蛋白信号强度降低体外来自MPTP小鼠，而活性P-TyrGSK-3β信号增加。Wnt1和AR处理增加β-连环蛋白信号，而活性GSK-3β信号降低。同样，NPC直接接触MPP+ 在体外还原β-连环蛋白活性GSK-3β增加时的信号，而Wnt1和AR治疗均增加β-连环蛋白降低激活GSK-3β信号时的信号强度(C类). 注意Map2a中的显著增加+（绿色）过程长度(A类)和Map2a+单元格编号(B类)在接触Wnt激动剂Wnt1（100 ng/ml）的NPC中。D类,E类，NPC隔离体外用GSK-βsiRNA瞬时转染MPTP小鼠(D类)而来自盐水小鼠的NPC瞬时转染β-连环蛋白小干扰RNA(E类)或控制siRNA（详见正文）。Western blotting证实，用GSK-βsiRNA转染MPTP小鼠NPC可降低GSK--连环蛋白(D类)，而β-连环蛋白在盐水小鼠NPC中引入siRNA可降低β-连环蛋白不改变GSK-β信号的表达(E类). 注意Map2a（绿色）电池产量增加(A类)在MPTP小鼠NPC中引入GSK-3βsiRNA后(A类).F类用PBS或Wnt1（100 ng/ml）处理分化培养基中生长的表达GFP的NPC 72 h-连环蛋白（红色）和GFP（绿色）显示了β-catenin-IF信号在PBS处理的GFP的细胞膜上的分布，而Wnt1的应用使β-连环蛋白-膜、细胞质和生长GFP的IF信号+过程。

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星形胶质细胞共培养和Wnt/β-catenin信号激活对抗MPTP诱导的神经发生障碍体外.急性分离NPC体外MPTP或生理盐水注射后7天，按照描述进行扩张，并与纹状体星形胶质细胞共培养，以使用BrdU、Tuj1和Map2a进行增殖和分化研究。A类，从盐水或MPTP小鼠分离的NPC的代表性图像，与在3 DIV处用BrdU（绿色）和Tuj1（红色）染色的星形胶质细胞共培养，或在7 DIV处使用Map2a（绿色）与DAPI（蓝色）染色。注意Map2a显著增加+在生理盐水和MPTP-NPC中与星形胶质细胞共培养的（绿色）神经元产生和过程长度。Wnt/β-catenin拮抗Dkk1或β-catening沉默显著降低Map2a+（绿色）神经元产生和过程扩展。B类、分离的NPC在3 DIV时测得的增殖和在7 DIV时的分化体外来自盐水和MPTP小鼠。所示组的NPC暴露于不同的处理，以及BrdU的百分比+或Map2a+测量DAPI染色细胞核上的细胞。星形胶质细胞共培养显著降低MPTP诱导的受损增殖和分化（与图6,A类和B类). 请注意Wnt（重量）/β-连环蛋白Dkk1（100 ng/ml）的拮抗作用显著降低星形胶质细胞介导的MPTP小鼠NPC损伤逆转(A类,B类). 在来自盐水小鼠的NPC中，瞬时转染β-连环蛋白siRNA（参见图例图6)与星形胶质细胞共培养后，BrdU和Map2a急剧下降+细胞，与转染对照siRNA的NPC进行比较（详见正文）。在MPTP小鼠的NPC中，Dkk1和瞬时转染β-连环蛋白siRNA显著降低星形胶质细胞共培养的神经原性促进作用(A类,B类). *第页与PBS相比，盐水组和MPTP组分别<0.05**第页与生理盐水相比，NPC和NPC-Astro分别为<0.05。C类Western blotting在生理盐水和MPTP小鼠的NPC中进行，并使用间接共培养范式与星形胶质细胞培养，如所述。使用β-肌动蛋白抗体进行检测，作为内部控制。值代表β-连环蛋白与对照组相比，P-TyrGSK-3β信号强度。可比β-连环蛋白在与星形胶质细胞共培养的生理盐水和MPTP-NPC中观察到信号，而Dkk1治疗使β-连环蛋白生理盐水和MPTP-NPC中的信号，同时增加活性GSK-β信号的强度。

星形胶质细胞和小胶质细胞的分离培养

如详细描述的那样，在出生后第2至3天从小鼠大脑中获得混合胶质细胞培养物(Gallo等人，2000a；Gennuso等人，2004年). 允许培养物生长和分化，直到它们达到汇合点（14-16 DIV），并得到混合培养物（65±6%GFAP+星形胶质细胞，24±4%IBA-1+小胶质细胞和5±2%少突胶质细胞（免疫细胞化学法）用于共培养实验（NPC-胶质细胞）。对于纯化的小胶质细胞和纯化的星形胶质细胞制剂，如上所述建立的混合神经胶质培养物被允许生长和分化，直到汇合（14-16 DIV），当松散粘附的小胶质细胞通过在37°C和150 rpm下振荡5小时来分离时，计数，并在小胶质细胞培养基（RPMI-1640，补充10%FCS，1m）中培养米 我-谷氨酰胺，1米米丙酮酸钠，50 m米β-巯基乙醇、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素）。分离小胶质细胞后获得的初级星形胶质细胞（>95%的细胞为GFAP-IR星形胶质细胞）和富集的小胶质细胞（>95%的细胞是IBA1-IR小胶质细胞）单层用无菌PBS冲洗，并以0.4–0.6×10的最终密度替换5细胞/厘米2在聚乙烯中-d日-赖氨酸（10μg/ml）涂布的6孔、12孔或24孔板，或用于间接共培养的插入膜（0.4μm聚对苯二甲酸乙二醇酯）（BD Biosciences）。

胶质细胞-鼻咽癌共培养和治疗

MPP的直接影响+使用GFP在缺乏（单型培养）或存在（共培养）胶质细胞的情况下进行研究+单元格(L'Episcopo等人，2011年). GFP公司+第8-12代的细胞全部用于在体外实验。星形胶质细胞、小胶质细胞或混合星形胶质细胞-小胶质细胞单层与GFP新鲜共培养+根据增殖（3 DIV）和分化（5–10 DIV）研究，不同时间间隔的细胞(L'Episcopo等人，2011年a). NPC单型细胞和胶质细胞与NPC共培养细胞均接受了增加的剂量（5–25μ米)MPP的+（请参见图4). 这些剂量是根据我们先前对培养的初级中脑DA能神经元的研究选择的(L'Episcopo等人，2011年a；b条). 对于增殖研究，MPP+在2 DIV，核苷酸类似物BrdU（5μ米)添加，24小时后固定细胞，即在3 DIV。对于分化研究，GFP+单独生长的细胞，或在星形胶质细胞（NPC-Astro）、小胶质细胞（NFC-Micro）或混合星形胶质细胞-小胶质细胞制剂（NFC-glia）上分层生长的细胞在分化培养基中移动，细胞被允许分化。MPP公司+在5和9 DIV时进行，24小时后固定细胞（参见图4). 此外，我们还研究了GFP共培养的效果+分离出小胶质细胞”体外“来自幼稚或MPTP小鼠（参见图5). 反过来，星形胶质细胞与分离的鼻咽癌共培养的效果体外在未经Wnt/β-catenin信号激活/拮抗的情况下，也对幼年和MPTP小鼠进行了研究（参见图7).

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分离的小胶质细胞的作用体外MPTP小鼠对鼻咽癌生存和增殖/分化的影响。急性分离的巨噬细胞/小胶质细胞体外按照所述方法处理3天的盐水或MPTP小鼠，以测定PHOX、ROS和RNS，并与GFP共培养+NPC用于测定增殖和分化潜能。当第页< 0.05.A类–C类，通过Western blotting增加PHOX的表达(A类)，荧光探针二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA；B类)和iNOS衍生RNS恶化(C类)与无载脂蛋白（5 m）或有载脂蛋白的幼年小鼠巨噬细胞/小胶质细胞相比，小胶质细胞反应峰值（3 dpt）时的生成米)或使用L-Nil（50μ米）治疗*第页与生理盐水相比，<0.05。D类，显示IBA的代表性图像+在基础条件下和L-Nil后用DAPI（蓝色）或iNOS（红色）复染的小胶质细胞（红色）(F类).E类,F类、GFP+细胞暴露于任一小胶质细胞(E类)或混合插入物(F类)来自盐水或MPTP小鼠，在共培养实验中24小时，以及GFP+BrdU的细胞掺入和Map2a数量的变化+细胞测定*第页<0.05与生理盐水相比**第页与PBS相比<0.05。G公司代表性共焦图像显示，7 DIV时，IBA1（绿色）染色盐水小鼠的小胶质细胞和Map2a（红色）染色盐水鼠的NPC共培养。H（H）代表性图像显示NPC与生理盐水小胶质细胞或MPTP小胶质细胞共培养，经或不经L-Nil处理后，用Map2a（红色）染色，用DAPI（蓝色）复染。Map2a染色显示了生理盐水-小胶质细胞的神经原促进作用，而不是与MPTP-小胶质瘤共培养时对神经元形成的显著抑制，L-Nil可逆转这种作用。注意，L-Nil处理的小胶质细胞-鼻咽癌共培养中Map2a过程延长增加。我与MPTP–小胶质细胞共培养的NPC中检测到的DEVD样荧光信号表明激活Caspase3诱导的细胞死亡。J型,K（K）β-catenin的Western blot分析(J型)和活性GSK-3β(K（K）; 即，酪氨酸216残基磷酸化，pTyr216 GSK-3β）。如图所示，来自实验条带的数据归一化为β-actin或GSK-3β，数值表示为PBS处理的培养物暴露于盐水-小胶质细胞的百分比*第页<0.05与生理盐水相比**第页与实验组中的PBS相比，<0.05。

为了进行免疫细胞化学，细胞培养物固定在PBS中4%的多聚甲醛中，或用多聚甲醛/PBS固定，然后用冰镇酸性乙醇和HCl进行BrdU染色(L'Episcopo等人，2011年a). 使用以下标记物：小鼠抗Tuj1（Covance Research Products）和兔抗微管相关蛋白2abc（Map2a；Abcam）作为神经元标记物；兔抗GFAP（Millipore）、大鼠抗BrdU（Abcam）、小鼠抗BrdU（Dako）、山羊抗IBA1（Novus Biologicals）、兔多克隆和抗iNOS（Santa Cruz Biotechnology）。细胞核用DAPI复染。使用共焦激光显微镜和计算机辅助图像分析（徕卡）进行分析。为了量化表达给定标记或标记组合的细胞数量，Map2的数量+细胞是相对于DAPI标记的细胞核总数或相对于GFP测定的+细胞；BrdU数量+细胞是相对于DAPI的总数测定的+细胞或GFP+单元格，使用Leica Lite软件和三维叠加以避免假阳性/阴性叠加和重复计数。

体外巨噬细胞/小胶质细胞的分离和培养，RNS和细胞内ROS的测量

从生理盐水和MPTP小鼠中分离脑巨噬细胞/小胶质细胞n个=每组8只小鼠，如详细说明(Marchetti等人，2002年；Morale等人，2004年；L’Episcopo等人，2011年c)在生理盐水或MPTP后第3天（即小胶质细胞激活的峰值；参见图3B类). 细胞被免疫反应为活化的巨噬细胞/小胶质特异性[IBA1；巨噬细胞抗原-1（Mac-1）/CD11b]和非特异性（GFAP用于星形胶质细胞，半乳糖脑苷用于少突胶质细胞，或神经丝用于神经元）标记。分离细胞（>95%IBA1+细胞）计数并以0.4–0.6×10的最终密度进行电镀5细胞/厘米2在聚乙烯中-d日-赖氨酸（10μg/ml）涂层的6孔、12孔或24孔平板，或插入膜（0.4μm聚对苯二甲酸乙二醇酯）用于间接共培养（BD Biosciences）。细胞在小胶质细胞培养基（RPMI-1640，补充10%FCS，1 m）中培养米 我-谷氨酰胺，1米米丙酮酸钠，50 m米β-巯基乙醇、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素），并按如下方式使用。部分细胞在电镀24–48小时后处理，使用氧化还原膜渗透探针2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA；50μ米，在37°C下添加1 h），并在共焦显微镜下观察细胞(Gennuso等人，2004年). 使用Griess试剂在无细胞上清液中测量iNOS衍生NO(Marchetti等人，2002年；Morale等人，2004年；L'Episcopo等人，2011年c). 为了研究氧化和硝化应激介质的抑制作用，新制备的IBA1+细胞在没有或存在ROS拮抗剂罗布青素（Apo；0.5 m）的情况下培养米)(Gao等人，2003年)和特异性iNOS抑制剂L-Nil[我-N个6-（1-亚氨基乙基）-赖氨酸，50μ米; Sigma-Aldrich公司](Marchetti等人，2002年；Morale等人，2004年)在电镀后使用，并在处理后24–48小时进行测定（参见图5).

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MPTP-依赖性小胶质细胞激活与SVZ细胞增殖之间的负相关。处死用生理盐水或MPTP治疗的小鼠，并对其大脑进行免疫组织化学或Western blot分析。A类，显示MPTP后1、3和42天在盐水中用IBA1（红色）和BrdU（绿色）双重染色的代表性共聚焦图像。注意第1阶段IBA1的并置+细胞体和BrdU处理+盐水小鼠SVZ中的细胞。MPTP激活IBA1后12小时内+在24 h和3 dpt，IBA1期，在Str中观察到表达PCNA的小胶质细胞+Str和SVZ均可见小胶质细胞。到42 dpt，BrdU+SVZ和IBA1+小胶质细胞恢复到盐水处理对照组。B类，用PCNA测量SVZ中NPC增殖之间的反向相关性（PCNA数量+单元格/10三)和第4阶段IBA1+小胶质细胞（每立方毫米的细胞数）。通过ANOVA分析差异，然后进行Newman–Keuls检验，当第页< 0.05. *第页<0.05 IBA1+细胞与盐水和°第页<0.05 PCNA+每个实验组内的细胞与生理盐水。C类,D类，Mac-1的Western印迹(C类)和电话(D类)在注射生理盐水或MPTP后的Str中。在统计ANOVA之前，将来自实验条带的数据归一化为β-actin，并将值表示为盐水注射对照组的百分比。差异分析如上所述。°,*第页与生理盐水相比，<0.05。E类用iNOS（红色）和IBA1（绿色）、3-NT（红色）、GFAP（绿色）进行双重免疫染色，在Str和SVZ中用盐和3dpt进行裂解Caspase3（红色）及NeuN（绿色）的双重免疫染色。注意IBA1中iNOS表达增加+MPTP后3d，小胶质细胞增加了Str星形胶质细胞和SVZ中的3-NT共定位（橙色到黄色），增加了SVZ中Caspase3的定位。F类，IBA1+/iNOS细胞计数为1、3和21dpt。G公司，免疫印迹显示Str和SVZ蛋白提取物中3-NT增加，峰值为3dpt，下降21dpt。

分离小胶质细胞的共培养体外来自含GFP表达NPC的盐水和MPTP小鼠

研究小胶质细胞暴露的影响体内针对MPTP（MPTP-microglia）对NPC神经发生潜能的影响，将上述从生理盐水和MPTP小鼠中新分离的小胶质细胞制剂与GFP共培养+NPC。作为对照（ct-insert），使用非小胶质细胞制剂（即神经元GT1-7细胞）(Gallo等人，2000年b). 在增殖研究中，将NPC分层在小胶质细胞单层的顶部，24小时后，将核苷酸类似物溴脱氧尿苷（5μ米)24小时后（即小胶质细胞暴露48小时后），细胞固定。为了进行分化研究，NPC在上述分化培养基（不含生长因子的N2培养基和1%FCS）中生长3-4 DIV，在顶部添加新制备的小胶质细胞，并将细胞固定在5-6 DIV（小胶质暴露后48小时）。按所述固定培养物并进行荧光免疫细胞化学处理。间接共培养范式，即暴露于盐水-小胶质细胞、MPTP-小胶质或ct-insert的NPC，如上所述。将含有生理盐水、MPTP-小胶质单层或ct-插入物的插入物添加到NPC的顶部(L’Episcopo等人，2011年a). 通过计算GFP的数量来估计NPC的存活率+DAPI阳性细胞核上的细胞以及通过测定Caspase3活性（参见图5).

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性

为了验证细胞存活率的变化，将细胞放在含有25 m米HEPES，5米米EDTA，1米米EGTA，5米米氯化镁2，5米米二硫苏糖醇（DTT），1 m米苯甲基磺酰氟和10μg/ml胃蛋白酶抑制素和leupeptin，pH 7.5。将细胞放在冰上20分钟，然后进行超声波处理。以10000×克，上清液在甲醇干冰浴中快速冷冻并储存在−80°C。将裂解产物（30μg蛋白质）在37°C的25 m缓冲液中培养米HEPES，pH 7.5，10%蔗糖，0.1 3-[（3-胆酰胺丙基）二甲基铵]-1-丙磺酸盐，和10 m米荧光底物DEVD-AFC的DTT（15μ米二甲基亚砜；钙生物化学），并在发光分光光度计中评估DEVD类荧光信号的量化（激发，400 nm；发射，505 nm）(L'Episcopo等人，2011年b). 酶活性表示为任意荧光单位。

蛋白质印迹分析

炎症介质和Wnt-β-连环蛋白通过Western blot分析研究信号成分(L’Episcopo等人，2010年a,2011年a,b条,c（c）). 从生理盐水或MPTP小鼠分离的组织（Str、SVZ）中制备蛋白质提取物(n个=每组每个时间点6个），以及不同实验组内的细胞培养。将蛋白质样品稀释至含有20μg蛋白质的等体积，并在等体积的Laemmli-SDS煮沸缓冲液（Sigma-Aldrich）中煮沸10分钟。将样品装入9-12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，并在100 V下通过电泳分离3小时(L'Episcopo等人，2010年b,2011年a,b条,c（c）). 将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（GE Healthcare）上，在300 mA下持续1.5 h。使用以下主要抗体：兔抗Mac1（Abcam）；兔抗p47PHOX（Millipore）；小鼠抗gp91PHOX、小鼠抗β-连环蛋白、兔抗3-NT和小鼠抗糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）（均来自转导实验室）；和小鼠抗GSK-3β磷酸化Tyr216（BD Biosciences）。重新制备膜用于β-肌动蛋白（细胞信号技术）或GSK-3β免疫标记，作为内部对照。使用ImageQuantity One在x射线胶片上对来自Western blots的条带进行密度定量。实验条带的数据归一化为β-肌动蛋白。数值表示为注入盐分的对照组的百分比（参见图3,​,5,5,​,9)9)或作为与生理盐水对照相比的信号强度值（倍数变化）（参见图6,​,7).7). Western blot测量独立重复三次。

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炎症的药理调节体内防止β-连环蛋白下调并逆转MPTP诱导的SVZ损伤。给小鼠喂食对照（Ct）或HCT1026（HT）饮食，从注射生理盐水或MPTP前7天开始，一直喂食到将其杀死。A类,B类β-catenin的Western blot分析(A类)以及从对照和治疗小鼠分离的SVZ蛋白提取物中的活性GSK-3β（即酪氨酸216残基磷酸化，pTyr216 GSK-3？，B）*第页实验组内，与MPTP相比，<0.05。C类，β双重定位的典型共焦图像-连环蛋白（红色）和IBA1+喂食对照组或HCT1026饮食的小鼠中的小胶质细胞（绿色）、β-连环蛋白（红色）和GFAP（绿色），无论是否喂食MPTP治疗。注意β的显著损失-连环蛋白-喂食对照饮食和HCT-1026的小鼠MPTP后的IF信号诱导β-连环蛋白-SVZ中的中频信号丢失。D类、BrdU+在没有或存在MPTP治疗的情况下，喂食对照组或HCT11026饮食的小鼠SVZ中的细胞数。E类，在喂食Ct或HCT11026饮食的小鼠中表达DCX的NPC的百分比。F类,G公司、GFAP+(F类)和4期小胶质细胞(G公司)喂食Ct或HCT1026饮食的小鼠Str中的细胞数。通过ANOVA分析差异，然后进行Newman–Keuls检验，当第页< 0.05. *与生理盐水相比。H（H），BrdU的共焦图像+（绿色）用核标记PI（红色）复染，显示BrdU缺失+喂食Ct饮食的MPTP小鼠的细胞数和喂食HCT1026的小鼠的显著逆转。注意DCX的双重本地化+成神经细胞（红色）和GFAP+喂食HCT1026小鼠的MPTP小鼠SVZ中的星形胶质细胞（绿色）可逆转DCX损伤。GFAP双重染色+用对照饮食喂养的MPTP小鼠中用PI（红色）复染的星形胶质细胞（蓝色）和BrdU（绿色）类似地显示了HCT1026饮食的SVZ拯救作用。喂食HCT1026的MPTP小鼠的神经元细胞标记物NeuN（蓝色）、BrdU（绿色）和IBA1（红色）的三重染色显示，喂食ct饮食的MPTP诱导的微胶质增生显著逆转，并减少了小鼠的增殖。我,J型，通过测量Str中DAT-IR纤维的FI确定纹状体D能神经支配(我)纹状体突触体对DA的摄取(J型). 数据表示为注入盐分的对照组的百分比值。K（K），代表性图像显示，与喂食HCT1026的小鼠相比，喂食Ct饮食的MPTP小鼠在14dpt时出现DAT免疫荧光（绿色）。请注意，与喂食ct饮食的MPTP小鼠相比，MPTP-HCT1026具有显著的DA能神经保护作用。

RNA提取、反转录和实时PCR

调节障碍Wnt（重量）/β-连环蛋白此外，还研究了MPTP小鼠SVZ细胞中的信号通路，以测量轴2，直接Wnt（重量）在接收到Wnt（重量）/β-连环蛋白信号(Jho等人，2002年). 使用转子式均质器对MPTP和盐水注射小鼠的细胞样本进行RNA提取，将其均匀化于1ml齐阿唑裂解试剂（79306；QIAGEN）中，如详细说明(L'Episcopo等人，2011年a,b条). 使用RNeasy脂质组织试剂盒（74804；QIAGEN）从均质样品中分离出总RNA，包括酶消化。最后，将RNA样品重新溶解在30μl无RNase水中，并用A分光光度法测定其浓度260（纳米滴-ND 1000）；使用逆转录试剂盒（Ambion）从2μg总RNA合成cDNA。使用QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化后，使用预先开发的Taqman分析试剂（Applied Biosystems）对250 ng cDNA进行实时PCR。根据制造商的协议，使用TaqMan通用PCR主混合液（4304437），使用第一步检测系统（Applied Biosystems）进行实时定量PCR。的分析标识轴2（Mm00443610_m1和β-catenin（Mm0483039_m1）来自Applied Biosystems。对于每个样本，我们设计了一个重复分析，β-actin（4352341E；Applied Biosystems）被用作看家基因。结果以任意单位表示。

操纵的影响Wnt（重量）/β-连环蛋白信号在体外

药理激活/拮抗。

研究药物激活Wnt（重量）/β-连环蛋白仅在NPC中进行信号传导，我们使用特异性GSK-3β抑制剂AR-AO14418[N个-（4-甲氧基苄）-N′-（5-硝基-1,3-噻唑-2-基）脲]（AR；5μ米；Osakada等人，2007年；L'Episcopo等人，2011年a,b条)或Wnt配体Wnt1（100 ng/ml）。在MPP前1小时施用AR或Wnt1+/PBS暴露，24小时后固定NPC(L'Episcopo等人，2011年a,b条). 对于Wnt（重量）/β-连环蛋白我们使用Dickkopf-1进行星形胶质细胞与鼻咽癌共培养的拮抗性研究(Dkk-1型; 100纳克/毫升；研发系统）。Dkk-1型是LRP6的高亲和力配体，通过阻止Wnt诱导的Fzzled（Fz）-脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）复合物的形成来抑制Wnt信号(Semönov等人，2001年). Dkk1在与星形胶质细胞共培养开始前应用于NPC，并在指定的时间间隔固定细胞以进行增殖/分化研究。

用小干扰RNA暂时沉默基因。

为了测试GSK-3型β或β-连环蛋白蛋白质耗竭，我们使用小干扰RNA（siRNA）进行靶向mRNA降解，基本上如所述(Brazas和Hagstrom，2005年). GSK-3βsiRNA（sc-3525）、β-连环蛋白siRNA（sc-29210）(何和申，2009)和对照siRNA（sc-37007）购自Santa Cruz Biotechnology，siRNA的引入是根据Santa Cru z Biotechnology提供的协议进行的，如我们之前的研究中详细报道的(L'Episcopo等人，2011年b). 简言之，为了制备脂质siRNA复合物，将100μl转染培养基（sc-36868）中的80pmol指示的siRNA双链体和100μl转染培养基中的6μl siRNA转染试剂（sc-29528）合并，在25°C下孵育30分钟，并用800μl预热的转染培养基稀释。用无血清DMEM冲洗一次生理盐水和MPTP小鼠的NPC，将其分离并置于生长培养基中的24个板细胞上，每孔涂1000μl上述脂质-siRNA混合物。在37°C下，在5%的加湿CO中培养6小时后2细胞培养室中，每孔额外添加1 ml 20%FBS于DMEM中，并允许脂肪感染持续过夜。第二天早上，抽吸脂质感染培养基，并用新鲜的生长培养基对转染细胞进行重新筛选。转染72小时后收集细胞进行Western blot分析。

操纵的影响Wnt（重量）/β-连环蛋白信号，体内

全身注射和侧脑室注射。

将Wnt/β-catenin信号通路与MPTP诱导的神经源性损伤联系起来体内，我们研究了（1）通过全身或SVZ给药，使用特定GSK-3β抑制剂AR对Wnt/β-catenin信号的药理激活作用(Adachi等人，2007年；L'Episcopo等人，2011年a,b条)（2）侧脑室注射Dkk1对Wnt/β-catenin信号拮抗的影响(Zhang等人，2008年)在没有或存在AR系统管理的情况下。进行了初步实验，以验证剂量和时间能够降低完整和MPTP小鼠SVZ中活性GSK-3β。为了测试全身效应，以剂量方案（10 mg/kg，每天两次）腹腔注射AR(L'Episcopo等人，2011年a,b条)，MPTP后3小时启动。为了杀死小鼠，我们选择了MPTP后3d，对应于最大的神经源性损伤和加重的小胶质细胞反应（参见图3).

对于脑室内输注，AR（100μ米)或单独使用载体，用微型渗透泵（1007D型；流速，0.5μl/h；Alzet-Osmotic泵，加利福尼亚州库比蒂诺）注入大脑左侧脑室。将套管立体定向植入以下坐标：前，0 mm；横向，1.1 mm；深度，2.3 mm（相对于脑角和脑表面）。对于Wnt（重量）/β-连环蛋白拮抗作用，我们使用重组人Dkk1蛋白（rh-Dkk1；R&D Systems）脑室内输注，基本上如Zhang等人（2009）所述。将Dkk1溶于无菌生理盐水（0.9%NaCl）中，最终浓度为1μg/μl。注射Dkk1公司或使用2μl Hamilton微量注射器单侧进行上述操作。以0.25μl/min的速度注入溶液。每次输液后，针头在缩回前保持原位5 min。要解决以下问题Wnt（重量）/β-连环蛋白激活以反转Dkk1公司效果，单侧输液Dkk1公司或在侧脑室给药前48小时开始进行上述生理盐水或AR全身注射。48小时后处死小鼠Dkk1公司/注入载体，然后按照蛋白质表达、神经化学和组织病理学测定的描述对大脑进行处理。

炎症的药理调节作用。

研究炎症的药理调节是否影响MPTP损伤后鼻咽癌的增殖Wnt（重量）/β-连环蛋白SVZ中的信令体内，我们研究了环氧合酶抑制剂NO-释放药物（CINOD）2-氟-α-甲基（1,1′-联苯）-4-乙酰-4-（亚硝基）丁酯（HCT1026；由意大利米兰布雷索尼科研究所善意提供）的作用，该药物属于一类新型非甾体抗炎药，具有显著降低副作用的作用(基布尔和摩尔，2002年；Fiorucci等人，2007年；L'Episcopo等人，2010年b,2011年c). 在饮食中以剂量方案（HCT1026，饮食中190 ppm或30 mg kg−1与喂食对照饮食的小鼠相比，每只动物每天摄入一次）可以减轻神经胶质炎性反应并提供DAergy神经保护（参见L'Episcopo等人，2010年b,2011年c). 在MPTP前7天开始喂食HCT1026，在MPTP后3天（神经炎症小胶质细胞反应高峰）和14天（对应DAergy变性稳定期）处死小鼠(杰克逊·莱维斯和普雷德博斯基，2007年；L'Episcopo等人，2010年b,2011年a).

数据分析

通过双向方差分析和Student’st吨测试配对或未配对数据。学生-纽曼-基尔斯对不同日期进行的实验系列进行了比较t吨测试。值为第页<0.05被认为具有统计学意义。

结果

MPTP治疗后SVZ NPC增殖和成神经细胞形成的丢失和恢复

为了评估炎症反应在SVZ反应中的作用，我们首先验证，体内根据急性MPTP注射范式，黑质纹状体DA能神经元丢失和恢复期间不同时间间隔（1–42 d）增殖和成神经细胞形成的时空变化(L'Episcopo等人，2011年a)并关联鼻咽癌固有增殖能力的时间变化，体外(图1A类). 如啮齿动物和灵长类PD模型所述(Baker等人，2004年；Borta和Hoglinger，2007年；O'Keeffe等人，2009年a)，我们发现MPTP诱导PCNA显著降低+和BrdU+(图1B类,D类)MPTP损伤后1d开始，14dpt（从盐水小鼠的16.5±2.0到6.0±0.5×10三PCNA公司+细胞测量14dpt）。

MPTP小鼠的增殖减少伴随着DCX的严重减少+成神经细胞(图1B类,G公司)1–14dpt（从盐水小鼠的870±25到280±35×10三DCX公司+细胞测量14dpt）。神经源性损伤的时间窗与DA能退化期相关，如Str中近70-80%的DAT蛋白耗竭所测，同时纹状体突触体对高亲和力DA的摄取也相应减少(表1). 在中脑水平，MPTP累积剂量为80 mg kg−1导致DAergic细胞体严重（≥60%）丢失，测量值为1–21dpt(L'Episcopo等人，2011年a).

表1。

MPTP诱导纹状体多巴胺能端点的丢失和恢复

分析MPTP时间进程
MPTP公司+1+14+21+28+35天+42天
DAT免疫反应性（FI，对照组百分比）100 ± 1522 ± 8*25 ± 10*38 ± 9*51 ± 9*65 ± 10*75 ± 12
[三H] DA摄入（对照的%）100 ± 1831 ± 10*29 ± 8*35 ± 10*45 ± 10*58 ± 12*68 ± 12

雄性C57BL/6小鼠n个=4次腹膜内注射载体（生理盐水，10 ml/kg）或MPTP HCl（20 mg/kg−1自由基；Sigma-Aldrich）溶于盐水中，在1天内间隔2小时。对于每组分析，在指定的时间点使用五只小鼠。按照DAT免疫组织化学的指示对大脑进行处理。荧光强度值（平均值±SEM）表示为盐水百分比。突触高亲和力[三H] 如上所述测定纹状体中的DA摄取（总的高亲和力和马吲唑不可抑制），其值由DA摄取的变化表示（以对照的百分比表示）。通过ANOVA分析差异，然后进行Newman–Keuls检验，当第页< 0.05.

*第页与MPTP相比<0.05。

重要的是，在14-28dpt之间，细胞增殖显著恢复(图1B类,D类)在SVZ中观察到，达到MPTP前值的时间分别为35和42 dpt（13.0±1.2和15.0±1.5×10三分别在35和42 dpt下测量PCNA细胞）。同样，DCX+单元格(图1B类,G公司)在14至28 dpt之间表现出显著的恢复，在35至42 dpt时恢复正常（798±35和875±48×10三DCX公司+细胞分别为35和42 dpt），与进行性纹状体DA能神经再支配相一致(表1). 在中脑水平，35–42 dpt时观察到D能细胞丢失减少（≤38%）(L'Episcopo等人，2011年a).

如之前在黑质纹状体受损啮齿动物中观察到的(Mao等人，2001年；L.W.Chen等人，2002年,2004；Morale等人，2004年,2006；Mohapel等人，2005年；L'Episcopo等人，2010a,b条,2011年a,b条)和灵长类动物(Tandé等人，2006年)，MPTP小鼠Str中星形胶质细胞数量显著增加，这一现象被认为是纹状体固有的胶质前体细胞早期反应的结果(Tandé等人，2006年；Borta和Hoglinger，2007年). 这里是专门的GFAP+邻近SVZ的星形胶质细胞（B细胞），包裹BrdU+MPTP损伤后，盐水注射小鼠的细胞也受到明显影响(图1B类)：GFAP+星形胶质细胞增加（从盐水小鼠的120±12增加到205±16×10三GFAP公司+细胞测量值为14dpt），显示出高度反应的表型，如肥大的细胞体和增加的突起厚度和长度所示，导致GFAP的全面破坏+–BrdU+SVZ中的细胞相互作用(图1B类,E类). 然而，随着时间的推移，GFAP+星形胶质细胞转移到反应性较低的表型，SVZ中与NPC的形态学相互作用似乎恢复到盐水注射对照组(图1B类). SVZ星形胶质细胞是不经常分裂的干细胞，它产生经常分裂、传递放大的C细胞，反过来又产生限制性成神经细胞，即A细胞(Doetsch等人，1997年,1999). 先前的研究已经确定表皮生长因子是SVZ扩张的关键调节因子，EGF-R+SVZ中的细胞主要对应于快速循环的转运扩增C细胞(Doetsch等人，2002年). 鉴于MPTP后C细胞增殖减少的迹象(Hoglinger等人，2004年；O'Keeffe等人，2009年a；b条)接下来，我们分析了BrdU/PCNA和神经母细胞标记物DCX、BrdU/PCNA和GFAP的双重染色切片，以及作为C细胞标记物的BrdU/PCNA和EGF-R(Doetsch等人，2002年；Hoglinger等人，2004年；O'Keeffe等人，2009年b)(图1C类,F类,H–J). 根据以前的研究，DCX的百分比+表达BrdU的细胞(图1H（H）)或GFAP的百分比+表达BrdU的细胞(图1F类)，在SVZ受损期间没有显著变化，而GFAP增加+MPTP损伤后24小时内，在MPTP小鼠的Str中观察到表达PCNA的细胞(图1B类). 尽管在本研究中没有特别提到，但我们没有发现明确的证据表明从Str到SVZ的细胞密度梯度为1–14dpt，尽管GFAP迁移+邻近Str的细胞可能解释了观察到的MPTP小鼠SVZ边缘星形胶质细胞密度增加的原因。另一方面，EGF-R的百分比+在神经源性损伤的时间窗内，表达BrdU的细胞显著减少(图1J型)而28dpt时，EGF-R的百分比+/溴化铀+细胞数量增加，在35–42 dpt内恢复到MPTP前的正常水平(图1J型)支持MPTP诱导EGF-R的急性降低+增殖可能减少DCX的生成+细胞。此外，SVZ恢复阶段涉及GFAP的标准化+–BrdU+细胞相互作用和EGF-R增加+细胞增殖，可能导致产生新的DCX+成神经细胞(图1B类).

下一步，我们通过使用一种新的神经干/祖细胞自我更新方法，研究了生理盐水处理和MPTP处理小鼠的NPC在指定时间间隔内内在特性的可能差异体外化验。研究表明，神经球形成细胞主要由C型（和B型）细胞组成在体外(Morshead等人，1994年). 因此，我们使用了一个完善的在体外用克隆神经球数量进一步表征MPTP小鼠SVZ干细胞群的神经球分析在体外作为推测干细胞绝对数量的度量体内(Morshead等人，1994年；Rietze和Reynolds，2006年；Pluchino等人，2008年). 我们观察到，在MPTP后的所有时间点，SVZ衍生的初级神经球的克隆效率都显著降低(第页<0.005，与盐水处理的对照小鼠相比）(图2A类). 这种差异在MPTP后14和21天达到峰值，MPTP处理小鼠的神经球克隆效率比对照神经球低三倍(图2A类). 克隆效率的下降在同一时间点的次级神经球中得到了进一步证实(图2A类；第页<0.005，与经盐处理的对照小鼠相比），从而进一步证实了我们的观点体内观察到，在MPTP后的某些时间点，SVZ鼻咽癌室发生明显损伤。有趣的是，与对照小鼠的神经球相比，MPTP处理小鼠的神经小球（初级和次级）在任何时间点都没有显示出大小差异(图2B类)因此，表明来自MPTP处理小鼠的SVZ干细胞在其有丝分裂能力方面与来自对照组的细胞没有内在差异。最后，我们试图研究MPTP小鼠的NPC在化学定义的无血清培养条件下的增殖能力在体外。根据克隆分析，24小时至14天之间，MPTP处理小鼠的神经球确实再次显示出其生长速度的早期明显受损，但12天后完全恢复在体外在存在FGF-II和EGF的情况下，从而进一步证实没有细胞自主过程可以解释所观察到的增殖障碍体内(图2C类).

从两个体内和体外研究结果表明，MPTP诱导的神经原性电位损伤可能与环境因素有关，而不是与NPC子代的固有特性有关。此外，MPTP损伤后SVZ的特征性双相反应伴随着黑质DA能神经元的早期退化和晚期恢复，因此为研究神经炎症对SVZ可塑性的影响奠定了时间窗口。

MPTP诱导纹状体和SVZ炎症信号的上调和下调与NPC增殖的丢失和恢复呈负相关

MPTP-处理小鼠Str中已建立的强大和局部小胶质细胞反应（参见L'Episcopo等人，2011年a)其次与SVZ中的NPC增殖相关。为此，我们根据Kreutzberg（1999）对小胶质细胞激活的阶段进行了分类，并计算了第4阶段IBA1+小胶质细胞，表现为无突起的圆形细胞体，与静止的1期小胶质细胞相反，具有细长的胞体和细/分支突起(L'Episcopo等人，2011年c). 如中所述图3,A类和B类，第4阶段IBA1之间的负相关+小胶质细胞和PCNA+SVZ中的细胞最早在1 dpt后开始(图3B类)当活化阿米巴样IBA-1急剧增加时+Str和SVZ均检测到小胶质细胞(图3A类,B类)与注射盐的小鼠相比，注射盐的鼠只有静止的1期IBA1+可见小胶质细胞，胞体细长，突起分枝(图3A类). 这里又有许多PCNA+/IBA1级+MPTP小鼠Str早期（24小时内）发现细胞(图3A类)表明它们可能向邻近的SVZ迁移。小胶质细胞活化与SVZ增殖的相关性表明PCNA的最大减少+SVZ细胞与反应性IBA1峰值相关+细胞，而PCNA的拯救+细胞与反应性IBA1一致+细胞减少(图3B类). 此时，IBA-1+在实验的剩余时间里，在SVZ和Str中都观察到了具有更薄和更长突起的小胶质细胞(图3A类). Mac-1的早期急剧增加也表明了与鼻咽癌损害相关的小胶质细胞的过度激活(图3C类)和吞噬细胞氧化酶（PHOX）(图3D类)并通过增加IBA1+在Str和SVZ中表达iNOS的细胞(图3E类,F类). 此处观察到的严重纹状体前氧化/前炎症状态与我们之前的发现一致，该发现揭示了主要氧化/炎症mRNA物种（包括PHOX、NOs2、NOs3、Hmox1和UCP2）在MPTP后3–24小时达到峰值的上调(L'Episcopo等人，2010年b,2011年a). 相反，PCNA+小区恢复到MPTP前的水平(图3B类)在Str中氧化和炎症介质下调之前(图3C类,D类,F类). 当PHOX和iNOS衍生NO同时激活时，小胶质细胞可能会产生过氧亚硝酸盐（ONOO−)，一种强大的毒素，可能会促进各种蛋白质的硝化，并产生可能损害线粒体功能的羟基自由基(Gao等人，2003年,2008；Mander和Brown，2005年；高和洪，2008；胡等，2008). 鉴于星形胶质细胞在脑内稳态中的重要作用，特别是作为活性氧、过氧亚硝酸盐和谷氨酸清除剂(Magistretti，2006年；Moncada和Bolanos，2006年；Chen等人，2009年；Sandhu等人，2009年)然后，我们用GFAP和3-NT进行双重染色，作为iNOS衍生NO和过氧亚硝酸盐生成的指纹。因此，注射MPTP后不久，纹状体星形胶质细胞和SVZ中的3-NT免疫荧光（IF）信号急剧增加，但没有注射生理盐水(图3E类). Western blot分析支持3-NT免疫荧光的增加(图3G公司)，达到峰值3dpt，下降21dpt，表明NPC神经源性损伤早期窗口内星形胶质细胞亚硝化。因为以前的研究表明MPTP诱导SVZ细胞凋亡(He等人，2006年；Shibui等人，2009年)考虑到过氧亚硝酸盐生成增加的细胞毒性作用，我们接下来定位了死亡标记裂解Caspase3。纹状体SVZ中神经元细胞标记物NeuN（绿色）和Caspase3（红色）的双重定位清楚地记录了Caspase3-IF信号的增加，特别定位于SVZ，而非MPTP小鼠的Str(图3E类)在小胶质细胞激活高峰期间，7dpt后消失（数据未显示），因此表明一定比例的SVZ细胞可能会受到MPTP攻击的急性损伤。

总之，这些数据表明MPTP诱导的NPC损伤，体内和体外在Str和SVZ中，之前和伴随着小胶质细胞炎症介质和星形胶质细胞硝化的增加，而纹状体氧化和炎症状态的下调在神经源性损伤恢复之前，因此提出了神经毒素MPTP、活化星形胶质细胞、，和小胶质细胞。

MPP公司+以剂量依赖的方式直接损害鼻咽癌的生存、增殖和/或分化

先前的研究提出MPTP诱导SVZ中成神经细胞凋亡可能具有多巴胺依赖性效应，但目前尚不清楚该过程中的细胞贡献者和信号通路。一般认为，神经毒素MPTP转化为其活性代谢物MPP+在星形胶质细胞中，通过D能转运蛋白DAT选择性地转运到纹状体D能终末，在那里它诱导氧化应激、线粒体通透性转换孔的开放、细胞色素的释放c（c）和半胱天冬酶的激活(杰克逊·莱维斯和普雷德博斯基，2007年). 与这些早期事件协同作用，约占DA能神经元死亡的10%(Wu等人，2002年)胶质细胞炎症机制被认为与黑质纹状体D能变性有关(Hirsch和Hunot，2009年). 因此，我们考虑研究MPP可能的直接毒性作用+通过模拟胶质细胞与鼻咽癌的相互作用，探讨了胶质细胞介导的机制的作用在体外为此，我们使用了来自成人SVZ的表达GFP的NPC(Pluchino等人，2008年；L'Episcopo等人，2011年a)暴露于不断增加的剂量（5–25μ米)MPP的+如前所述，在不同共培养模式中是否存在胶质细胞，并评估NPC增殖(图4A类)和差异化(图4B类). MPP的剂量+是根据我们的在体外原代中脑DA能神经元的培养研究(L'Episcopo等人，2011年a,b条). 此外，我们测定了Caspase3活性，这是MPTP/MPP的一个标记+-使用荧光底物DEVD-AFC诱导细胞死亡(图4C类). NPC单型细胞和胶质细胞与NPC共培养细胞均接受了增加的剂量（5–25μ米)MPP的+(L'Episcopo等人，2001b). 对于增殖研究，MPP+在2 DIV，核苷酸类似物BrdU（5μ米)然后添加，24小时后固定细胞，即在3 DIV。对于分化研究，NPC单独生长，或在星形胶质细胞、小胶质细胞或星形胶质细胞-小胶质细胞混合制剂的顶部分层生长，在分化培养基（N2培养基和1%FCS）中移动，并允许细胞分化5–10 DIV。MPP+然后涂抹，24小时后固定细胞，使用Tuj1和MAP2a作为特定的神经元标记物。对于细胞存活实验，在MPP后8 h测定Caspase3活性+.

正如观察到的，GFP+多晶NPC-d日-在N2培养基中，只有赖氨酸在1%的血清中表达TUJ-1和一些GFP+3次DIV后NPC共存BrdU(图4A类,D类). MPP的影响+剂量依赖性：最低（≤5μ米)剂量没有显著改变GFP的数量+DAPI染色细胞核上的NPC，而GFP几乎减少30-60%+在10和25μ米MPP剂量+与PBS治疗的对照组相比。GFP百分比显示的增殖潜能+表达BrdU的NPC(图4A类,D类)和神经元分化，由Tuj1的百分比决定+6 DIV时(图4D类)和MAP2+10 DIV时的神经元(图4B类)超过GFP+MPP使NPC呈剂量依赖性减少+与PBS治疗的对照组相比。最后，类似DEVD的荧光信号(图4C类)在施用10和25μ米MPP公司+，但不是5μ米表明Caspase3在高MPP下激活+剂量。虽然不同的因素在MPTP/MPP中起作用+-诱导性神经源性损伤体内包括复杂的细胞贡献和不同的时间进程，目前的结果表明PD神经毒素能够直接损害成年SVZ神经原细胞的存活、增殖和分化在体外，呈剂量依赖性。

星形胶质细胞和小胶质细胞差异调节MPP+-NPC的诱发损伤，在体外

因为星形胶质细胞和小胶质细胞被认为对MPTP/MPP有重要影响+DA能神经元后的毒性体内和在体外(Gao等人，2003年；胡等，2008；Chen等人，2009年；Sandhu等人，2009年；L'Episcopo等人，2011年a,b条)，我们接下来研究了MPP后胶质细胞的可能调节作用+-诱发NPC毒性。为此，我们研究了星形胶质细胞（>95%GFAP）的作用+星形胶质细胞）、小胶质细胞（>95%IBA1+小胶质细胞），或混合胶质细胞（≥65 GFAP-IR星形胶质细胞；≤24%IBA1-IR小胶质细胞(图4E类)在没有或存在MPP的情况下与NPC共培养的细胞制剂+(图4F类)，如上所述。在基础条件下，NPC与纯化的星形胶质细胞直接共培养对两者的增殖都有强大的影响(图4A类)在6或10 DIV时形成神经母细胞(图4F类)BrdU的比例几乎增加了三倍+(图4A类)，图1+(图4F类)和MAP2+(图4B类,F类)GFP之外+与单独培养的NPC相比。与纯化的小胶质细胞共培养使MAP2的比例几乎增加了一倍+(图4B类,F类)GFP之外+细胞和增加BrdU的比例+(图4A类)GFP中的细胞+与单独培养的鼻咽癌相比，细胞减少了近50%。这些发现与以前的研究一致，显示了星形胶质细胞和小胶质细胞单层的能力(Lim和Alvarez Builla，1999年；Barkho等人，2006年；Butovsky等人，2006年；L'Episcopo等人，2011年a)促进成年NPC的神经发生。有趣的是，NPC-Astro cocultures对MPP的曝光+有效防止MPP+-诱导Tuj1减少+(图4F类)和MAP2a+(图4B类,F类)神经元产生和BrdU表达(图4A类)，模拟星形胶质细胞诱导的中脑DA能神经元保护(L'Episcopo等人，2011年a,b条)尽管星形胶质细胞的作用随着MPP浓度的增加而降低+与此形成鲜明对比的是，在NPC-微共培养中，MPP+抑制作用没有逆转(图4A类,B类,F类). 因此，Tuj的百分比下降+和MAP2a+6和10 DIV下观察到的细胞(图4B类,F类)以及GFP的百分比+用BrdU标记的细胞(图4A类)MPP之后+在没有或存在小胶质细胞的情况下，两者具有可比性。这些发现表明，在MPP存在的情况下+，抑制小胶质细胞的神经发生增殖作用。为了验证共培养是否影响NPC的存活，我们使用间接共培养范式测量了Caspase3的活性。在这个模型中，在NPC顶部添加含有星形胶质细胞或小胶质细胞单层的插入物。因此，星形胶质细胞的插入有效地逆转了MPP+-在10和25μ米，小胶质细胞植入物不能为鼻咽癌提供保护。相反，DEVD类中频信号的增加更大(图4C类)在所有MPP的NPC-小胶质细胞共培养中观察到+剂量。MPP后反应性星形胶质细胞对小胶质细胞的积极作用+在混合星形胶质细胞-小胶质细胞培养物（NPC-glia）中也观察到暴露，其中星形胶质细胞与小胶质细胞比率的增加导致MPP的显著逆转+-导致NPC存活率降低(图4C类)，扩散(图4A类)、和差异化(图4B类,F类).

这些发现表明，尽管星形胶质细胞在缺乏或存在MPP的情况下都具有保护和神经生成能力+在基础条件下，小胶质细胞可以增加NPC的神经生成潜能，而在MPP存在的情况下+它们进一步损害了NPC的生存，提出了小胶质细胞和星形胶质细胞观察到的效应中涉及的特定因素和信号通路的问题。

MPTP诱导的小胶质细胞氧化和亚硝化状态增加损害NPC增殖和分化在体外

探讨小胶质细胞在MPTP诱导的SVZ损伤中的作用体内为了研究所涉及的小胶质细胞衍生因子的性质，我们试图使用急性分离的巨噬细胞/小胶质细胞体外来自盐水或MPTP。我们选择3 dpt，因为它对应于小胶质细胞反应的峰值，体内(图3)，并将这些细胞制剂用于PHOX、ROS和iNOS衍生RNS的测定以及与GFP的共培养实验+单元格，如所述。

在从MPTP小鼠分离的巨噬细胞/小胶质细胞中，PHOX表达比从盐处理小鼠分离的小胶质细胞增加约3.5倍(图5A类). 同样，与之前的研究一致(Morale等人，2004年；胡等，2008；L'Episcopo等人，2010a；b条)从MPTP小鼠分离的巨噬细胞/小胶质细胞中，ROS和iNOS衍生RNS的生成显著增加，而在盐处理小鼠中，可以检测到极低到检测不到的ROS和RNS水平(图5B–D类)，支持体内数据(图3). 接下来通过将NPC暴露于任一小胶质细胞来研究这些介质的直接影响(图5E类)或混合插入物(图5F类)来自盐水或MPTP小鼠。将在类似条件下培养的非小胶质插入物（ct-insert）作为对照。24小时后，我们发现GFP几乎下降了三倍+MPTP–小胶质细胞–NPC中BrdU的细胞掺入，与盐水注射对照组的小胶质细胞相反(图5E类,F类). 同样，MAP2a的数量+与直接或间接暴露于盐水-小胶质细胞中的神经元数量相比，细胞数量急剧减少(图5E–H（E–H）)或ct插入物（数据未显示），支持小胶质细胞衍生介质在观察到的抑制作用中的特异性。

与MPTP小胶质细胞共培养的NPC中检测到的DEVD样荧光信号急剧增加，进一步证明MPTP小神经胶质细胞具有抑制作用(图5我)，但不是ct-insert（数据未显示），表明激活Caspase3诱导的细胞死亡。因此，在MPTP诱导的小胶质细胞过度激活的情况下体内有害的氧化和炎症微环境可能会增加鼻咽癌的易损性，损害鼻咽癌生存，进而损害神经原性潜力。事实上，反应性小胶质细胞释放的超氧物和NO等自由基是导致DAergy神经元后MPTP毒性增强的主要因素体内和在体外(Gao等人，2003年,2008；Mander和Brown，2005年；胡等，2008；L'Episcopo等人，2010a,b条,c（c）).

A类PHOX–RNS–GSK–3β/β-连环蛋白-调节信号级联参与小胶质细胞诱导的NPC神经发生电位抑制

考虑到NO在成人SVZ神经发生中的抑制作用(Packer等人，2003年；Matarredona等人，2004年,2005；Moreno-López等人，2004年；Torroglosa等人，2007年)因此，我们在直接和间接GFP中，通过使用PHOX抑制剂apocynin和iNOS衍生NO L-Nil的特异性抑制剂，研究了药物调控小胶质细胞氧化和亚硝化状态的作用+分离小胶质细胞建立共培养体外来自生理盐水或MPTP处理的小鼠，或使用如上所述的ct-insert。如观察到的，MPTP–小胶质细胞暴露于Apo或L-Nil后，分别显著降低了PHOX衍生的ROS和iNOS衍生的RNS的生成(图5B–D类). 因此，与暴露于PBS的共培养物相比，暴露于Apo或L-Nil的MPTP-小胶质细胞-NPC共培养物显著减轻了MPTP-微胶质细胞诱导的GFP增殖和分化的降低+细胞达到生理盐水-小胶质细胞-鼻咽癌共培养中测量的水平(图5E类,F类,H（H）). 另一方面，治疗后的ct-insert在NPC中的BrdU或Map2a表达没有变化（数据未显示）。有趣的是，小胶质细胞与鼻咽癌共培养的L-Nil治疗的特点是MAP2a增加+工艺长度(图5H（H）). 此外，我们观察到MPTP–小胶质细胞诱导的Caspase3活性的显著抵消(图5我)Apo或L-Nil治疗后，与治疗的ct-insert共培养后无效果，因此支持PHOX-衍生的ROS和iNOS-衍生的RNS作为NPC神经源性损伤的关键小胶质细胞有害介质。

接下来，我们探讨了小胶质细胞有害表型与鼻咽癌生化机制中的信号级联相互作用之间的机制联系。最近对成人神经干细胞增殖、前体细胞迁移和神经元分化的研究表明，神经干细胞在神经干细胞分化中起着重要作用Wnt（重量）/β-连环蛋白信号系统(Lie等人，2005年；Adachi等人，2007年；Zhang等人，2011年). Frizzled受体下游有三种不同的Wnt途径：Wnt（重量）/β-连环蛋白途径（称为经典途径）和非经典途径Wnt/Ca+2和Wnt/平面电池极性(洛根和努斯，2004年；戈登和努斯，2006年). The hallmark of theWnt（重量）/β-连环蛋白途径是细胞溶质β的稳定-连环蛋白GSK-3β是破坏复合物的一部分，该复合物以β-连环蛋白为靶点，通过蛋白酶体进行泛素化和降解，而Wnt（重量）信号传导抑制GSK-3β活性，从而增加β-连环蛋白，进入细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子结合因子（TCF/LEF）转录因子结合，导致Wnt（重量）参与细胞存活、增殖和分化的靶基因(洛根和努斯，2004年). 因此，我们研究了小胶质细胞衍生介质对β-连环蛋白和GSK-3β。Western blot分析表明，与生理盐水-小胶质细胞或ct-insert相比，暴露于MPTP-小胶质的NPC中β-catenin蛋白显著下调(图5J型). 相反，在添加含有MPTP–小胶质细胞的插入物4小时后，观察到磷酸化Tyr216 GSK-3β（即活性pGSK-3？）的上调(图5K（K）). 时间进程实验表明，活性pTyr216 GSK-3β的上调与NPC中β-catenin蛋白的暂时性丢失呈负相关（数据未显示），这意味着GSK-3α的激活以及随后MPTP小胶质细胞诱导的NPC增殖和神经元分化抑制中β-catanin的降解。接下来研究了小胶质细胞衍生的ROS和RNS在pTyr216 GSK-3β上调和抑制神经发生中的意义。在Apo-和L-Nil处理的培养物中，观察到活性GSK-3β的显著抵消作用(图5K（K）). 因此，使用ROS或iNOS抑制剂治疗可有效逆转β-catenin的深度下调(图5J型). 总之，这些结果表明，氧化和炎症状态加剧可能会拮抗NPC中的β-catenin信号传导，并提出了ROS–RNS/GSK–3β/β-连环蛋白信号级联有助于小胶质细胞诱导的NPC神经原性电位抑制。

MPTP诱导的Wnt（重量）/β-catenin信号体外和在体外

Wnt（重量）基因编码分泌性糖蛋白，并通过自分泌或旁分泌机制传递信号，调节各种发育和出生后过程，包括神经干增殖和分化(Kalani等人，2008年；Kuwabara等人，2009年；Munji等人，2011年). 在成年啮齿动物中，Wnt配体（Wnt1、Wnt5a、Wnt7a）和Frizzled受体在SVZ中表达(Shimogori等人，2004年). 特别感兴趣的是，使用Axin2-d2EGFP记者(Jho等人，2002年)，被认为是标准的准确报告鼠Wnt（重量）活动体内,Adachi等人（2007年）证明了Wnt（重量）/β-连环蛋白该信号在成人SVZ的B型和C型细胞中被激活。此外，通过注射逆转录病毒载体来激活或抑制β-连环蛋白这些作者还记录了成年小鼠SVZ分裂细胞的特异性信号转导Wnt（重量）/β-连环蛋白信号传导足以增加SVZ中产生新神经元的分裂C细胞的百分比。重要的是，β-连环蛋白纹状体内输注TGF-α后6-OHDA-致敏大鼠PD模型SVZ增加，提示其与Wnt（重量）SVZ增殖调节中的信号(库珀和伊萨森，2004年). 结合我们之前记录的MPTP调制Wnt（重量）/β-连环蛋白Str和中脑中的信号成分(L'Episcopo等人，2010a)这些数据促使我们验证了功能失调的假设Wnt（重量）/β-连环蛋白信号传导是MPTP-依赖性SVZ损伤的促发因素。我们首先讨论了与β-连环蛋白急性分离的NPC中GSK-3β的活性表达体外来自MPTP处理的小鼠。在7dpt时从幼稚和MPTP小鼠分离出的NPC被扩增，并按照描述测量增殖/分化。在3 DIV时，从MPTP小鼠分离出的NPC结合BrdU的能力比来自盐水小鼠的NPC降低了三倍(图6A类,B类). 为了评估来自盐水和MPTP小鼠的NPC的神经元分化潜能，细胞在分化培养基中成熟7 DIV，然后用Map2a染色。因此，来自MPTP小鼠的NPC，体外，生产Map2a+神经元(图6A类,B类)尽管与Map2a相比，效率降低了近50-60%+来自盐水小鼠的NPC。此外，Map2a+与盐水NPC相比，MPTP中的过程长度急剧缩短(图6A类).

接下来我们看了Wnt（重量）使用Western blot分析信号成分，发现β-连环蛋白MPTP小鼠NPC中的信号与生理盐水小鼠NPC的β-catenin信号相比，而活性GSK-3β信号急剧增加(图6C类). 根据这些发现，使用特异性引物和定量实时PCR，我们发现轴2，直接Wnt（重量）目标诱导因素Wnt（重量）/β-连环蛋白激活(Jho等人，2002年)，在来自MPTP小鼠的NPC中与轴2在盐水注射对照组的NPC中测得的表达水平（对照组为2.68±0.31个任意单位，MPTP为1.15±0.20；第页<0.05），从而证实MPTP诱导的Wnt（重量）/β-连环蛋白SVZ细胞中的信号传导活性。鉴于最近的报告显示β-连环蛋白阿尔茨海默病（AD）和AD转基因小鼠脑胶质前体细胞的信号转导(何和申，2009). 因此，我们利用了siRNA策略(何和申，2009；L'Episcopo等人，2011年b)进一步研究β-catenin信号通路在MPTP诱导的神经源性损伤中的关系，并测试β-连环蛋白和葛兰素史克-β. 为此，将GSK-βsiRNA瞬时转染MPTP小鼠的NPC(图6D类); 或者，将β-连环蛋白小干扰RNA(图6E类)，据报道(何和申，2009；L’Episcopo等人，2011年b). 转染48–72小时后，Western blot分析表明葛兰素史克-β-siRNA降低MPTP小鼠NPC中GSK-β水平并增加β-catenin水平(图6D类)，而β治疗-连环蛋白siRNA在不改变GSK-3β的情况下降低盐水小鼠NPC中β-catenin蛋白水平(图6E类). 当在MPTP小鼠的NPC中引入siRNA后加入BrdU，并在24小时后固定细胞时，我们发现葛兰素史克-与siRNA对照细胞相比，β导致表达BrdU的细胞百分比显著增加(图6B类). 同样，在分化培养基中生长并转染GSK-βsiRNA的MPTP小鼠的NPC中，MAP2a的百分比增加+单元格(图6A类,B类)与用对照siRNA预处理的NPC中测得的水平进行比较（数据未显示）。反过来，β-连环蛋白在盐水小鼠的NPC中引入siRNA显著降低了BrdU的百分比+和MAP2a+单元格(图6B类)与用对照siRNA处理的NPC相比（数据未显示）。这些结果表明，β-连环蛋白面对上调的GSK-3β可能有助于MPTP诱导的SVZ损伤体外; 相反，通过上调β来沉默GSK-3β-连环蛋白能逆转MPTP小鼠神经发生的下降。

这些结果提高了MPTP/MPP的可能性+可能使用相同的信号通路对SVZ细胞发挥直接作用。基于GSK-3β活性上调在氧化应激诱导的神经细胞死亡机制中的新证据(Bhat等人，2000年；格里姆斯和乔普，2001年；King等人，2001年; Kaytor和Orr，2002），尤其是DAergic神经元死亡(G.Chen等人，2004年；奈尔和奥拉诺，2008年；Duka等人，2009年；Petit-Paitel等人，2009年；L'Episcopo等人，2011年a,b条)，我们接下来验证了NPC直接接触MPP的影响+ 在体外发现与对照组相比，β-catenin信号减少与GSK-3β活性信号增加相关(图6C类). 接下来我们测试了外源激活Wnt（重量）/β-连环蛋白使用选择性GSK-3β拮抗剂AR-AO14418（AR，5n米；Osakada等人，2007年；L'Episcopo等人，2011年a,b条)或Wnt配体Wnt1（100 ng/ml），在MPTP的两个NPC中体外和MPP+ 在体外(图6B类,C类). 在在体外实验范式，AR或重量1在MPP前1小时施用+暴露，MPP后24小时固定细胞+根据观察，AR和重量1有效降低MPTP小鼠和急性暴露于MPP的NPC中活性GSK-3β信号并逆转降低的β-catenin信号+(图6C类). 这些影响与MPP的显著逆转有关+-诱导BrdU百分比下降+-和地图2a+-表达细胞(图6B类). 在盐水小鼠和PBS治疗的NPC中，重量1Map2a急剧增加+工艺长度(图6A类). 时间进程研究重量1对GFP的影响+NPC显示β-连环蛋白GFP细胞质和细胞核的免疫荧光+6小时内重量1应用，并在24–48小时前，重量1-诱导的β-连环蛋白免疫荧光急剧上调并分布在GFP中+细胞膜、细胞质，尤其是生长中的GFP+过程(图6F类)与低分化PBS处理的GFP相比+β-catenin免疫荧光出现在细胞膜上的细胞(图6F类).

总之，这些体外和在体外结果明确确立了MPTP/MPP+-诱导SVZ NPC中Wnt/β-catenin信号活性的抑制。

Astrocyte衍生因子和Wnt（重量）/β-连环蛋白信号激活对抗MPTP诱导的NPC损伤

目前已确定的大多数神经源性因子，包括Wnts，与神经源性小生境中特定的局部星形胶质细胞群体相关，这意味着它们在指导小生境中NPC的神经发生方面具有特殊作用(Alvarez Builla等人，2001年；Castelo-Branco等人，2004年,2006；Lie等人，2005年；Cahoy等人，2008年；哈萨克斯坦，2009年；Kuwabara等人，2009年；Munji等人，2011年). 考虑到星形胶质细胞（1）保护NPC免受MPP的影响+暴露并有效逆转增殖和神经元分化下降(图4A–C)和（2）明示Wnt（重量）/β-连环蛋白信号成分与促进神经发生体内和在体外(Lie等人，2005年；Castelo Branco等人，2006年；Cahoy等人，2008年；L'Episcopo等人，2011年a,b条)因此，我们决定共同培养纹状体星形胶质细胞是否可以通过β-catenin介导的Wnt信号激活来克服MPTP小鼠受损的NPC神经生成能力。因此，当星形胶质细胞被层叠在MPTP小鼠（第0天）的NPC上时，接下来添加BrdU（即2 DIV），并且细胞在24小时后固定（即3 DIV）时，观察到表达BrdU的细胞显著增加(图7A类,B类). 如上所述，当细胞在分化培养基中成熟7 DIV时，Map2a的百分比+与单独培养的NPC相比，神经元显著增加（与图6A类,B类具有图7A类,B类)尽管向盐水小鼠的NPC中添加星形胶质细胞单层更有效地增加了Map2a+神经元分化(图7A类,B类). 这些结果支持了我们之前的发现，即中脑星形胶质细胞共培养能够促进从成人中脑和SVZ分离的神经原细胞的神经发生(L’Episcopo等人，2011年a). 此外，他们进一步证实了我们目前的数据，即从MPTP小鼠中分离出的NPC体外本质上没有受损。星形胶质细胞在MPTP诱导的NPC中促进神经发生的能力可能是各种生长/神经发生因子促进神经发生作用的结果。虽然这些未知分子可能直接或间接地和/或通过旁分泌/自分泌机制发挥作用，但我们使用不同的方法来解决β-catenin信号调节的参与(L'Episcopo等人，2011年a,b条). 激活的第一步Wnt（重量）/β-连环蛋白信号通路是Wnt（重量）蛋白、受体蛋白Fz和辅受体低密度LRP5/6。因此，我们测试了Wnt（重量）/β-连环蛋白使用可溶性抑制剂Dkk1的拮抗作用，该抑制剂可防止Fz/Wnt/LRP5/6复合物对Wnts的反应形成(Semönov等人，2001年). 先前的研究表明，这种治疗可以抵消激活的中脑星形胶质细胞的神经生成促进作用(L'Episcopo等人，2011年a). 然后我们发现100 ng/ml剂量的Dkk-1显著降低了星形胶质细胞诱导的Map2a升高+神经元以及BrdU的百分比+单元格(图7A类,B类)在来自生理盐水和MPTP小鼠的NPC中，表明旁分泌和/或自分泌机制对Wnt配体的星形胶质细胞激活可能有助于观察到的神经原效应。蛋白质印迹分析也表明了Wnt信号传导的含义，表明-连环蛋白NPC-Astro共培养中蛋白质水平没有显著降低，而预防性应用特异性Wnt/β-catenin拮抗剂Dkk1可有效逆转astrocyte诱导的β-catentin蛋白升高(图7C类)从而表明Wnts是候选激活剂。为了支持这一发现，在生理盐水组和MPTP组中，活性GSK-3β信号在NPC-Astro的Dkk1治疗反应中上调(图7C类). β-catenin-介导的Wnt信号在星形胶质细胞-鼻咽癌共培养中的潜在作用也通过消耗β-连环蛋白通过引入β-连环蛋白如前所述，鼻咽癌培养物中的siRNA导致β-catenin急剧耗竭，而GSK-3β活性表达增加(图6E类). Inβ-连环蛋白-耗尽NPC，星形胶质细胞插入未能增加NPC增殖和神经元分化(图7A类,B类)除了其他因素，β-连环蛋白-介导的Wnt信号可能有助于星形胶质细胞的神经原性效应。

总之，目前的研究结果表明β-连环蛋白激活的信号传导是MPP的一个聚合点+-、小胶质细胞和星形胶质细胞衍生因子，并促使我们开始阐明Wnt（重量）/β-连环蛋白信号体内.

药物激活Wnt（重量）/β-连环蛋白信号体内逆转MPTP或Dkk1诱导的增殖受损

我们首先使用免疫组织化学方法定位生理盐水和MPTP处理小鼠SVZ中的β-catenin。根据研究Adachi等人（2007年）在对照小鼠的SVZ中，在DAPI反染细胞核的膜、细胞质或核周区域检测到β-catenin-IF信号(图8A类). β-catenin和BrdU的双重定位显示+细胞共表达BrdU(图8A类). 相反，MPTP治疗显著下调β-catenin-IF信号和β-catentin的比例+共表达BrdU的细胞(图8A类). 由于β-catenin在C型细胞中表达，并且由于MPTP降低了C细胞的增殖，如果Wnt（重量）/β-连环蛋白该通路与MPTP诱导的SVZ神经源性损伤有关，然后激活β-连环蛋白信号应该抵消MPTP诱导的NPC损伤。因此，我们使用了对GSK-3β的药理学抑制，导致β-连环蛋白信号的激活，以验证该途径在SVZ细胞中的功能重要性。为了验证这个假设，我们选择了GSK-3β拮抗剂AR，使用在体外据报道，通过侧脑室灌注进行全身注射或局部SVZ给药(Adachi等人，2007年). 进行了初步实验，以验证剂量和时间能够降低完整和MPTP小鼠SVZ中活性GSK-3β。为了测试全身效应，以剂量方案（10 mg/kg，每天两次）腹腔注射AR(L'Episcopo等人，2011年a,b条)，在MPTP后3小时开始，持续3天。对于侧脑室内输注，将AR或载体单独输注到大脑的左侧脑室中。各组注射了盐的小鼠通过腹腔注射或脑室注射AR作为对照。与之前的调查结果一致(Adachi等人，2007年)AR侧脑室内输注直接拮抗GSK-3β导致β-连环蛋白输注同侧SVZ的表达和细胞增殖(图8B类)，与对侧非融合SVZ相比(图8B类). 同样，对盐水小鼠进行全身AR治疗后，β-连环蛋白SVZ中的表达和细胞增殖(图8A类,C类). 当暴露于MPTP的小鼠在3小时后通过脑室内输注或全身注射接受AR时，这两种治疗都能显著抵消MPTP诱导的PCNA下降+MPTP后3d SVZ中的细胞和β-catenin表达(图8A–C)表明β-catenin信号的急性外源性激活在最大神经源性损伤的时间窗和小胶质细胞恶化的高峰期(图3F类)可以克服MPTP小鼠SVZ中观察到的神经发生障碍体内相反，Wnt（重量）/β-连环蛋白可溶性抑制剂的拮抗作用Dkk1公司，单侧脑室内注射（Zhang等人，2009），模拟MPTP全身注射(图8D类,E类)PCNA比例显著下降+和β-连环蛋白+同侧细胞与对侧非融合SVZ的比较(图8D类,E类). 重要的是，下游转录效应器β-连环蛋白，进行AR全身注射(图8D类,E类).

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激活Wnt（重量）/β-连环蛋白GSK-3β拮抗作用的信号传导体内对抗MPTP诱导的神经发生受损。药物激活的作用Wnt（重量）/β-连环蛋白从MPTP治疗后3小时开始，通过全身或SVZ给药研究使用特定GSK-3β抑制剂AR的信号传导。影响Wnt（重量）/β-连环蛋白在没有或存在AR全身给药的情况下，研究了Dkk1侧脑室内输注的信号拮抗作用（详细信息见正文）。MPTP后第3天处死小鼠，相应的神经源性损伤最大，小胶质细胞反应加剧。A类、纹状体SVZ冠状面β染色代表性图像-连环蛋白（红色）用核标记物DAPI（蓝色）复染，显示盐水和MPTP小鼠SVZ中β-catenin的表达。β-catenin和BrdU的双重定位显示+细胞共表达BrdU和某些β-catenin+细胞表现出核共定位。MPTP降低β-catenin-IF信号和β-catentin+细胞共存BrdU。B类,C类，代表性图像显示了单侧输注GSK-3β拮抗剂（AR）对同侧β-catenin表达（ipsi）的影响，与盐水注射小鼠的非融合对侧（对侧）相比(B类). β-连环蛋白（红色）和用PCNA（绿色）测量的细胞增殖在同侧AR融合的左SVZ中显著增加(B类,C类). 当暴露于MPTP的小鼠在3小时AR后通过侧脑室内输注或全身注射获得时，两种治疗都能显著抵消MPTP诱导的PCNA下降+MPTP后3d SVZ中的细胞和β-catenin表达(A–C). 仅用AR进行系统治疗也会增加SVZ的增殖(A类–C类).D类,E类,Dkk1公司，单侧脑室内注射，模拟MPTP全身注射，导致PCNA降低+和β-连环蛋白+同侧细胞与对侧非融合SVZ比较。伴随AR全身注射可有效抵消Dkk1的抑制作用*第页生理盐水组和治疗组的同侧和对侧之间分别<0.05**第页与不同组内的MPTP/-Dkk1相比，<0.05。脑室内；腹腔注射。

一起体外,在体外、和体内研究结果表明Wnt（重量）/β-连环蛋白SVZ中的信号传导与MPTP损伤的SVZ增殖减少相关。尽管进一步的时间依赖性深入分析将阐明这些影响Wnt（重量）/β-连环蛋白这些结果显示了β-连环蛋白-介导信号传导以抵消MPTP或Dkk1注入小鼠受损的神经原潜能。

Wnt（重量）/β-连环蛋白MPTP小鼠的信号中断可通过炎症的药理调节逆转：与神经保护的相关性

最后，为了支持成人NPC的可塑性，并测试通过抗炎药治疗调节这种内源性系统的潜力体内，我们使用了CINOD HCT1026，该药物具有安全性，并且先前证明可以通过减少PHOX和iNOS衍生RNS来减轻小胶质细胞的激活，并有效保护PD啮齿动物模型中的黑质纹状体D能神经元(L'Episcopo等人，2010a,b条,2011年c). 根据我们的在体外和体内结果，使用Western blot分析(图9A类,B类)和免疫组织化学(图9C类)，MPTP诱导β-连环蛋白SVZ中的蛋白质水平。具体来说，IBA1和β-catenin以及GFAP和β-catanin的双重标记(图9C类)支持β-catenin在小胶质细胞最大加重期（即3dpt）下调。另一方面，活性GSK-3β（pTyr216 GSK-3？）显著上调(图9B类). 相反，HCT1026虽然在盐处理小鼠中不活跃，但在MPTP后有效地将β-连环蛋白增加到对照组(图9A类)活性GSK-3β急剧下降(图9B类)与喂食控制饮食的MPTP小鼠进行比较。β-catenin和胶质标记物双重标记进一步显示HCT-MPTP小鼠SVZ中β-catentin-IF染色正常化，GFAP降低+和IBA1+电池数量和反应性(图9C类).

HCT1026的这些作用与BrdU数量的显著增加有关+-和DCX+-纹状体SVZ中的表达细胞(图9D类,E类,H（H）). 此外，在GFAP和DCX以及GFAP和BrdU的双重定位实验中(图9H（H）)、GFAP+邻近SVZ的星形胶质细胞将年轻的DCX加热+与用对照饮食喂养的小鼠相比，在HCT1026中MPTP处理后，神经母细胞表现出降低的反应表型，在3 dpt时表现出星形胶质细胞-NPC相互作用被破坏。与喂食对照饮食的MPTP小鼠相比，HCT1026小鼠的Str和SVZ中第4阶段小胶质细胞密度急剧下降(图9F–H（飞行高度）). 在中脑腹侧水平观察到(L'Episcopo等人，2010年b)这些形态学效应与HCT1026中的小胶质前氧化剂和炎症介质（如Mac1、PHOX和iNOS）的显著下调有关，而与喂食对照饮食的小鼠相反（数据未显示）。

就纹状体D能终点而言，与我们之前的研究一致(L'Episcopo等人，2010年b)在MPTP后14天，与HCT1026喂养的小鼠相比，MPTP显著降低了喂食对照饮食的小鼠纹状体突触体中的DAT-IF纤维密度和DA摄取，显示出显著程度的DA能再支配(图9I–K型)，符合中脑细胞体的显著保护（数据未显示），证实了我们之前的报告(L'Episcopo等人，2010年b).

讨论

帕金森病患者SVZ和帕金森病实验模型中的神经发生受损之前已有报道。支配SVZ中C型细胞的中脑D能细胞体中神经递质多巴胺的丢失与神经生成潜能的降低有因果关系（见引言）。此外，某些多巴胺激动剂治疗可以挽救PD中NPC的增殖(van Kampen等人，2004年；Winner等人，2009年). 目前的工作主要集中在胶质细胞，并表明除了多巴胺外，PD神经毒素MPTP/MPP+在PD小鼠模型中，直接和/或与星形胶质细胞和小胶质细胞衍生介质联合可能有助于调节SVZ的可塑性。因此，由于DA能神经支配和MPTP/MPP减少，SVZ生态位在退化早期的不利条件+-依赖性纹状体氧化和亚硝化状态，可能抑制内源性NPC的存活和/或扩张/分化和/或迁移，至少部分通过β-连环蛋白介导的破坏Wnt（重量）SVZ中的信号。随着时间的推移，向反应性较低的小胶质细胞“有害”表型的转变可能会缓解生态位微环境，恢复星形胶质细胞对生长因子和神经原信号（包括Wnts）的“有益”表达，以及进行性纹状体再神经支配，可能有助于NPC的恢复(图10). 与这些发现一致，β-连环蛋白小胶质细胞过度激活的信号或药物缓解上调了SVZ中的β-catenin，并成功挽救了NPC增殖和成神经细胞形成。显然需要进行额外的研究来破译Wnt（重量）/β-连环蛋白通过炎症依赖性SVZ调制直接或间接传递信号，对DA能神经保护/自我修复具有潜在意义(Wang等人，2007年；Maiese等人，2008年；托莱多等人，2008年；Chong等人，2010年；Inestrosa和Arenas，2010年；Kim等人，2010年；L'Episcopo等人，2010年b,2011年a,b条,c（c）；Shruster等人，2011年).

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炎症和Wnt公司/MPTP诱导的SVZ可塑性中的β-catenin信号通路。一个简化的方案总结了MPTP通过调节Wnt（重量）/β-连环蛋白显示了信令。在MPTP毒性的早期退化阶段，过度激活的小胶质细胞在不同程度上导致SVZ神经发生障碍。通过增加氧化和亚硝化应激，并与MPTP/MPP协同作用+直接毒性、小胶质细胞衍生介质（PHOX-derived ROS、iNOS-derived NO和过氧亚硝酸盐）可作为细胞信号通路的分子开关，这些信号通路与鼻咽癌体内平衡的生理控制密切相关，对星形胶质细胞和鼻咽癌生理产生有害影响，至少部分是通过GSK-3β激活，然后是β-catenin的磷酸化和随后的降解。相反，Apo、L-Nil或HCT1026对炎症和氧化应激的药理缓解作用上调β-连环蛋白并成功拯救NPC增殖和神经母细胞形成，这是一个与纹状体DA能神经保护相关的过程，通过D2受体（D2R）激活机制。星形胶质细胞-小胶质细胞相互作用在SVZ对MPTP反应的可塑性中的相互作用体现在星形胶质细胞克服小胶质细胞抑制作用的能力上，也通过与Wnt（重量）/β-连环蛋白发送信号。

神经炎性星形胶质细胞和小胶质细胞衍生信号在生态位微环境中协同作用，形成SVZ对MPTP的反应

以前和最近的研究表明，在神经原微环境中，胶质细胞产生的因子可能发挥重要作用，特别是在急性或慢性脑损伤后，根据损伤的严重程度，增殖和/或命运选择、迁移和成熟可能会受到不同的影响，受影响的地区和侮辱的类型(Ekdhal等人，2003年,2009；Monje等人，2003年；Butowski等人，2006年；Jakubs等人，2008年；Pluchino等人，2008年; Schwartz等人，2008年；Thored等人，2009年). 在MPTP诱导的小鼠模型中，该模型再现了帕金森病的许多致病过程(Jackson Lewis和Przedborski，2007年)已知胶质细胞炎症机制参与了黑质纹状体变性和自我修复(Morale等人，2004年,2006；Marchetti和Abbracchio，2005年；Marchetti等人，2005a,b条；L'Episcopo等人，2010a). 在这里，我们将SVZ受损与小胶质细胞PHOX和iNOS的早期显著上调联系起来，产生高毒性过氧亚硝酸盐指纹3-NT，可能导致NPC线粒体功能障碍，增加NPC细胞死亡的易感性，和/或使SVZ微环境不利于成神经细胞增殖和/或分化。特别是埃斯特拉达及其同事的研究(Estrada和Murillo Carretero，2005年；Torroglosa等人，2007年)已明确暗示NO是调节成人SVZ中干细胞命运的关键因素。微环境的关键作用也由体外对MPTP小鼠分离的NPC进行的分析表明，在SVZ损伤的时间窗期间，其生长速度受到明显的早期抑制。与脑炎症慢性模型的研究相似(Pluchino等人，2008年)，MPTP小鼠NPC的内在有丝分裂特性在12天后恢复在体外在FGF-II和EGF在场的情况下。根据这一概念，随着时间的推移，本文观察到促炎症和氧化介质的减少体内可能是NPC复苏的一个促成因素。

星形胶质细胞-小胶质细胞的串扰可以在MPTP/MPP上将平衡切换为抑制/恢复NPC神经发生+损伤

星形胶质细胞是脑内稳态的关键参与者(Magistretti，2006年；Allaman等人，2011年)在成人神经发生的背景下(Alvarez-Buylla等人，2001年；Song等人，2002年；焦和陈，2008). 此外，当小胶质细胞适度活跃时，有利于并支持成人NPC的增殖、存活和分化(Ekdahl等人，2009年). 重要的是，星形胶质细胞与神经元的相互作用在神经退行性变、神经保护和神经修复中的主要作用早已得到公认(Marchetti等人，2005a,b条；Magistretti，2006年；L'Episcopo等人，2010a；Allaman等人，2011年)，但MPTP/MPP的直接作用+在NPC中，胶质细胞的贡献作用以及所涉及的信号机制尚未得到解决。这里，通过检查在体外NPC对MPP的漏洞+，我们发现剂量≤5μ米不影响NPC生存，而剂量≥10μ米、MPP+以剂量依赖的方式诱导Caspase-3激活。此外，成人NPC增殖并分化为Map2a的能力+MPP剂量依赖性地减少神经元+表明PD神经毒素直接损害SVZ神经发生潜能的能力。反应性星形胶质细胞而非小胶质细胞有效地逆转了NPC损伤，这一事实与研究结果一致，表明炎症因子可能参与星形胶质细胞对成人神经发生的调节，而小胶质细胞被LPS或某些细胞因子激活会损害神经发生(Monje等人，2003年；Ekdhal等人，2003年,2009；Barkho等人，2006年；Butowski等人，2006年；Pluchino等人，2008年). 事实上，星形胶质细胞与小胶质细胞比率的增加显著逆转了MPP+-诱导的鼻咽癌损伤也表明，除了小胶质细胞的激活程度外，星形胶质细胞-小胶质细胞间的串扰也可能在MPTP调节鼻咽癌神经原性电位中发挥关键作用。

炎症和Wnt/β-catenin信号在MPTP/MPP中的串扰+-诱导性神经源性损伤：β-catenin是一种常见的终末途径

影响脑部疾病成人神经发生的大多数机制尚不清楚。氧化应激，尤其是亚硝化应激，被认为会影响与衰老和年龄相关疾病（尤其是PD）的发展相关的基本细胞过程。Wnt（重量）/β-连环蛋白信号传导是调节神经干细胞自我更新和分化的重要途径，β-连环蛋白代表一个主要的转录调节器(洛根和努斯，2004年). 因此，稳定β-连环蛋白可进入细胞核并与T细胞因子/淋巴增强因子结合因子（TCF/LEF）转录因子结合，导致Wnt（重量）参与细胞生存、增殖和分化的靶基因。新出现的证据(Lie等人，2005年；Adachi等人，2007年；Wexler等人，2008年；Kuwabara等人，2009年；Munji等人，2011年；Zhang等人，2011年)表明该途径在成人神经发生中的作用。因为激活了GSK-3型β导致β-连环蛋白耗尽(Aberle等人，1997年)GSK-3β/β-catenin断裂可能是MPTP-小胶质细胞诱导的NPC损伤的潜在候选介质。小胶质细胞ROS和RNS的药理学抑制导致与β-catenin上调相关的NPC损伤逆转，再加上GSK3β活性正常化，这一事实也表明炎症与RNS之间存在相互作用Wnt（重量）/β-连环蛋白信号组件。观察到的活性物质上调第3页GSK-3β面对β-连环蛋白和轴2MPTP小鼠SVZ的下调进一步表明Wnt（重量）/β-连环蛋白信号传导。因为Wnt（重量）/β-连环蛋白信号控制多种靶基因的表达，这种信号级联的失调涉及各种疾病，尤其是与神经发生受损相关的神经退行性疾病，如AD和PD(托莱多等人，2008年；何和申，2009；Inestrosa和Arenas，2010年；Kim等人，2010年；L'Episcopo等人，2011年a,b条；Shruster等人，2011年). 始终，MPTP/MPP中涉及的信号机制+-诱导的神经元和NPC损伤似乎针对Wnt（重量）/β-连环蛋白信号通路(Duka等人，2009年；Petit-Paitel等人，2009年；L'Episcopo等人，2011年a,b条). 因此，外源性激活Wnt（重量）/β-连环蛋白通过发送信号GSK-3型β抑制/沉默，重量1暴露或星形胶质细胞共培养覆盖了MPTP诱导的神经发生受损。同样Wnt（重量）/β-连环蛋白初级中脑神经元的信号传导对氧化应激、6-OHDA和MPP具有强大的神经保护作用+-诱导D能细胞死亡在体外和体内(L'Episcopo等人，2011年a,b条)，显然还需要更多的研究来解决Wnt（重量）/β-连环蛋白与炎症加重、神经退行性变和神经发生受损（如PD）相关的条件下的信号传导中断。因为≥100β-catenin靶基因(http://www.stanford.edu网站/~rnusse/pathways/targets.html)已经确定，不同的上游和下游信号级联可以在微调β中收敛-连环蛋白转录活性(Jin等人，2008年). 例如，NO可以抑制EGF-R和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT生存途径(Estrada等人，2005年；Torroglosa等人，2007年)、和GSK-3型β是Akt的下游靶标(Maiese等人，2008年). 此外，过氧亚硝酸盐诱导的硝化调节PI3激酶的p85亚基(Zhang等人，2005年；Trowbridge等人，2006年；Phukan等人，2010年). 此外，多种分子，包括生长因子和多巴胺通过D2受体，can信号通过（PI3K）/AKT/GSK-3β和Wnt信号激活(Spiegel等人，2007年；Beaulieu等人，2011年；Oieda等人，2011年); 因此，“相声”Wnt（重量）/β-连环蛋白在微调此处观察到的SVZ神经生成潜能/可塑性时，可以设想出显著的细胞内途径(图10).

总之，在SVZ中复杂的细胞-细胞相互作用和信号级联中，我们在此揭示了Wnt（重量）/β-连环蛋白MPTP和小胶质细胞衍生的氧化和亚硝化介质通过上调葛兰素史克-β和β-连环蛋白退化是PD神经源性损伤的候选因素。与星形胶质细胞衍生Wnts和Wnt（重量）/β-连环蛋白在拯救此处观察到的受损神经原潜能的信号传递中，深入了解这些内源性神经前体细胞保护、激活和迁移到损伤部位的机制，将代表在这些模型中促进病变/损伤DA能神经元内源性恢复的策略(Borta和Hoglinger，2007年；赫尔曼和斯托奇，2008年；Ouredinik等人，2009年；Fernando等人，2010年；Deleidi等人，2011年).

脚注

作者声明没有竞争性的经济利益。

这项工作得到了意大利卫生部（合同82；PS-CARDIO ex 56和PS-NEURO ex 56授予B.M.；青年研究员奖GR08-7授予S.P.）、意大利研究部（Curr.Res.2008-2011授予B.M.）、意大利多发性硬化症基金会（部分拨款2004/R/15和2010/R/31授予S.P.）的支持，国家多发性硬化协会（向S.P.部分拨款RG-4001-A1）、意大利研究与大学部（向B.M.）、永生之翼（向S.M.拨款XBAG/163）、Banca Agricola Popolare di Ragusa（向S.P无限制拨款）、OASI（IRCCS）智障和脑老化研究与护理机构，欧洲研究委员会（ERC-2010-StG Grant 260511-SEM_SEM）和John and Lucille van Geest Trust（向S.P.无限制授予）。

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文章来自神经科学杂志由提供神经科学学会