Development of histocompatible primate-induced pluripotent stem cells for neural transplantation

doi:10.1002/stem.662

.2011年7月；29(7):1052-63.

doi:10.1002/stem.662。

用于神经移植的组织相容性灵长类诱导多能干细胞的研制

米歇拉·德莱迪¹, 冈纳·哈格斯, 佩内洛普·哈雷特, 特蕾西娅·奥斯本, 艾萨克森

附属公司

PMID： 21608081
预防性维修识别码：项目经理3340906
内政部： 10.1002/第662项

用于神经移植的组织相容性灵长类诱导多能干细胞的研制

米歇拉·德莱迪等。干细胞. 2011年7月.

.2011年7月；29(7):1052-63.

doi:10.1002/stem.662。

作者

米歇拉·德莱迪¹, 冈纳·哈格斯, 佩内洛普·哈雷特, 特蕾西娅·奥斯本, 艾萨克森

附属

¹美国马萨诸塞州贝尔蒙特市哈佛医学院/麦克莱恩医院神经再生研究中心，邮编02478。

PMID： 21608081
预防性维修识别码：项目经理3340906
内政部： 10.1002/第662项

摘要

免疫排斥和肿瘤形成风险可能是干细胞移植领域最大的障碍。在这里，我们报道了从食蟹猴（CM）皮肤成纤维细胞中产生的几株诱导多能干细胞（iPSCs），这些成纤维细胞携带特定的主要组织相容性复合体（MHC）单倍型。为了收集MHC匹配的多能干细胞，我们通过微卫星聚合酶链反应分析对25例巨细胞瘤的MHC位点进行了基因分型。利用皮肤成纤维细胞的逆转录病毒感染，我们产生了几个携带不同单倍型的CM-iPSC株。我们对CM-iPSCs的免疫学特性进行了表征，并证明CM-iPSC可以在体外沿特定的神经元群（如中脑多巴胺能（DA）神经元）分化。CM-iPSC产生的中脑样DA神经元整合到帕金森氏病啮齿动物模型的纹状体中，促进行为恢复。重要的是，移植动物在移植后6个月内未观察到肿瘤形成或炎症反应。我们相信，这种组织相容性多能干细胞的产生和表征将允许在再生医学领域对多能干干细胞治疗神经退行性疾病和其他几种人类疾病的安全性和有效性进行临床前验证。

PubMed免责声明

利益冲突声明

潜在利益冲突的披露：作者表示没有潜在的利益冲突。

数字

**图1。食蟹猴iPSC的产生**
**（A–B）**MEF上显示CM-iPSC类ESC形态的相位对比图像。**（C）**CM-iPSCs的高分辨率图像显示高核质比和突出的核仁。**（D）**多能性标记物Nanog、Oct4、SSEA-4、TRA-1–60和TRA-1–81的免疫荧光染色。**（E）**CM-iPSC菌落碱性磷酸酶（AP）染色阳性。**（F）**CM-iPSCs的核型分析（第27-04行，第10代）。CM-iPSCs扩增后保持正常的42，XY核型。**（G）**定量RT-PCR显示Sox2、Oct4、Klf4和c-Myc内源性转录物的诱导。四种重编程因子的内源性（黑色）或病毒外源性（红色）编码转录物的特异引物。用四种逆转录病毒（RV-FIB）转导四天后，猴皮肤成纤维细胞被用作病毒转基因表达的阳性对照。通过β-肌动蛋白的平均值对数值进行标准化。数值表示为3个独立实验的平均值+SEM。在每个实验中，hESCs（H9）的值设置为1。比例尺，200µm（A–B，D–E）；20微米（C）。

**图2。CM-iPSCs中DA神经元的产生**
**（A）**体外分化方案示意图。**（B）**图表显示了β-TubIII和TH染色阳性的细胞相对于核Hoechst染色的百分比。数值表示为3个独立实验的平均值+SEM。**（C）**来自CM-iPSCs（DIV 21）的神经玫瑰花结。**（D）**来自CM-iPSCs的分化神经元（DIV 42）。**（E–F）**β-TubIII（绿色）和TH（红色）CM-iPSCs神经元培养物的免疫荧光染色。**（G）**β-TubIII（绿色）、TH（红色）和Foxa2（蓝色）染色神经元培养物的共焦图像。**（H）**定量RT-PCR分析分化iPSCs中脑转录因子、DA神经传递标记物（TH、Foxa2、VMAT、ALDH、Nurr1、En1、AADC、Pax6）和Calbindin。从分化的iPSCs中分离出cDNA，并将其值归一化为β-肌动蛋白水平。数值代表平均值+SEM。三个独立实验一式三份。比例尺：50µm（C–D）；20µm（E–G）。

**图3。CM iPSC衍生神经元移植到幼稚大鼠成年纹状体**
将CM-iPSCs（MF-01系）分化为DA神经元，并将200000个细胞移植到免疫抑制状态下未受损大鼠的右侧纹状体。移植后4周对移植物进行分析。**（A–B）**共焦重建人类/灵长类特异性神经细胞粘附分子（NCAM）（绿色）和TH（红色）的典型移植物染色。细胞核用Hoechst复染。**（C）**移植物放大倍数较低。**（D–F）**移植后4周，NCAM染色的脑切片的显微照片显示，NCAM+神经元从移植物沿白质束（胼胝体）和大脑皮层向宿主纹状体的轴突生长。**（G）**hNCAM（绿色）和小胶质细胞标记物Iba1（红色）的免疫染色显示没有小胶质细胞反应。**（H）**增殖标记Ki-67（红色）和Oct4（绿色）的免疫染色显示移植体内Ki-67+/Oct4-细胞的百分比较低。比例尺：100微米（A–B、D和F-H），200微米（C、E）。

**图4。CM-iPSC衍生神经元改善帕金森病大鼠行为缺陷**
**（A）**将CM-iPSCs（系MF-01）分化为DA神经元，并在免疫抑制条件下将400000个细胞移植到6OHDA致敏大鼠的右侧纹状体。在移植前和移植后4、8、12和16周检查安非他命和阿扑吗啡的反应。与移植前评分相比，动物的反应逐渐减少。（移植动物n=9，仅损伤动物n=4；*，p<0.05 ANOVA-随时间重复测量）。**（B–G）**来源于分化灵长类iPSC的代表性移植物（大鼠#3211、#3240）中的酪氨酸羟化酶（TH）免疫反应显示移植物内的TH+神经元和致密TH神经炎树突区。比例尺：200µm（B–D）；50微米（F），20微米（E–G）。

**图5。神经元移植物分析**
移植后16周CM-iPSC衍生移植物的共聚焦分析。**（A）**小胶质标记物Iba1的染色显示移植物周围没有活化的小胶质细胞。插入物显示具有静息表型的小胶质细胞高倍放大。**（B）**星形细胞标志物GFAP染色显示移植物周围没有星形胶质细胞增生。**（C）**增殖标记Ki-67染色显示移植16周后没有增殖细胞。**（D–F）**iPSC移植物的共聚焦分析显示，大多数移植物含有中脑样DA神经元。移植的TH+细胞（红色）与抗人类NCAM（蓝色）（D-F）、FOXA2（绿色）（D-E）、GIRK2（蓝色）。**（G）**共焦图像显示一个典型移植物中TH+神经元（红色）共同表达钙结合蛋白钙结合蛋白（红色）。**（H）**共焦图像显示人类突触蛋白在移植物和宿主纹状体中的定位。**（I）**TH+神经元数量与旋转次数的相关性（n=9；简单回归，r=0.885，r²=0.784，P=0.01）。比例尺：100微米（A–D）、50微米（A-E）、20微米（F–I）。

**图6。神经元移植物的长期分析**
将CM-iPSCs（系MF 27-04）分化为DA神经元，并将400000个细胞移植到6-OHDA致敏大鼠的右侧纹状体。**（A–B）**在移植前和移植后4、8、12、16和24周检查安非他明和阿扑吗啡的反应。与移植前评分相比，动物的反应逐渐减少。（移植动物n=11，仅损伤动物n=6；*，p<0.05；**，p<0.01，ANOVA随时间重复测量）。**（C）**共焦重建hNCAM染色的典型移植物（红色）。**（D）**典型移植物中的NCAM免疫反应。**（E–F，H）**典型移植物中的TH免疫反应显示TH+神经元存活和神经炎树突化。**（G）**小胶质标记物Iba1的染色显示移植物周围没有活化的小胶质细胞。比例尺：100µm（B–C，G）、200µm（E）、20µm（F，H）。

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