Involvment of cytosolic and mitochondrial GSK-3beta in mitochondrial dysfunction and neuronal cell death of MPTP/MPP-treated neurons

doi:10.1371/journal.pone.0005491

.2009;4（5）：e5491。

doi:10.1371/journal.pone.0005491。 Epub 2009年5月11日。

细胞溶质和线粒体GSK-3beta在MPTP/MPP处理神经元线粒体功能障碍和神经元细胞死亡中的作用

Agnès Petit-Paitel公司¹, 弗雷德里克·布劳, 朱莉·卡扎雷斯, 乔尔·查布里

附属公司

PMID： 19430525
预防性维修识别码：项目经理2675062
内政部： 10.1371/journal.pone.0005491

细胞溶质和线粒体GSK-3beta在MPTP/MPP处理神经元线粒体功能障碍和神经元细胞死亡中的作用

Agnès Petit-Paitel公司等。公共科学图书馆一号. 2009.

.2009;4（5）：e5491。

doi:10.1371/journal.pone.0005491。 Epub 2009年5月11日。

作者

Agnès Petit-Paitel公司¹, Brau炸薯条, 朱莉·卡扎雷斯, 乔尔·查布里

附属

¹法国瓦尔博内Mixte de Recherche 6097国立科学研究中心Moléculaire et Cellulaire药理学研究所。petit@ipmc.cnrs.fr

PMID： 19430525
预防性维修识别码：项目经理2675062
内政部： 10.1371/journal.pone.0005491

摘要

异常的线粒体功能似乎在帕金森病（PD）多巴胺能神经元丧失中起着核心作用。1-甲基-4-苯基吡啶碘化物（MPP（+））是N-甲基-4-苯-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）的活性代谢产物，是线粒体复合物I的选择性抑制剂，广泛用于啮齿类动物和细胞模型中，以诱发与PD相关的神经化学改变。最近的研究表明，糖原合成酶激酶-3beta（GSK-3beta）、，神经细胞凋亡的关键激活剂，参与多巴胺能细胞的死亡。在本研究中，GSK-3beta在调节MPP（+）诱导的线粒体功能障碍和神经元死亡中的作用在体内以及在两种神经元细胞模型（即原代培养和永生神经元）中进行了检测。在这两种细胞模型中，MPTP/MPP（+）治疗导致与GSK-3beta的时间和浓度依赖性激活相关的细胞死亡，这可以通过激酶活性形式的水平增加来证明，即GSK-3beta在酪氨酸216残基处磷酸化。利用免疫细胞化学和亚细胞分离技术，我们发现GSK-3beta部分位于两种神经元细胞模型的线粒体内。此外，MPP（+）处理诱导线粒体中特异性磷酸化Tyr216-GSK-3β标记显著降低，同时胞浆中的磷酸化Tyβ标记增加。使用两种不同的荧光探针，我们发现MPP（+）通过线粒体膜电位去极化诱导细胞死亡。使用特性良好的抑制剂LiCl和kenpaullone抑制GSK-3beta活性，以及RNA干扰，通过阻断线粒体膜电位变化和随后的caspase-9和-3激活，防止MPP（+）诱导的细胞死亡。这些结果表明，GSK-3beta通过其调节线粒体功能的能力，是MPTP/MPP（+）诱导的神经毒性的关键介质。抑制GSK-3beta活性可能对线粒体应激诱导的细胞死亡提供保护。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。体内和*在赛璐珞中*通过MPTP/MPP激活GSK-3β⁺.**
（A）最后一次生理盐水或MPTP给药7天后，用抗TH抗体标记来自生理盐水或MPTP处理的小鼠的冠状中脑切片(绿色)和抗磷Tyr216-GSK-3β(红色)如材料和方法所述。合并的显微照片显示了共标记(*黄色的*)抗磷酸化Tyr216-GSK-3β和抗TH抗体。图像是三个独立实验的代表。（B）在MPTP给药结束后一天或七天，将盐和MPTP处理的小鼠处死。将大脑匀浆，通过Western blotting分析等蛋白量的磷酸化Tyr216-GSK-3β、总GSK-3和β-微管蛋白含量。箭头表示磷酸化Tyr216-GSK-3β，上部免疫阳性带为非特异性标记。（C） TSM1型(左边)和神经元的原代培养(*正确的*)用盐水孵育(控制)或MPP⁺（400µM）。通过Western blotting分析总蛋白（40µg）中的磷酸化Tyr216-GSK-3β、磷酸化Ser9-GSK-3α、总GSK-3γ和β-微管蛋白。（D） TSM1上三个独立实验的印迹定量(左边)和原代培养的神经元(*正确的*). 将每种条件下的磷酸化Tyr216-GSK-3β含量归一化为总GSK-3α含量，并表示为对照条件的百分比。结果为平均值±SD，使用Student进行统计分析t吨-测试*p<0.01与未经处理的样品。

**图2。下调GSK-3β活性对MPP的影响⁺-诱导神经元细胞死亡。**
（A）用MPP处理TSM1和原代培养神经元⁺（0.1至2 mM）持续15 h，通过MTS分析监测细胞活力。数据表示为活神经元与未处理神经元相比的百分比，是三个独立实验的平均值，三次测定±S。D.（B）TSM1代表性显微场的相控照片(左边)和原代培养的神经元(*正确的*)用25 mM LiCl或25µM kenpaullone预处理15分钟，然后用生理盐水或MPP处理⁺在37°C下再保持15小时。放大倍数，×10。（C） TSM1神经元(左边)和小鼠初级神经元(*正确的*)用LiCl或kenpaullone（分别为25 mM和25µM）预处理，然后用MPP培养⁺（400µM）在37°C下持续15小时，并使用MTS分析评估细胞活力。与未处理的神经元相比，数据表示为存活神经元的百分比，是使用三份样本进行的九个独立实验的平均值±S。D.单向方差分析*对<0.01与盐处理细胞。（D） TSM1神经元用LiCl（25 mM）预处理15分钟，并与400µM MPP共同孵育⁺在指定的时间内（0.5、1、2和4 h），提取总蛋白并通过Western blotting分析磷酸化Tyr216-GSK-3β、总GSK-3α和β-微管蛋白含量。如材料和方法中所述，用打乱的siRNA（200 nM）或GSK-3β特异性siRNA（100或200 nM的）转染（E，F）TSM1细胞。转染后两天，分析细胞裂解物的总GSK-3β免疫反应性(*上部面板*)免疫印迹法（F）。为了确定负荷的校正系数，用抗β-微管蛋白抗体重新进行了印迹(*中间面板*). GSK-3β的表达水平通过使用“*美国国立卫生研究院*“我法师并表示为控制条件的百分比。（E）或者，用400µM MPP处理打乱或GSK-3β特异性siRNA-转染细胞⁺在37°C下持续15小时，并使用MTS分析监测细胞活力。各组的存活率与未经处理的对照细胞进行了标准化。误差条代表三个独立实验的S.D。使用Student对400µM MPP+处理的siRNA特异性GSK-3β和干扰siRNA-转染细胞进行统计学上的显著差异t吨-测试(*对<0.05).

**图3。GSK-3β抑制剂阻止MPP⁺-诱导caspases-9和-3活化。**
（A、B、C）TSM1神经元用生理盐水或25 mM氯化锂预处理，然后用400µM MPP孵育⁺指示时间（1、2、4或6小时）。用荧光酶法测定细胞匀浆中细胞内caspase-9（A）和caspase-3（B）的活性。这些数据表示为对照组与未处理神经元相比的百分比，是三个独立实验的平均值，样本为三份±S。D.使用Student进行统计分析t吨-测试(***对<0.005与未经处理的样品）。（C） TSM1细胞用25 mM LiCl预处理或不处理，并用盐水培养(控制)或MPP⁺（400µM）1或2 h。通过Western blotting分析总蛋白（40µg）的活性caspase-3、总caspase-9和肌动蛋白含量。（D，E）用生理盐水或25 mM LiCl预处理原代培养神经元，然后用400µM MPP孵育⁺用于指定的时间（1、2、4或6小时）。用荧光酶法测定细胞匀浆中细胞内caspase-9（D）和caspase-3（E）的活性。这些数据表示为对照组与未处理神经元相比的百分比，是三个独立实验的平均值，样本为三份±S。D.使用Student进行统计分析t吨-测试(*对<0.05与未经处理的样品）。通过Western blotting分析用25 mM LiCl预处理或不处理并用盐水孵育的初级神经元的总caspase-9（D）和活性caspase-3（E）含量(控制)或MPP⁺（400µM）1或2小时。

**图4。GSK-3β部分定位于线粒体和MPP⁺线粒体和细胞溶质组分中磷酸化Tyr216-GSK-3β的差异影响。**
（A）负载100 nM MitoTracker™的TSM1和神经元原代培养物的荧光显微镜照片(红色)然后固定、渗透并染色磷酸化Tyr216-GSK-3β(绿色)和细胞核（DAPI，蓝色). 放大倍数×25。（B，C）TSM1神经元(左边)和培养的原代神经元(*正确的*)用400µM MPP处理⁺然后进行亚细胞分离，以分离线粒体和细胞溶质部分，如材料和方法中所述。通过Western blotting（B）分析两个组分的磷酸化Tyr216-GSK-3β、磷酸化Ser9-GSK-3α、总GSK-3γ、COXIV和GAPDH含量。（C）对四到八个独立实验进行了密度分析，以量化载体和氯化锂处理的TSM1的线粒体和细胞溶质细胞组分中磷酸化Tyr216-GSK-3β的含量(左边)和原代培养的神经元(*正确的*). 数据以未处理样品的百分比表示。使用Student进行统计分析t吨-测试(*对<0.05, **对<0.01, ***对<0.005与未经处理的样品）。

**图5。GSK-3β对MPP的贡献⁺-通过线粒体膜电位的改变诱导TSM1神经元死亡。**
（A）用指定浓度的MPP处理TSM1神经元⁺8h后用JC-1染色，流式细胞仪分析。（B） TSM1细胞培养24小时，然后用打乱或GSK-3β特异性siRNA（200 nM）转染。转染后两天，用盐水缓冲液或25 mM LiCl或25µM kenpaullone预处理细胞(肯普)，然后与MPP共同孵育或不共同孵育⁺（400µM）8 h。按照材料和方法中的描述，用JC-1对细胞进行染色，并准备用于流式细胞仪分析。结果表示为线粒体膜电位（Ψm）去极化的细胞百分比。（C，D）未用25mM LiCl预处理的完整原代神经元，然后与MPP+（400µM）共孵育或不与MPP+（400µM）共孵育4小时。将细胞置于激光扫描共聚焦显微镜上的台上，每10秒收集图像，持续10分钟。实验开始后一分钟，向神经元加载30 nM TMRM（箭头），记录结束前一分钟，将5µM FCCP添加到培养基中（箭头）。（C） TMRM后10分钟收集初级神经元图片(绿色)和赫斯特染料(红色)添加到培养基中。放大倍数，×63。（D）通过选择八个roi获得荧光强度图，并表示为平均值±S。D.从每个图像中的所有选定感兴趣区域导出的平均灰度值。

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