Akt/糖原合成酶激酶-3β通路的差异调节调节凋亡和细胞保护信号反应^*S公司⃞

摘要

帕金森病（PD）的特征性病理学²黑质致密部多巴胺能神经元变性与路易体包涵体(1). 帕金森病多巴胺能细胞死亡的机制尚未阐明。在帕金森病患者的大脑中发现了多种细胞和分子变化，这些变化表明线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白酶体功能障碍和凋亡（有关综述，请参阅参考文献。2和三). 具体而言，大量证据表明，氧化应激或活性氧介导的细胞凋亡可能有助于在PD中观察到的进行性和选择性神经元变性(4). PD患者的大脑增加了铁（促进自由基形成），降低了还原性谷胱甘肽（大脑中主要的抗氧化剂）的水平，并有证据表明DNA、脂质和蛋白质受到氧化损伤(5). 此外，在帕金森病患者的黑质致密部，环氧合酶水平增加，这有助于氧化剂多巴胺醌的形成(5)线粒体复合物I活性降低，从而促进自由基形成(6-8).

目前对帕金森病的治疗主要基于多巴胺替代策略。尽管帕金森病患者具有有效的抗帕金森病作用，特别是在疾病的早期，但他们最终会发展出一些潜在的致残特征，如跌倒、冻僵和痴呆，而现有的治疗方法无法令人满意地控制这些特征(9). 因此，人们一直在加紧寻找可能保护或恢复神经元功能的治疗方法，否则这些神经元会在PD中退化，从而阻止或减缓疾病进展速度。

激活D的多巴胺激动剂₂受体基于其提供短期症状改善的能力而被广泛用于治疗PD。最近的兴趣还集中在多巴胺激动剂提供神经保护作用和减缓PD进展速度的潜力上(18). 罗哌尼罗和其他多巴胺激动剂被发现能够保护多巴胺神经元免受两种药物中多种毒素的伤害在体外和体内模型(10-15). 此外，在PD患者的临床试验中，与左旋多巴相比，罗哌尼罗延缓了黑质纹状体功能的神经影像替代生物标记物的下降速度(16,17). 这些发现增加了罗哌尼罗可能具有神经保护作用并减缓PD进展速度的可能性。虽然已经提出了几种机制来解释这些药物如何提供神经保护(18)，最感兴趣的是它们提供抗凋亡作用的潜力。然而，罗哌尼罗诱导抗凋亡作用的确切信号机制尚不清楚。

以前，我们已经证明一些多巴胺激动剂通过激活D₂依赖于受体的PI-3K/Akt信号通路独立于其激活GTPγS结合的能力(14,15). 为了阐明PI-3K/Akt信号通路的下游效应器，该通路介导激动剂特异性调节细胞存活，我们研究了多巴胺激动剂罗哌尼罗激活的抗凋亡信号通路。我们现在报告，罗哌啶醇介导的抗氧化应激保护涉及激活PI-3K/Akt介导的GSK-3β磷酸化（失活），并且氧化应激对该途径的调节具有相反的作用。

实验程序

化学制品-Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）、Opti-MEM1、DMEM/F-12、N2补充剂和胎牛血清均来自Invitrogen。Ropinirole从葛兰素史克公司（北卡罗来纳州三角研究园）获得。PI-3K抑制剂LY294002和GSK-3β抑制剂VIII来自Calbiochem。CellTiter-Blue检测试剂盒来自Promega（威斯康星州麦迪逊）。Amersham Biosciences增强化学发光（ECL）Western印迹检测试剂盒来自GE Healthcare。氟哌啶醇、氯乙烷、过氧化氢（H₂O（运行）₂)，聚乙烯-d日-赖氨酸和β-肌动蛋白抗体来自Sigma。对磷酸化Akt、Akt、磷酸化GSK-3β、磷酸化p70S6激酶、磷酸化β-catenin和β-catentin特异的抗体来自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）。磷叉转录因子（FKHR）和GSK-3β抗体来自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克拉拉）。酪氨酸羟化酶抗体来自Chemicon（Temecula，CA）。神经转运转染试剂来自Mirus（威斯康星州麦迪逊）。Alexa Fluor 488驴抗羊IgG和Alexa Fuor 592鸡抗兔IgG来自分子探针（Invitrogen）。[^三H] 多巴胺（40μCi/mmol）购自Amersham Biosciences。

细胞培养-PC12和PC12-D₂如前所述，在含有5%CO的湿润气氛中培养R细胞₂37°C时(14,15,19-21). 在对细胞进行各种处理前3 h，用Opti-MEM1替换培养基。如前所述，从胚胎第14天的大鼠胎儿（E14；马萨诸塞州威尔明顿的查尔斯河实验室）中制备多巴胺能神经元培养物(22). 简单地说，中脑腹侧部分在无菌冰镇钙中被切除²⁺和镁²⁺-游离HBSS/HEPES溶液，清除脑膜组织，通过火焰抛光巴斯德吸管机械分离。分离的细胞以～1.2×10的密度进行培养⁵每厘米细胞数²关于多晶硅-d日-赖氨酸涂层24孔板或玻璃盖玻片。将神经元维持在由Dulbecco改良的Eagle培养基/F-12培养基组成的化学定义的培养基中，我-谷氨酰胺（0.5米米)和青霉素/链霉素（无血清培养基）。每2天更换一半培养基。实验中使用了大约5-7天龄的培养物。

CellTiter-Blue细胞毒性试验-为了分析细胞存活率，细胞以10⁴细胞/孔置于96毫升细胞培养板上（在100μl培养基中），并生长24小时。此后，200μl米H（H）₂O（运行）₂在指示浓度下添加罗哌尼罗或不添加罗哌尼罗，然后再培养细胞24小时。处理后，向每个孔中添加20μl Cell-Titer-Blue试剂，并培养平板2-3小时。如前所述，使用分光荧光计（Spectra Max Gemini XS，Molecular Devices，Sunnyvale，CA）定量活细胞将非荧光Cell-Titer-Blue试剂转化为高荧光底物(19,20). 数据表示为车辆处理控制的百分比，数值表示三个独立实验中每个实验的八个微孔的平均值±S.E(n个= 24).

吸纳[^三H] 多巴胺—[^三H] 如前所述，初级中脑神经元摄取多巴胺(19). 结果表示为车辆处理对照培养反应的百分比。

转染和DNA构建-PC12-D（PC12-D）₂R电池（1×10⁵)用完全培养基将其放入60mm培养皿中。24小时后，将2.5μg编码绿色荧光蛋白（PH-Akt-GFP）标记的Akt蛋白激酶（1-167个氨基酸）蛋白同源（PH）结构域的质粒DNA转染细胞(15)或shRNA结构，如U6-XASH3 HP、U6-Akt1 HP3和U6-GSK-3βHP1（由D.L.Turner慷慨提供(23))使用变速箱如上所述的IT-Neural转染试剂(19).

免疫细胞化学-用于免疫荧光检测，PC12-D₂表达PH-Akt-GFP细胞的R细胞用罗哌尼罗处理15分钟。固定细胞，并在奥林巴斯（BX65）垂直荧光显微镜下观察GFP。检测内源性磷酸化-Akt、磷酸化-GSK-3β、GSK-3β和β-catenin、PC12-D₂用磷酸化Akt、磷酸化GSK-3β、GSK-3β或β-连环蛋白抗体对R细胞进行免疫染色，并使用Alexa Fluor 592偶联的鸡抗兔IgG进行可视化，如前所述(20). 为了检测多巴胺神经元中的磷酸化谷胱甘肽激酶-3β，用酪氨酸羟化酶和磷酸化谷蛋白激酶-3β特异性抗体对原代中脑培养物进行染色，并用Alexa Fluor 488驴抗羊IgG和592-结合鸡抗兔IgG进行可视化。细胞核用荧光DNA染料4′，6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐（DAPI）染色。将载玻片安装在Vectashield（Vector Laboratories，Burlingame，CA）安装介质中，并在奥林巴斯（Olympus）（BX65）垂直荧光显微镜下进行检查。

免疫印迹和免疫沉淀-电池（3×10⁶细胞/100-mm培养板）培养24h，分别处理后，用冰镇磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，并在20m缓冲液中溶解米三氯化氢，pH 7.5，150 m米氯化钠，1%IGEPAL C630，1 m米苯甲基磺酰氟，1 m米原钒酸钠、5μg/ml抑肽酶和蛋白酶抑制剂的混合物（罗氏诊断公司）在4°C下离心20分钟。在14000×克在4°C下持续20分钟，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质。将分离的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上，与磷酸化Akt、Akt底物、GSK-3β、p70S6激酶、FKHR或β-catenin孵育，然后用过氧化物酶偶联二级抗体和ECL试剂检测。然后在含有62.5 m的剥离缓冲液中剥离斑点米三重HCl，pH 6.7，2%十二烷基硫酸钠，100μ米β-巯基乙醇，并探测总Akt、GSK-3β或β-肌动蛋白。

对于免疫沉淀，蛋白质提取物与抗GSK-3β抗体和蛋白A/G-琼脂糖（圣克鲁斯生物技术公司）在温和搅拌下依次孵育（4°C下每次孵育2小时）。免疫沉淀物用裂解缓冲液洗涤3次，在3×Laemmli样品缓冲液中煮沸5 min，并使用GSK-3β或β-catenin抗体进行Western blotting。剥离印迹，并用抗β-肌动蛋白抗体重制。

体外GSK-3β活性测定-在4°C下，用2μg抗GSK-3β抗体和抗兔IgG珠（eBioscience，加州圣地亚哥）在1 mg蛋白质提取物中免疫沉淀GSK-3。GST-β-catenin融合蛋白的细菌裂解物(24)在室温下与GST Sepharose珠（Amersham Biosciences）预结合。然后用GSK-3β免疫沉淀物在分析缓冲液（20 m）中孵育珠子米Tris，pH 7.5，10 m米氯化镁₂，5米米二硫苏糖醇，0.2 m米ATP）在30°C下保持30分钟。通过添加Laemmli负载缓冲液停止反应，煮沸5分钟，并在SDS-PAGE上进行解析。使用兔IgG TrueBlot Set试剂（eBioscience）进行免疫印迹。用抗β-连环蛋白抗体和抗磷酸化β-连环素抗体检测GST-β-catenin。为了检测反应混合物中的GSK-3β，使用抗GSK-3抗体。

统计分析-数据通过双尾分析t吨进行方差测试或分析，然后进行Tukey检验，以纠正多次比较。

结果

多巴胺激动剂罗皮尼罗保护PC12-D₂D激活氧化应激诱导的R细胞和初级中脑神经元死亡₂受体-我们研究了多巴胺激动剂罗哌尼罗对H诱导的细胞凋亡的保护作用₂O（运行）₂在表达D的PC12细胞中₂受体（PC12-D₂R） ●●●●。用不同浓度的罗哌尼罗（10^-11到10^-3 米)添加H之前₂O（运行）₂(200 μ米). 培养24小时后，使用CellTiter-Blue细胞死亡分析评估细胞活力。给药200μ米第页，共页₂O（运行）₂与对照组相比，诱导细胞存活率下降52.9±5.0%。Ropinirole保护PC12-D₂H的R细胞₂O（运行）₂-以强大且浓度依赖的方式诱导细胞凋亡(图1A类). 相反，罗哌尼罗不能保护缺乏D的PC12细胞₂接触H的受体₂O（运行）₂Ropinirole也不能抵抗H₂O（运行）₂当PC12-D₂用多巴胺拮抗剂氟哌啶醇（10μ米)添加罗哌尼罗之前(图1B类).

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图1。

罗匹尼罗保护PC12-D₂R细胞和初级中脑多巴胺神经元通过激活Akt信号通路从氧化应激诱导的细胞死亡中解脱出来。 A类，罗哌尼罗提高未分化PC12-D的细胞存活率₂暴露于H的R细胞₂O（运行）₂不表达多巴胺受体的PC12细胞和表达D₂受体暴露于200μ米H（H）₂O（运行）₂在罗哌尼罗浓度增加的情况下持续24小时，并通过CellTiter-Blue分析评估细胞活力。数据表示为车辆处理控制的百分比，数值表示四个独立实验中八个微孔的平均值±S.E(n个=8). 注意，罗哌尼罗在表达D₂受体，但不在不表达这些受体的亚克隆中。B类，罗哌啶醇介导的保护依赖于与D的相互作用₂受体。PC12-D（PC12-D）₂用200μ米H（H）₂O（运行）₂加1μ米有无10μ的罗哌尼罗米氟哌啶醇或用10μ米PI-3K抑制剂LY294002。罗哌尼罗对H的保护作用₂O（运行）₂-在D的存在下，诱导的细胞凋亡被消除₂受体拮抗剂氟哌啶醇和PI-3K抑制剂LY294002预处理。数据表示三个独立实验的平均值±S.E(n个=8).^*,对与车辆相比<0.001；#，对< 0.001与H（H）₂O（运行）₂;^*#,对< 0.001与罗哌尼罗加氢₂O（运行）₂.C类和D类罗哌尼罗对生存率和死亡率的影响[^三H] 初级中脑神经元对多巴胺的摄取。用1μ米罗哌尼罗（30分钟），罗哌尼罗加10μ米吡虫啉（30分钟），或罗哌尼罗加10μ米LY294002（30分钟）。然后用100μ米6-OHDA培养1h，用含有相应药物的新鲜培养基替换（不含6-OHDA），并培养24h。通过CellTiter-Blue分析评估神经活性(C类)或通过[^三H] 多巴胺摄取测定(D类). 每个治疗组的数值表示为相对于未治疗对照组（100%）的百分比。用吡虫啉或LY294002（10μ米)消除罗哌尼罗对6-OHDA诱导的神经元丢失的保护作用。数据绘制自一个实验（平均值±S.E。，n个=8)两个独立实验的代表。^*,对与车辆相比<0.001；#，对< 0.001与6-OHDA；^*#,对< 0.001与罗匹尼罗加6-OHDA。

尽管PC12细胞被用作研究多巴胺能功能的良好模型，但它们是来源于肾上腺嗜铬细胞瘤的非神经元细胞。因此，为了进一步确定罗哌尼罗是否保护多巴胺神经元，我们使用6-羟基多巴胺（6-OHDA）处理的原代大鼠中脑神经元培养物。如所示图1，C类和D类，罗哌尼罗（1μ米)对6-OHDA诱导的神经元丢失具有显著的神经保护作用。我们的结果与报告一致，即罗哌尼罗保护初级中脑神经元免受1-甲基-4-苯基吡啶的伤害，1-甲基-4-phenyl-1,2,5,6-四氢吡啶是神经毒素毒性的活性代谢产物(10). 当初级中脑神经元与罗哌尼罗和多巴胺拮抗剂依替氯匹（10μg）共同孵育时，罗匹尼罗对6-OHDA毒性没有保护作用米) (图1B类). 这些结果表明，罗哌尼罗保护多巴胺神经元免受H诱导的细胞死亡₂O（运行）₂和6-OHDA，并且该保护通过功能D实现₂受体。

罗匹尼罗对PC12-D的诱导保护作用₂R细胞和初级中脑神经元参与PI-3K/Akt信号通路-我们以前曾报道过D₂PI-3K抑制剂可消除受体激活(14). 因此，我们研究了PI-3K信号是否由D调制₂受体与罗哌尼罗复合时。为了确定PI-3K信号传导是否参与罗匹尼罗介导的保护，我们测试了PI-3K抑制剂LY294002（10μ米). 抑制PI-3K可完全消除罗哌尼罗对PC12细胞氧化应激和原代中脑神经元培养物中6-OHDA诱导的细胞死亡的保护作用(图1，B-D公司). 然而，LY294002本身对细胞存活没有影响(图1B类). 这些数据表明PI-3K通路的激活有助于罗哌尼罗对PC12-D氧化应激诱导的细胞凋亡的保护作用₂原代中脑神经元培养中的R细胞和6-OHDA。

检查PI-3K的主要下游目标Akt(25)，与罗哌啶醇介导的神经保护有关，我们测量了罗哌啶给药后Akt的移位和磷酸化。Akt磷酸化及其保护作用是通过其N末端PH结构域与磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3）的相互作用转移到质膜后发生的(26)从而使该酶接近额外的PIP3依赖和独立蛋白激酶(27). 使用PH-Akt GFP评估Akt的分布(15). 在未刺激的细胞中，磷酸化Akt主要定位于胞体周（补充图1）。相反，D₂罗哌尼罗激活受体导致PH-Akt-GFP快速（15分钟）移位至外周膜区(图2A类,右侧面板). 使用内源性磷酸化Akt抗体同样证明了罗哌啶醇诱导的易位(图2，B类和C类). 罗哌尼罗对正常PC12-D的添加₂R细胞也与磷酸化Akt的显著增加有关，丝氨酸473（Ser⁴⁷³)现场。在添加药物15分钟后也观察到这些结果，并在60分钟后恢复到基础水平(图2，D类和E类). Akt总蛋白水平保持不变。因此，D₂罗哌尼罗对PC12-D受体的刺激作用₂R细胞引起Akt的快速易位和磷酸化。通过联合施用PI-3K抑制剂LY294002（数据未显示）阻止了Akt易位和磷酸化的这些变化，这表明罗哌尼罗通过PI-3K信号通路诱导Akt活化。

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图2。

罗匹尼罗介导Akt激活。 A类，PH-Akt-GFP的D易位₂受体刺激。PC12-D（PC12-D）₂用D刺激表达PH-Akt-GFP的R细胞（转染后48小时）₂激动剂罗哌尼罗（1μ米)固定15min，用表观荧光显微镜检测PH-Akt-GFP的易位。罗匹尼罗刺激PH-Akt-GFP报告子在治疗后15分钟内移位到膜(右侧面板). 所示面板来自八个独立实验中的一个。B类，内源性Akt转位到细胞膜，以响应罗哌尼罗治疗。PC12-D（PC12-D）₂用罗哌尼罗（1μ米)在指定的时间段内，并对磷酸化Ser进行免疫染色⁴⁷³Akt的(红色)DAPI作为细胞核的标记(蓝色). 磷酸化Akt的染色增强主要在罗哌尼罗处理15和30分钟后的细胞膜区域检测到。C类，罗哌啶醇处理细胞中磷酸化Akt的线强度分布。测量磷酸化-Ser质膜定位的相对增加⁴⁷³在Akt中，横切细胞但避开细胞核的线条轮廓用于评估荧光强度。使用ImageJ（NIH）对每组6至8个行细胞进行评估，以获得每个治疗组的平均荧光强度分布。注意，给药后15和30分钟，Akt明显从整个细胞的弥散分布转移到膜周定位。D类，Ser磷酸化⁴⁷³罗匹尼罗的Akt。PC12-D（PC12-D）₂用1μ米罗哌尼罗用于指定的时间段。刺激后，制备细胞裂解物，并用抗磷酸化Akt（Ser⁴⁷³)抗体或带有抗Akt抗体。磷化氢-Akt(p-Akt公司)用抗β-肌动蛋白抗体剥离并重复印迹。注意，罗哌尼罗在15和30分钟时诱导Akt磷酸化。E类定量结果显示罗哌尼罗治疗后磷酸化Akt水平的变化。图表显示了三个实验的平均值±S.D。Ser的磷酸化⁴⁷³Akt的比值计算为磷酸化Akt和总Akt之间的比值，并表示为治疗期之间的-倍差异。

Ropinirole对PI-3K/Akt信号通路下游效应器的影响-已知PI-3K/Akt途径通过失活促凋亡因子和通过磷酸化依赖机制激活抗凋亡因子来促进细胞存活(28-30). 为了确定罗匹尼罗是否诱导PI-3K/Akt通路的任何特定效应器的激活，我们检测了罗匹尼罗对Akt底物蛋白Ser/Tr磷酸化的影响(28)给未经治疗的PC12-D₂R电池。Western blot分析表明，罗哌尼罗治疗诱导磷酸化Akt底物的瞬时积累与Akt磷酸化的时间一致(图3A类). Akt的磷酸化下游底物之一被确定为GSK-3β(图3，B类和C类)在其激活（去磷酸化）状态下促进细胞死亡以应对氧化应激(31). 罗匹尼罗未诱导p70S6激酶或FKHR磷酸化(图3B类)Akt的另外两个下游基质。LY294002阻断PI-3K阻断罗哌啶诱导的Akt底物磷酸化，包括GSK-3β(图4).

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图3。

罗哌尼罗激活的Akt信号通路下游效应器。 A类，PC12-D₂用1μ米罗匹尼罗在指定的时间内。刺激后，制备细胞裂解物，并用抗磷酸化-（Ser/Thr）Akt底物特异性抗体进行Western blotting分析(箭头)或抗β肌动蛋白抗体。B类GSK-3β是罗哌尼罗的下游效应器之一。PC12-D（PC12-D）₂用罗哌尼罗（1μ米)在指定的时间段内，细胞裂解物用抗磷免疫印迹法进行分析(对)-p70S6激酶、抗磷酸化FKHR和磷酸化GSK-3β（Ser⁹)抗体。剥离磷脂酶-GSK-3β印迹，并用抗GSK-3β抗体重复。实验重复了三次，结果相似。注意GSK-3β的磷酸化增加，但FKHR或p70S6激酶的磷酸化没有增加。C类定量结果显示罗哌尼罗治疗后磷酸化GSK-3β水平的变化。图表显示了三个实验的平均值±S.D。Ser的磷酸化⁹谷胱甘肽激酶-3β的含量计算为磷酸化谷胱甘蛋白激酶-3β与总谷胱甘氨酸激酶-3β之间的比率，并表示为治疗期之间的倍差。

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图4。

抑制PI 3-激酶可通过罗哌尼罗消除Akt和Akt效应器的磷酸化。PC12-D（PC12-D）₂用PI-3K抑制剂LY294002（10μ米)30分钟，用1μ米罗哌尼罗15分钟。刺激后，制备细胞裂解物，并用特异性抗磷抗体进行免疫印迹分析(对)-Akt、磷酸化-（Ser/Thr）Akt底物和磷酸化-GSK-3β（Ser⁹)抗体。磷酸化GSK-3β印迹被剥离并用抗β-肌动蛋白抗体重新处理。实验重复了三次，结果相似。请注意，罗哌尼罗可诱导Akt和GSK-3β的磷酸化，这些作用可通过PI-3K抑制剂逆转{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“LY294001”，“term_id”：“1257998345”，“term_text”：“LY294001“}}LY294001型.

Akt和GSK-3β对细胞生存至关重要-为了研究Akt/GSK-3β信号转导在细胞存活中的作用，我们使用了Akt1和GSK-3β特异的shRNA(23). 我们使用PH-Akt-GFP构建物来测定PC12-D的转染效率₂R电池。转染48小时后，PH-Akt-GFP的瞬时表达产生约50-60%的GFP阳性细胞（数据未显示）。正常PC12-D时₂用Akt shRNA或GSK-3βshRNA转染R细胞，转染48 h后观察到细胞活力显著降低(图5，A类和B类). 与转染U6-XASH3 HP对照载体相比，转染针对Akt和GSK-3β的发夹状小干扰RNA表达载体分别降低了Akt的表达和GSK-2β的表达(图5，A类和B类). 由于GSK-3β是Akt的下游效应物，我们检测了Akt敲低细胞中GSK-3β的磷酸化。如所示图5C类、Akt抑制降低了GSK-3β的磷酸化和GSK-3靶β-连环蛋白的水平(32). 为了进一步证实Akt在细胞存活中的作用，我们评估了Akt1 shRNA转染细胞中Akt的水平。我们发现，Akt水平在核形态正常的细胞中得以保留，而在核浓缩的细胞中显著降低，这表明细胞死亡与Akt低水平密切相关(图5D类). 这些结果表明，Akt通过GSK-3β信号传导作用对PC12-D的生存是必要的₂R电池。以前我们已经证明，p53和细胞外调节激酶（ERK）信号在这些细胞中分别介导细胞死亡和存活中起着重要作用(19-21). 在Akt敲除细胞中观察到磷酸化p53水平的显著增加和ERK的降低(图5C类)表明Akt与促凋亡和抗凋亡信号通路之间存在相互作用。

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图5。

Akt和GSK-3的损失β诱导PC12-D细胞死亡₂R电池。Akt的影响(A类)-和GSK-3β(B类)-PC12-D上的特异性shRNA构建₂R细胞存活。细胞转染Akt(A类)-或GSK-3β(B类)-特异性shRNA构建，转染48小时后用CellTiter-Blue荧光法测定细胞活力。对照shRNA构建物XASH3 HP被用作对照。用Western免疫印迹法测定GSK-3β抑制细胞中GSK-3蛋白水平(B类). 数据以未转染对照的百分比表示，这些值代表两个独立实验中每个实验的12个微孔的平均值±S.E。在A类和B、 对与XASH3 HP3相比<0.001。C类，用Akt1 HP3 shRNA构建物转染细胞。48小时后，制备总细胞裂解物，并且Akt、GSK-3β、磷酸化(对)-通过Western免疫印迹法测定GSK-3β、β-catenin、p53和ERK水平。以shRNA构建物XASH3 HP作为对照。β-肌动蛋白为负荷对照。请注意，Akt的敲除诱导磷酸化（失活）GSK-3β，β-catenin的下调，p-p53水平升高，ERK水平降低。D类，Akt击倒细胞中Akt水平的免疫细胞化学分析。PC12-D（PC12-D）₂用XASH3或Akt1 shRNA转染R细胞，44小时后用抗Akt抗体标记(红色). 总之，细胞核用DAPI染色(蓝色). 注意，Akt1 shRNA导致Akt水平降低，并在核浓缩的细胞中共存(箭头).

氧化应激引起的Ropinirole预防Akt/GSK-3的去磷酸化β-以前有报道称激活（去磷酸化）的GSK-3β促进细胞死亡，而N末端丝氨酸磷酸化使GSK-3α失活并促进细胞存活(33-36). 我们检测了暴露于H后Akt和GSK-3β的磷酸化状态₂O（运行）₂.我们发现H₂O（运行）₂导致Ser去磷酸化⁴⁷³Akt（导致其变为非活动状态）和Ser⁹谷胱甘肽激酶-3β（使其激活）(图6，A类和B类). 然而，H₂O（运行）₂治疗对Akt或GSK-3β蛋白的总水平没有影响(图6A类).

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图6。

Akt和GSK-3的参与β-氧化应激诱导的细胞死亡中的信号通路。 A类、磷酸化Akt水平的代表性Western blot分析和磷酸化(对)-暴露于H后的GSK-3β₂O（运行）₂.PC12-D₂用指示浓度的H处理R细胞₂O（运行）₂对细胞裂解物进行Ser磷酸化分析⁴⁷³Akt和Ser⁹通过Western免疫印迹法检测GSK-3β。剥离印迹，并用相应的非磷酸化蛋白抗体进行复制。B类定量结果显示，磷酸化GSK-3β和磷酸化Akt水平的变化分别归一化为GSK-3？和Akt。图表显示了三个实验的平均值±S.D。Ser的磷酸化⁴⁷³Akt和Ser⁹GSK-3β的比值计算为各磷蛋白和总蛋白之间的比值，并表示为治疗组之间的-倍差异。C类代表性Western blot分析和H中β-catenin水平的定量分析₂O（运行）₂-处理过的细胞。PC12-D（PC12-D）₂用指示浓度的H处理R细胞₂O（运行）₂1h后，用Western blot检测β-catenin水平(上部面板). β-肌动蛋白作为负荷对照。PC12-D中的β-连环蛋白水平₂用200μ米H（H）₂O（运行）₂1小时后，将β-肌动蛋白水平标准化，结果表示为三个独立实验中蛋白质水平的平均值±标准偏差(下部面板).^*,对与车辆相比<0.001（0小时）。D类GSK-3βSer的免疫细胞化学分析⁹H对β-连环蛋白的去磷酸化和降解₂O（运行）₂.PC12-D₂用H处理R细胞₂O（运行）₂（200μM）1小时，并用抗磷酸化GSK-3β（Ser⁹)、GSK-3β或β-catenin。总之，细胞核用DAPI染色(蓝色). 注意H₂O（运行）₂诱导GSK-3β磷酸化显著降低，β-catenin降解增强。

为了确定氧化应激对GSK-3β激活状态的影响，我们检测了β-catenin的水平，这是一种受GSK-3？调节的转录激活物。活化的GSK-3β使β-catenin磷酸化，导致其快速降解（综述见参考文献。32). H（H）₂O（运行）₂PC12-D的治疗₂R细胞导致Ser去磷酸化⁹GSK-3β（活化）(图6，A类和B类)β-catenin降解增加(图6C类). 磷酸化-Ser的免疫细胞化学染色⁹GSK-3β和总β-catenin进一步证实PC12-D的治疗₂带有H的R电池₂O（运行）₂去磷酸化GSK-3β(图6D类,左上面板)并促进β-catenin的降解(图6D类,左下面板).

由于罗哌尼罗保护初级中脑神经元，我们假设磷酸化GSK-3βSer的增加⁹表明GSK-3β活性降低的水平可能有助于神经保护对抗6-OHDA毒性。因此，我们研究了罗哌尼罗和6-OHDA对初级中脑神经元GSK-3β磷酸化的影响。罗匹尼罗引起血清⁹酪氨酸羟化酶阳性多巴胺能神经元中GSK-3β的磷酸化(图7和补充图2）。相比之下，6-OHDA导致血清Ser水平小而显著的下降⁹原代中脑神经元中GSK-3β的表达(图7和补充图2）。这些结果与我们的假设相一致，即GSK-3β的激活状态有助于细胞生存状态，而罗哌尼罗诱导的GSK-3蛋白丝氨酸磷酸化增加有助于多巴胺能神经元抵抗氧化应激的存活。

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图7。

磷酸化GSK-3水平增加β罗哌尼罗治疗后酪氨酸羟化酶阳性神经元。用1μ米罗哌尼罗30分钟或100μ米6-OHDA作用1h。用抗甲状腺激素羟化酶对培养物进行双重免疫标记(TH，绿色)和抗磷(对)-GSK-3β(红色)抗体如“实验程序”所述。细胞核用DAPI染色(蓝色). 然后用荧光显微镜检查培养物。实验重复了三次，并显示了具有代表性的图像。底部面板，多巴胺神经元中磷酸化GSK-3β免疫荧光信号的定量。测量细胞质磷酸化-Ser的相对增加⁶在GSK-3β中，横切神经元但避开细胞核的线条轮廓用于评估荧光强度（参见补充图2）。使用ImageJ（NIH）对每组6至8行细胞进行评估，以获得每个治疗组的平均荧光强度分布。注意显著增加(对<0.001）磷酸化GSK-3(对<0.05）。

为了进一步研究GSK-3β在氧化应激诱导的细胞死亡中的作用，我们检测了GSK-3α抑制剂VIII的作用。PC12-D的预处理（1 h）₂含有GSK-3β抑制剂VIII的R细胞在H₂O（运行）₂处理(图8). 当浓度为0.5μ米，在1μ米.

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图8。

抑制GSK-3β和D₂受体刺激阻止细胞死亡和GSK-3去磷酸化β按H₂O（运行）₂.PC12-D（PC12-D）₂R细胞用1μ米GSK-3β抑制剂VIII加入200μ米H（H）₂O（运行）₂24小时后通过CellTiter Blue荧光测定法评估细胞活力。数据表示为经溶媒处理的对照组的百分比，这些值表示三个独立实验中每个实验的八个微孔的平均值±S.E。H的值₂O（运行）₂与对照组相比，单独用药为56.61±4.35。^*,对与车辆相比<0.001；#，对< 0.001与H（H）₂O（运行）₂.印度。八，抑制剂VIII。

接下来我们研究了GSK-3β促进细胞存活和细胞死亡的机制。已知GSK-3β磷酸化β-连环蛋白导致泛素-蛋白酶体系统降解；因此，我们检测了H处理细胞中GSK-3β的活性₂O（运行）₂使用或不使用罗哌尼罗或GSK-3β抑制剂VIII预处理。GSK-3β已被证明在血清中磷酸化³³，序列号³⁷和Thr⁴¹β-连环蛋白体内和在体外(37). 因此，我们使用GST标记的β-连环蛋白作为底物来测量GSK-3β的激酶活性。激酶测定表明，GSK-3β磷酸化β-连环蛋白的能力在H₂O（运行）₂-处理过的细胞与载体处理的细胞或H₂O（运行）₂-用罗哌尼罗或GSK-3β抑制剂预处理的处理细胞(图9A类).

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图9。

氧化应激增加GSK-3β活动。 A类，GSK-3β激酶活性。从PC12-D细胞提取物中免疫沉淀GSK-3β₂H处理的R细胞₂O（运行）₂(200 μ米；1小时），用罗哌尼罗（1μ米；30分钟）或GSK-3β抑制剂VIII（1μ米；1 h），然后与h孵育₂O（运行）₂(200 μ米；1小时）。免疫复合物与GST-β-catenin孵育，并使用Western blotting分析“实验程序”中所述的GST-？-catenin-磷酸化。为了确定反应中使用相对等量的GST--β-catentin和免疫沉淀的GSK-3β蛋白，用β-catenin和GSK-3β抗体分别剥离和重制磷酸化β-catentin印迹。GSK-3β激酶活性计算为磷酸化GST-β-catenin和总GST-α-cateniin的比值。图表显示了两个实验的平均值±S.D。B类，H₂O（运行）₂治疗影响β-catenin-GSK-3β复合物的丰度。PC12-D蛋白裂解物₂未经处理的R细胞(车道1)或200μ米H（H）₂O（运行）₂(车道2)免疫沉淀1h(IP（IP）)带有GSK-3β抗体(车道3，车辆；车道4，H₂O（运行）₂). 蛋白质斑点(IB公司)用抗β-catenin抗体或GSK-3β抗体进行检测。为了证实免疫沉淀的GSK-3β蛋白和总裂解物的相对等量被印迹，将GSK-3蛋白印迹剥离并用β-肌动蛋白抗体重制。注意H₂O（运行）₂增加GSK-3β和β-catenin之间的结合以及GST-β-catentin的磷酸化，罗哌尼罗和GSK-3？抑制剂VIII预处理均降低GST-？catenin的磷酸化。

与这些观察结果一致，我们发现H₂O（运行）₂在血清中脱磷GSK-3β⁹残渣(图6，A类和B类)已知激活GSK-3β激酶活性(38). H治疗₂O（运行）₂增加GSK-3β和β-连环蛋白之间的相互作用并促进其降解，而在载体处理的细胞中，几乎检测不到β-连环蛋白/GSK-3β的结合(图9B类). 为了验证这些β-catenin和GSK-3β蛋白的表达，用抗β-catentin、GSK-3和β-actin的抗体对总细胞裂解物的输入控制进行印迹(图9B类). 总之，这些数据表明氧化应激通过激活GSK-3β诱导β-catenin降解。

讨论

我们已经确定GSK-3β是D的下游效应器₂受体激活的PI-3K/Akt信号通路介导D对氧化应激的神经保护₂多巴胺能PC12细胞和原代中脑培养物中的罗哌尼罗激动剂。我们发现氧化应激激活GSK-3β并使Akt失活，从而导致细胞死亡。相反，罗哌尼罗通过激活D₂受体/PI-3K信号通路介导细胞存活。我们的结果表明，Akt/GSK-3β信号通路的差异调节导致细胞保护或促凋亡信号反应。

我们之前已经报道过D的激活₂一些（但不是所有）实验性多巴胺激动剂的受体可以在PC12-D中诱导PI-3K/Akt促生存信号通路₂与表皮生长因子受体反式激活相关的R细胞。这种效应与G蛋白的激活无关，并且随着多巴胺激动剂的不同而不同(14,15). 在本研究中，我们研究了罗哌尼罗可能介导神经保护作用的信号机制。我们没有发现罗哌尼罗对PC12细胞氧化应激和原发性中脑神经元6-OHDA毒性具有受体依赖性细胞保护作用的证据。相反，我们发现多巴胺D的激活₂受体是防止H诱导的细胞凋亡所必需的₂O（运行）₂在这个模型中。这一结论基于以下观察结果：缺乏D的PC12细胞无法获得类似的保护作用₂受体或用氟哌啶醇预处理的受体。用D观察到神经保护缺失₂/D类_三用罗哌尼罗处理的中脑神经元原代培养物中的拮抗剂依氯匹定同样表明D₂受体参与介导罗匹尼罗的神经保护作用。此外，我们表明，这些保护作用依赖于Akt底物GSK-3β的磷酸化和失活。PI-3K抑制后，罗哌尼罗对PC12细胞和初级中脑神经元的保护作用均消失。PI-3K抑制也会使Akt的磷酸化及其天然形式和GFP-连接形式的细胞膜转位丢失（阻止Akt磷酸化和活化）。Akt特异性磷酸化位点下游Akt底物的磷酸化增加证明了Akt活化的功能读数。已知活化的Akt通过使其促凋亡底物失活来促进细胞存活，如FKHR、Bcl-2相关死亡蛋白（BAD）、caspase-9和GSK-3β(30,32). 特别是，在我们的研究中，我们发现罗哌尼治疗和细胞保护与Akt介导的磷酸化在Ser⁹下调其促凋亡活性的GSK-3β(39). 罗哌尼罗磷酸化Ser的能力⁹谷胱甘肽激酶-3β（失活）和谷胱甘蛋白激酶-3β磷酸化（活化）在PI-3K化学抑制剂存在下的丢失表明，谷胱甘素激酶-3β是D₂受体介导的PI-3K/Akt信号通路。shRNA对Akt的抑制导致细胞死亡，表明Akt对细胞生存是必要的。GSK-3βSer的下调⁹Akt敲除细胞中的磷酸化及其靶点β-catenin进一步证实了GSK-3β是PC12细胞中Akt的下游。已知活化的Akt通过灭活促凋亡蛋白p53和激活抗凋亡ERK来促进细胞存活(30,32). p53的水平在其泛素化后由蛋白酶体降解调节，泛素化由E3泛素连接酶Mdm2介导。Akt在控制Mdm2活动中起着关键作用(40). 我们之前已经证明在这些细胞中存在从p53到ERK的负信号串扰通路(21). 这种ERK抑制途径很可能导致Akt敲除细胞中观察到的ERK水平较低。

GSK-3β活性受Akt介导的Ser磷酸化负调控⁹在假衬底域(32). 该途径在生长因子和神经营养素的作用下被激活(41,42)以及我们研究中显示的罗哌尼罗。我们的数据表明，H诱导的氧化应激₂O（运行）₂导致Akt（失活）和Ser去磷酸化⁹GSK-3β的表达，表明这种促凋亡分子的激活。H激活GSK-3β₂O（运行）₂H中GST-β-catenin磷酸化增加的发现证实了这一点₂O（运行）₂-GSK-3β和β-catenin之间的相互作用及其降解证据(图9). GSK-3β抑制剂VIII对GSK-3酶活性的化学抑制也可防止H引起的细胞死亡₂O（运行）₂进一步表明Akt/GSK-3β信号在氧化应激诱导的细胞死亡中起着关键作用。有证据表明，使用特定shRNA减少GSK-3β表达会导致细胞死亡，这进一步说明了GSK-3在细胞存活中的关键作用。我们的结果与GSK-3β在包括PD在内的多种神经细胞死亡机制中发挥关键作用的报道一致(33,35,43-48). GSK-3β被认为通过促进细胞色素的释放而诱导细胞凋亡c（c）线粒体与激活caspase-3(43,49). 罗哌尼罗抑制GSK-3β活性，如血清磷酸化所示⁹并降低与H孵育的罗哌尼罗预处理细胞中GSK-3β的活性₂O（运行）₂，提示在该模型系统中，对该分子的干扰在保护多巴胺能细胞方面也起着重要作用。

值得注意的是，GSK-3β的失活保护细胞免受H的影响₂O（运行）₂毒性，但GSK-3β的完全敲除与细胞存活不相容。事实上，已有研究表明，通过过度表达GSK-3β结合蛋白FRAT-1、使用GSK-3？的激酶显性负突变体或药物抑制剂（如锂）抑制GSK-3的活性，可以保护皮层神经元免受营养性撤退(50). 据报道，GSK-3β的显著化学抑制可阻止H诱导的细胞凋亡₂O（运行）₂在神经分化的PC12细胞中(33). 因此，有强有力的证据表明，激活GSK-3β可促进细胞凋亡，但正常的GSK-3酶活性似乎对细胞生存至关重要。GSK-3β可能通过多种途径发挥作用，RNA抑制以不同于抑制剂的方式干扰其活性。虽然GSK-3β的非活性形式可以诱导细胞死亡，但一定程度的GSK-3活性对细胞生存是必要的。

综上所述，我们的研究结果表明，细胞内GSK-3β是PI-3K/Akt信号通路的下游靶点，在介导氧化应激诱导的细胞死亡和多巴胺激动剂罗比尼罗介导的保护中起主要作用。GSK-3β有多个下游靶点，其中一些参与控制细胞存活对抗氧化应激。为了维持氧化还原体内平衡，有氧细胞已经开发出一种抗氧化机制，其中包括一组被称为第二阶段解毒基因的抗外源基因，如NAD（P）H：醌氧化还原酶1、谷胱甘肽S公司-转移酶、谷胱甘肽-半胱氨酸连接酶、谷肽过氧化物酶和血红素加氧酶(51-54). 转录因子核因子E2相关因子2调节抗氧化剂II期基因的表达，并有助于在氧化剂损伤时保持氧化还原内稳态和细胞活力(55,56). 最近的报告表明，PI-3K/Akt通过GSK-3β激发的生存信号是抗氧化II期细胞反应的关键介体(57,58). 人们普遍认为，在PD中，多巴胺能神经元损害了抗氧化机制。在帕金森病的实验模型中，研究抗氧化II期基因在介导细胞存活和死亡中的作用将是一件有趣的事情。研究表明，随着年龄的增长，氧化应激耐受性的丧失与Akt活性的平行降低有关(59)并增加GSK-3β活性(60).

目前尚不清楚Akt/GSK-3β信号通路是否参与帕金森病的细胞死亡过程。然而，罗哌尼罗在帕金森病实验模型中已被证明具有保护作用，一项临床试验表明，该药物对黑质纹状体功能生物标志物的正效应与保护作用一致(10,13,16,17). 因此，这里描述的分子机制可以解释罗哌尼罗如何在PD中提供神经保护作用。

补充材料

致谢

笔记

^*这项研究得到了葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline Inc.）的部分资助。本文的出版费用部分由页面费用支付。因此，必须在此标记“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。

本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图1和2。

脚注

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