线粒体BCL-2抑制AMBRA1诱导的自噬

AMBRA1–BCL-2交互不需要BECLIN 1

AMBRA1和BECLIN 1之间的相互作用需要AMBRA1的F2片段(Fimia等人，2007年)，但不适用于其与BCL-2的绑定。这表明BECLIN 1对后一种关联是不必要的。为了证实这一假设，我们使用一种不能结合BECLIN 1的BCL-2突变株进行了联合免疫沉淀实验。这种突变体（EEE-BCL-2）在三个磷酸化位点（T69、S70和S87）同时具有谷氨酰胺取代，并模拟自噬诱导后发生的多磷酸化(Wei等人，2008年). 这阻碍了BCL-2与BECLIN 1的相互作用(图2A和B). 编码AMBRA1和人BCL-2（h-BCL-2）或EEE-BCL-2突变的载体在HEK293细胞中过度表达；然后，在正常条件下进行AMBRA1和BCL-2的联合免疫沉淀。如所示图2CAMBRA1能够结合h-BCL-2以及不能结合BECLIN 1的BCL-2突变体（EEE-BCL-2）。

在单独的窗口中打开

图2

AMBRA1和BCL-2之间的相互作用不需要BECLIN 1。(A类)BCL-2（EEE-BCL-2突变体）上三个磷酸化位点的同时谷氨酰胺取代诱导BECLIN 1/BCL-2复合物的破坏(Pattingre等人，2005年). (B类)在HEK293细胞中，BECLIN 1与hBCL-2共免疫沉淀，但与EEE-BCL-2突变不共免疫沉淀。HEK293细胞与编码FLAG–BECLIN 1、myc-h-BCL-2或EEE-BCL-2突变的载体共转染。使用抗FLAG抗体免疫沉淀蛋白质提取物。WB使用抗BECLIN 1和抗BCL-2抗体分析纯化的复合物和相应的总提取物。(C类)在HEK293细胞中，AMBRA1与hBCL-2和EEE-BCL-2突变体共同免疫沉淀。HEK293细胞与编码myc–AMBRA1、myc-h-BCL-2或EEE-BCL-2突变体的载体共转染。使用抗AMBRA1抗体免疫沉淀蛋白质提取物。WB使用抗AMBRA1和抗BCL-2抗体分析纯化的复合物和相应的总提取物。

线粒体BCL-2优先结合AMBRA1，这种相互作用在自噬诱导后被破坏

BCL-2主要存在于外线粒体和内质网膜上(日耳曼和海岸，2003年)这些亚细胞定位与BCL-2功能有关(Lithgow等人，1994年). 为了深入了解AMBRA1和BCL-2之间相互作用的功能意义，我们评估了AMBRA1是否与ER驻留者或BCL-2的线粒体池发生差异性结合。为此，将两个亚细胞定位受限的BCL-2突变体用于与AMBRA1的联合免疫沉淀实验。在第一个突变体中，BCL-2的C末端疏水序列被替换为来自修饰的ActA的等效序列，ActA特异性地结合到线粒体外膜的细胞质表面(Pister等人，1994年). 另一个突变体有一个C末端序列与细胞色素序列交换b条5（编码大鼠肝细胞色素ER特异亚型类似35氨基酸序列的DNAb条5 (Mitoma和Ito，1992年)，导致特定于ER的定位(Zhu等人，1996)). 如所示图3Amyc–AMBRA1与有丝分裂靶向BCL-2（第3通道）显著共免疫沉淀，而只有少量ER靶向BCL-2与AMBRA1（第1通道）结合。这些结果通过颠倒免疫共沉淀的顺序得到了证实(补充图S2a). 知道BCL-2和BECLIN 1之间的相互作用在正常条件下与饥饿条件下是不同的(Pattingre等人，2005年)，我们决定分析AMBRA1和mito-BCL-2在自噬诱导中的相互作用。当细胞在无氨基酸培养基（EBSS培养基）中移动4小时时，AMBRA1和mito-BCL-2之间的相互作用减少，而ER-BCL-2和myc–AMBRA1之间的结合没有观察到差异。自噬降解的泛素结合蛋白p62/A170/SQSTM1的减少(Ichimura等人，2008年)，被用作确认自噬诱导的标记(图3A，下部面板）。为了控制AMBRA1和mito-BCL-2之间的联合免疫沉淀的特异性，使用myc抗体对HEK293细胞进行阴性对照，这些细胞不过度表达myc–AMBRA1或BCL-2(补充图S2B-D). 使用雷帕霉素作为自噬诱导剂，AMBRA1和丝裂原-BCL-2之间的相互作用也可以在较低程度上被破坏(图3B). 在自噬过程中，JNK1激酶对BCL-2的磷酸化消除了BECLIN 1和BCL-2之间的结合。因此，我们还测试了抑制JNK1是否会导致AMBRA1–BCL-2结合调节。然而，如中所示图3BJNK1激酶抑制剂SP600125不会影响自噬诱导后AMBRA1从丝裂原-BCL-2的释放。接下来，我们观察到内源性AMBRA1和mito-BCL-2之间的结合。为此，我们从正常条件下生长或在EBSS中生长4小时的细胞中分离出线粒体部分。我们对线粒体组分中的AMBRA1进行免疫沉淀，我们能够在正常条件下理解与内源性BCL-2的结合。相反，这种结合在自噬诱导后被破坏(图3C). 值得注意的是，当通过密度分析进行检查时，我们可以在正常情况下观察到线粒体部分内源性AMBRA1和BECLIN 1之间的结合，这种结合在自噬诱导后增加(补充图S2E). 为了巩固这些数据，我们决定在正常或饥饿条件下生长的HEK293细胞进行亚细胞分离实验之前，先进行线粒体交联。如所示图3D当细胞不固定时，BCL-2在正常情况下可检测为26-kDa带（适当分子量），该带在自噬诱导后减少。然而，在细胞固定后，此条带无法检测到，而可检测到～170kDa的条带。170-kDa带很可能对应于至少包含内源性AMBRA1和BCL-2的复合体，从而证实了相互作用。接下来，我们着手确定这种动态相互作用是否可以通过荧光显微镜进行监测。如所示图4A如预期的那样，丝裂原-BCL-2与丝裂原追踪染色完全共定位，正常情况下myc–AMBRA1和丝裂原-BCL-2之间存在显著的共定位，而一些细胞仅显示ER-BCL-2和AMBRA1之间存在轻微的共定位（箭头所示补充图S3A、B). 我们在内源性水平上进行了相同类型的染色，以确认这种共定位（参见补充图S4). 通过统计共定位分析，我们发现AMBRA1与有丝分裂-BCL-2表现出很好的共定位第页_第页和第页_秒值分别为0.7和0.8(补充图S3C). 当细胞转移到EBSS时，AMBRA1和有丝分裂-BCL-2共定位明显减少(图4B，饥饿车道）。此外，还测定了myc–AMBRA1与有丝分裂-BCL-2或ER-BCL-2共定位的细胞百分比。如所示图4C在正常条件下，70%的细胞显示AMBRA1和mito-BCL-2之间存在共定位，而在自噬诱导后只有40%的细胞显示相同的共定位。在AMBRA1–ER-BCL-2结合的情况下未观察到这种共定位减少，我们在这两种情况下均发现约30%的共定位细胞。值得注意的是，这种同位化似乎是由于染色隔室之间的短距离“接近”，而不是重叠，如补充图S3B.

在单独的窗口中打开

图3

线粒体BCL-2优先结合AMBRA1，这种结合在自噬诱导后被破坏。(A类)用编码ER-BCL-2或mito-BCL-2和myc-AMBRA1的载体共转染HEK293细胞。细胞在正常培养基或EBSS培养基中培养4 h。使用myc抗体免疫沉淀蛋白质提取物。WB使用抗BCL-2抗体或myc抗体分析纯化的复合物和相应的总提取物。通过使用抗p62抗体控制总提取物中的自噬诱导。(B类)抑制JNK1并不调节AMBRA1–mito-BCL-2结合。HEK293细胞与编码myc–AMBRA1和mito-BCL-2的载体共转染或保留未转染作为阴性对照。用雷帕霉素处理细胞以诱导自噬或在EBSS培养基中转移，再加上JNK1激酶抑制剂4小时。然后，使用myc抗体免疫沉淀蛋白提取物。用WB、抗BCL-2和myc抗体分析纯化的复合物和相应的总提取物。(C类)HEK293细胞在正常培养基或EBSS培养基中培养4 h。然后通过离心分离线粒体部分，并使用MnSOD和GAPDH抗体对WB控制的部分质量进行检测。然后在两种条件下使用抗AMBRA1多克隆抗体或免疫前IgG作为阴性对照物沉淀内源性线粒体AMBRA1。用WB、抗BCL-2和抗AMBRA1抗体分析纯化的复合物。(D类)HEK293细胞在正常或EBSS培养基中培养4h，然后用0.5%PFA固定10min或不固定。通过离心分离线粒体组分，并使用MnSOD和GAPDH抗体对WB控制的组分质量进行检测。然后在两种条件下使用抗AMBRA1多克隆抗体或免疫前IgG作为阴性对照沉淀内源性线粒体AMBRA1。纯化的复合物用WB分析，用抗BCL-2抗体。当细胞未固定时，在26 kDa处检测到BCL-2，而该条带消失，在固定时可检测到约170 kDa的条带。

在单独的窗口中打开

图4

AMBRA1与线粒体-BCL-2和线粒体网络的动态共定位(A类，B类)HEK293细胞与编码有丝分裂-BCL-2和myc-AMBRA1的载体共转染，在正常培养基中生长(A类)或在EBSS中(B类)持续4 h，并用抗BCL-2抗体（绿色）、抗myc–AMBRA1抗体（蓝色）和Mitotracker（红色）染色。如图所示，底部面板中显示了两个或三个荧光信号的合并。比例尺，6μm。白色箭头指向强大的三重同位化区域。(C类)AMBRA1–在自噬诱导后，线粒体-BCL-2共定位降低。在正常条件下和自噬诱导后，显示AMBRA1和ER-或有丝分裂-BCL-2共定位的细胞数量。结果以显示AMBRA1与ER-或mito-BCL-2共定位的细胞百分比（±s.d.）表示。每个点值代表三个独立实验中三个重复井的平均值±标准差。通过方差分析（单因素方差分析）进行统计分析。^*P（P）与正常情况下的mito-BCL-2相比，<0.05。

AMBRA1在正常条件下部分定位于线粒体

AMBRA1是一种细胞质蛋白，在正常情况下显示漫反射信号，主要与动力蛋白轻链重叠。在自噬诱导后，一部分AMBRA1易位到细胞的核周区，更准确地说是到内质网(Di Bartolomeo等人，2010年). AMBRA1与线粒体-BCL-2的结合使我们检查AMBRA1是否与线粒体存在亚细胞共定位图5A事实上，我们发现AMBRA1与线粒体存在部分共定位第页_第页和第页_秒分别为0.61和0.70。值得注意的是，这些定量结果与AMBRA1/mito-BCL-2共定位分析获得的结果相似。

在单独的窗口中打开

图5

AMBRA1与线粒体网络部分共定位(A类)在正常培养基中生长的HeLa细胞用Mitotracker（红色）和抗AMBRA1抗体（绿色）染色。右侧面板显示了两个荧光信号的合并。比例尺，6μm。皮尔逊相关系数第页_第页和斯皮尔曼相关系数第页_秒散点图上显示。(B类)HeLa细胞全细胞和纯化线粒体的免疫金分析。15纳米颗粒标记AMBRA1蛋白（红色箭头）。比例尺，0.2μm。M、 线粒体。

为了证实我们的观察结果，我们在正常条件下生长的HeLa细胞及其纯化的线粒体上使用抗AMBRA1抗体进行了免疫金分析(图5B和补充图S5). 总之，这些结果表明，在正常条件下，AMBRA1池（相当于总蛋白的49±10%）可以定位于线粒体。值得注意的是，在自噬诱导后，AMBRA1的线粒体池似乎略有减少（参见补充图S6A). 这些结果使我们假设，线粒体-BCL-2应该在线粒体上锚定/抑制AMBRA1，以阻止其参与BECLIN 1依赖性自噬程序。因此，我们决定评估丝裂原-BCL-2对AMBRA1诱导的自噬的影响。我们在存在对照质粒（pCDNA3）或有丝分裂-BCL-2或WT-BCL-2的情况下过度表达AMBRA1。LC3蛋白转化被用作自噬诱导的标记(水岛等人，2004年，2010). 如所示图6，丝裂原-BCL-2的过度表达足以显著减少AMBRA1诱导的自噬。然而，已知能结合BECLIN 1的AMBRA1的F2片段(Fimia等人，2007年)，但不是BCL-2（参见图1A和B)，能够逃避丝裂原-BCL-2抑制，但不能逃避ER-BCL-2效应。最后，为了评估自噬通量（自噬体按速率与非额定值)，我们用溶酶体抑制剂氯喹（20μM）处理细胞1小时，如图所示图6B，氯喹处理导致所有病例中LC3-II条带的强度增加。总之，这些结果表明，在正常条件下，BCL-2在线粒体结合AMBRA1，以抑制其在自噬体形成过程中的自噬前功能。

在单独的窗口中打开

图6

AMBRA1自噬前活性被丝裂原-BCL-2抑制。(A类)将HEK293细胞与对照载体pcDNA3、编码Mito、ER和WT-BCL-2的载体以及编码myc–AMBRA1或AMBRA1-F2的载体联合转染，无论是否带有编码Mito、ER或WT-BCL-的载体。作为额外的阳性自噬对照，24小时未转染细胞在EBSS培养基中转移（饥饿）。然后使用抗LC3蛋白对总提取物进行western blot（WB）分析，以分析自噬诱导、抗AMBRA1、抗BCL-2和抗微管蛋白抗体，以控制蛋白表达。使用ImageQuant软件通过密度分析量化LC3-II/LC3-I比率。结果表示为LC3-II/LC3-I比率作为对照（单独的pcDNA3）的百分比。每个点值代表三个独立实验的平均值±标准差。通过方差分析（单因素方差分析）进行统计分析。^*P（P）<0.05与AMBRA1+pcDNA3相比。^#P（P）与AMBRA1 F2+pcDNA3相比<0.05。(B类)HEK293细胞与控制载体pcDNA3和编码myc–AMBRA1的载体联合转染，无论是否有编码线粒体、ER或WT-BCL-2的载体。转染后24小时，用氯喹A或载体对照处理细胞2小时。然后用抗LC3抗体通过western blot（WB）分析总提取物，以分析自噬诱导、抗AMBRA1、抗BCL-2和抗微管蛋白抗体，以控制蛋白表达。使用ImageQuant软件通过密度分析量化LC3-II/LC3-I比率。结果表示为LC3-II/LC3-I比率。每个点值代表三个独立实验的平均值±标准差。

AMBRA1与BCL-2竞争绑定BECLIN 1

已知BCL-2在其BH3域上结合BECLIN 1。因此，为了更好地了解AMBRA1和BCL-2如何差异调节自噬，我们开始在与AMBRA1的联合免疫沉淀实验中使用不同的BECLIN 1突变体来确定AMBRA1在BECLIN I上的结合域。在第一系列实验中，我们发现三个截短的BECLIN 1突变体（aa 1–353、aa 141–353和aa 141-450）仍然能够与AMBRA1相互作用(图7A和B). 我们通过使用两个BECLIN 1缺失突变体改进了我们的搜索：BECLN 1ΔBcl-2 BD（结合域）（缺少aa 88–150）和BECLIN 2ΔECD（缺少aa244–337）。如所示图7CAMBRA1仍能与BECLIN 1ΔECD共免疫沉淀，但不能与BECLN 1ΔBcl-2 BD突变体共免疫沉淀。因此，BECLIN 1结合域的一部分与BCL-2结合是其与AMBRA1结合所必需的。通过更详细地研究BECLIN 1的氨基酸序列，可以推断出氨基酸141–150对AMBRA1–BECLIN 1结合至关重要。我们可以得出这样的结论，因为Δ141–353突变体与AMBRA1结合，而Δ88–150突变体不结合。接下来，我们分析了AMBRA1与BECLIN 1、BECLIN 1的两个BH3突变体之间的结合^125安和BECLIN 1^123A层分别与BCL-2和BCL-X相互作用或不相互作用_L（左）(Pattingre等人，2005年；Maiuri等人，2007年). 事实上，BECLIN 1^125安模拟野生型蛋白质，而BECLIN 1^123A层拥有一个非功能性BH3结构域，这是一种已知能诱导强烈自噬的突变体。图7D表明AMBRA1可以结合这两个BECLIN 1突变体，表明BCL-2和BCL-X的BH3结合位点完整_L（左）绑定到AMBRA1时不需要。尽管AMBRA1在BECLIN 1上不需要功能性BH3域，但它在一个与绑定BCL-2类似的区域中绑定BECLIN 2。

在单独的窗口中打开

图7

AMBRA1与BCL-2竞争以结合BECLIN 1。(A类)BECLIN 1突变体图解。指出了BECLIN 1的卷曲卷曲结构域（CCD）和进化保守结构域（ECD）。(B类)AMBRA1与BECLIN 1的所有截短突变体结合。显示了AMBRA1和BECLIN 1的不同突变体在HEK293细胞中的共免疫沉淀。HEK293细胞与编码myc–AMBRA1、FLAG–BECLIN 1 1–353、FLAG-BECLIN 11 141–353或FLAG–BECLIN 1 141–459的载体共同转染。使用抗FLAG抗体免疫沉淀蛋白质提取物。使用抗AMBRA1和抗BECLIN 1抗体，通过WB分析纯化的复合物和相应的总提取物。星号表示与BECLIN 1片段相对应的蛋白质分子量。(C类)AMBRA1不能与Beclin 1ΔBcl-2突变体共同免疫沉淀。用编码myc–AMBRA1和BECLIN 1ΔBcl-2 BD或BECLIN 2ΔECD的载体共同转染HEK293细胞。使用抗BECLIN 1抗体免疫沉淀蛋白质提取物。使用抗AMBRA1和抗BECLIN 1抗体，通过WB分析纯化的复合物和相应的总提取物。(D类)BCL-2的完整BH3结合位点不需要与AMBRA1结合。用编码myc-AMBRA1和BECLIN 1的载体共同转染HEK293细胞^125安和BECLIN 1^123A层分别与BCL-2和BCL-X相互作用或不相互作用_L（左）使用myc抗体（myc–AMBRA1）免疫沉淀蛋白质提取物。使用抗myc和抗BECLIN 1抗体，通过WB分析纯化的复合物和相应的总提取物。(E类)当AMBRA1过度表达时，BECLIN 1和有丝分裂或ER-BCL-2结合降低。用FLAG–BECLIN 1、mito-和ER-BCL-2转染HEK293细胞，并增加myc–AMBRA1cDNA。使用抗FLAG抗体免疫沉淀蛋白质提取物。用抗BECLIN 1、抗BCL-2和抗AMBRA1抗体对纯化的配合物和相应的总提取物进行WB分析。在上部面板中，与BECLIN 1共免疫沉淀的AMBRA1对应的条带显示的暴露程度高于其他条带（mito-BCL-2和FLAG–BECLIN 2），以便更好地进行可视化。

为了证实AMBRA1和BCL-2可能竞争结合BECLIN 1的假说，我们用mito/ER-BCL-2和BECLIN 2进行了联合免疫沉淀实验，并增加了AMBRA1的数量(图7E). 我们的结果表明，随着AMBRA1水平的增加，线粒体和ER-BCL-2/BECLIN 1相互作用都减少。这表明，在诱导自噬后，AMBRA1可以与mito/ER-BCL-2竞争以结合BECLIN 1。值得注意的是，当我们使用BCL-2作为AMBRA1和BECLIN 1之间结合的竞争物进行反向实验时，也可以检测到这种竞争（参见补充图S7).

自噬诱导后AMBRA1和mito-BCL-2之间的结合被破坏

BCL-2主要在细胞死亡的背景下进行研究；然而，人们也知道它在不同的细胞过程中发挥其他功能，例如细胞周期进展、葡萄糖稳态、p53的转录抑制和自噬(里德，1998年；Danial和Korsmeyer，2004年；Pattingre等人，2005年；Maiuri等人，2007年). 由于BCL-2的半衰期较长，因此在表达水平上存在细微的调节(里德，1996年). 然而，众所周知，BCL-2的翻译后修饰，尤其是磷酸化，在调节其活性方面起着关键作用(Blagosklonny，2001年；Wei等人，2008年；Pattingre等人，2009年). 最近研究表明，JNK1在T69、S70和S87位点的BCL-2磷酸化抑制其抗自噬功能(Pattingre等人，2009年). 自噬诱导后，AMBRA1–mito-BCL-2复合物的破坏是如何发生的？我们有证据表明，JNK1对BCL-2的磷酸化并不调节BCL-2与AMBRA1的相互作用。事实上，我们发现AMBRA1能够与EEE-BCL-2共同免疫沉淀，EEE-BCL-2是一种突变体，在自噬诱导过程中磷酸化模拟T69、S70和S87位点BCL-2的磷酸化(Wei等人，2008年). 与这一观察结果一致，AMBRA1和mito-BCL-2之间的相互作用在诱导自噬和用JNK1激酶抑制剂治疗后保持不变。

另一个假设是，AMBRA1和有丝分裂-BCL-2之间相互作用的中断受AMBRA1转录后修饰的调控。AMBRA1可以被丝氨酸/苏氨酸激酶ULK1直接磷酸化，事实上，当进行2D-gel电泳时，它显示出多个斑点，对应于许多修饰(Di Bartolomeo等人，2010年). 与这一证据相一致，在细胞凋亡和自噬过程中，mito-AMBRA1可能会受到类似的修饰。

关于线粒体AMBRA1功能的另一个假设来自于Hailey等人（2010年）其中，线粒体可以作为哺乳动物细胞饥饿时自噬体膜的来源。虽然线粒体的分离很可能受到ER的污染，但根据这些结果，我们可以推测AMBRA1存在于线粒体中，参与了线粒体自噬体.

事实上，我们的结果强调了AMBRA1的亚细胞定位对其功能的重要作用。值得注意的是，在自噬诱导后，我们发现线粒体部分AMBRA1和BECLIN 1之间的结合增加。鉴于我们最近已经证明AMBRA1和BECLIN 1组成一个复合体，在自噬时从动力蛋白运动复合体一起易位到内质网(Di Bartolomeo等人，2010年)这些结果，结合Hailey的最新发现等引导我们提出一种模型，在正常情况下，AMBRA1（以下简称为mito-AMBRA1）池被BCL-2停靠在线粒体上：在自噬诱导后，mito-AMBRE1从mito-BCL-2中分离，并增加其与部分有丝分裂受体BECLIN 1的结合；因此，Mito-AMBRA1具有增强BECLIN 1依赖性自噬的潜力（参见补充图S8线粒体模型）。正如我们观察到的那样，AMBRA1与线粒体共定位减少，以应对自噬（参见补充图S6A)伴随着微粒体组分中AMBRA1和BECLIN 1之间的结合增加，而BCL-2和BECLIN 1之间的相互结合减少（参见补充图S6B)，我们不能排除AMBRA1线粒体池的一部分易位到内质网以结合ER-repident BECLIN 1并进一步增强自噬程序（参见补充图S8，欧米伽马模型）。尽管AMBRA1尚未被证明与BECLIN 1处于稳定的复合物中(Zhong等人，2009年；Funderburk等人，2010年)，我们目前的结果表明，AMBRA1和BECLIN 1可以形成“短暂的”不同复合物，可以调节自噬程序。

试剂和质粒构建物

在pLPCX载体（Clontech；Fimia等人，2007年). 含有野生型h-BCL-2-myc、EEE-BCL-2突变体、ER-BCL-2、Mito-BCL-2和所有BECLIN 1突变体cDNA的质粒存在于Beth Levine实验室（德克萨斯州达拉斯霍华德·休斯医学研究所）。雷帕霉素和STS购自Sigma-Aldrich。Q-VD-ODH半胱天冬酶抑制剂来自Kamyia Biomedical Company。

免疫沉淀

细胞在HEMG缓冲液（25 mM HEPES（pH 8.0）、100 mM NaCl、0.5%Nonide P-40、0.1 mM EDTA、10%甘油）加蛋白酶和磷酸酶抑制剂或CHAPS缓冲液（40 mM HEPE（pH 7.4）、150 mM NaC1、2 mM EDTA,0.3%CHAPS）中溶解，以检测内源性AMBRA1–BCL-2相互作用。在4°C下以13000离心10分钟后克，将等量的蛋白质与抗myc、抗FLAG、抗Beclin 1、抗BCL-2或抗AMBRA1抗体（2μg）在4°C孵育过夜，然后与20μl蛋白质A/g sepharose珠孵育60分钟（Amersham Bioscience）。通过离心收集珠子，并用HEMG缓冲液洗涤四次。用30μl SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液洗脱与珠结合的蛋白质，并加热至95°C 10分钟。

免疫细胞化学

细胞在PBS中清洗，并用4%多聚甲醛在PBS内固定15分钟。为了染色线粒体，在固定前，在100 nM下对细胞应用有丝分裂跟踪器15分钟。在用0.2%Triton X-100在PBS中渗透5分钟后，细胞在PBS的2%马血清中被阻断，并在RT下与初级抗体孵育1小时。我们使用了针对AMBRA1、BCL-2和myc Tag的抗体。然后在封闭缓冲液中清洗细胞，并用标记的抗鼠（Alexa Fluor-488或Alexa Fluor555，Molecular Probes，Eugene，or）或抗兔（FITC或Cy3，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）二级抗体孵育1 h。细胞核用1μg/ml DAPI染色，并在配有×63（NA 1.4）油浸物镜的徕卡TCS SP5共焦显微镜下进行检查（伊利诺伊州迪尔菲尔德）。我们使用“徕卡共焦”软件进行分析。在AMBRA1和mito-BCL-2或ER-BCL-2分析的情况下，我们使用Olympus IX70显微镜结合SoftWorx软件。在标准条件下应用反卷积（8个循环）。使用ImageJ分析程序，使用PSC共定位插件进行图像分析(French等人，2008年)计算共定位。每种情况下至少分析20个细胞。结果以Pearson相关系数表示，该系数表示分析图像的绿色和红色通道信号强度的线性关系。

Förster共振能量转移

对于标准受体光漂白FRET显微镜，HEK293细胞接种在涂层玻璃盖玻片上，并与编码AMBRA1–mCherry的载体和编码BCL-2–GFP的载体共同转染。转染后24小时，用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，三次洗涤后，用1μg/ml DAPI染色细胞核20分钟，然后放置在载玻片上并包埋在安装介质中，如上所述。使用所实现的FRET受体光漂白向导在共聚焦显微镜（TCS SP5，Leica）上进行FRET研究。采集设置如下：物镜Plan-Apochromat×63/1.4 NA油浸，针孔2 Airy单位，图像大小512×512。用氩激光在488 nm（供体通道）激发BCL-2–GFP，用氦氖激光在543 nm（受体通道）激发mCherry–AMBRA1，连续记录漂白前后的图像。在采集过程中使用低激光强度以避免漂白效应，通过仅显示供体通道来选择细胞，以防止受体过早部分漂白。受体在543nm激光线上用高强度（100%）功率漂白10次。在中试试验中，发现该迭代时间对mCherry–AMBRA1漂白有效。漂白前后供体值（效率、，E类)使用公式计算E类=（供体后−供体前）×100/供体后，以百分比表示；还生成了显示FRET效率值的伪彩色图像。我们分析了三个独立实验中每个实验的10个细胞，其中细胞保持在基本条件下，没有饥饿。

微粒体部分的分离

将HEK293细胞置于10个10-cm培养皿中，并与编码FLAG–Beclin 1和myc–AMBRA1的载体共同转染。然后在EBSS培养基中移动五个培养皿4小时，其他五个培养基在正常培养基中生长。用5 ml 0.137 M NaCl/2.7 mM KCl/8 mM Na溶液清洗细胞两次₂高性能操作₄/1.5毫兆赫₂人事军官₄（PBS），在5 mM EDTA的PBS溶液中收集，并用5 ml PBS洗涤。细胞在0°C下在2 ml 10 mM Tris–HCl的低渗溶液中膨胀10 min，pH 7.5/0.5 mM MgCl₂，然后以1 mM添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒。在玻璃Dounce均质器中以30次冲程均质细胞，并将匀浆稀释在0.5 M蔗糖/6 mM 2-巯基乙醇/40μM CaCl的等体积溶液中₂/300 mM KCl/10 mM Tris–HCl，pH 7.5。悬浮液在10000下离心克将细胞核和线粒体颗粒化20分钟。上清液在0.6 M KCl下制备。悬浮液在10万下离心克沉淀微粒体部分60分钟。将颗粒悬浮在含有0.25 M蔗糖、0.15 M KCl、3 mM 2-巯基乙醇、20μM CaCl的溶液中₂，10 mM Tris–HCl（pH 7.5），并在100 000下再次离心克将蛋白质颗粒悬浮在同一溶液中60分钟(Maruyama和MacLennan，1988年).

透射电镜和免疫金染色

通过标准差速离心从HeLa细胞中分离出线粒体，并将其悬浮在分离缓冲液中（0.2 M蔗糖、10 mM Tris-MOPS（pH 7.4）、0.1 mM EGTA-Tris、0.1%脱脂牛血清白蛋白（BSA））。然后将其固定在2%新解聚的多聚甲醛和0.2%戊二醛中的0.1 M二羧酸缓冲液（pH 7.4）中，在4°C下保持2 h。样品在部分脱水的缓冲液中漂洗，并嵌入Epon树脂（Fluka）中，切片并收集在未涂覆的镍网格上。超薄切片用于免疫金技术。网格与10%正常山羊血清在含有1%BSA和0.13%NaN3（培养基A）的10 mM PBS中预孵育15分钟；然后将切片与一级抗体、兔抗AMBRA1多克隆抗体（ProSci Inc.）在介质A中以1:50稀释培养，在4°C下培养过夜。在含有0.01%吐温-20（Merck）的培养基中冲洗后，在室温下用1:50稀释在培养基a中的一级抗体小鼠抗BCL-2（Santa Cruz）进行第二次孵育，孵育时间为2h。在室温下在培养基a中孵育15分钟后，切片在室温下在山羊抗兔IgG与15nm胶体金（英国生物细胞国际组织）和山羊抗鼠IgG结合5nm胶体金的溶液中培养1h，两者均在含有0.01%鱼胶的介质a中稀释1:30。最后，将格栅在蒸馏水中彻底冲洗，与2%醋酸铀酰水溶液进行20分钟的对比，并与雷诺溶液（3.5%柠檬酸三钠，2.6%硝酸铅，福禄卡）进行10分钟的对比。然后在Technai 20（荷兰埃因霍温FEI公司）电子显微镜上拍照。

这项研究得到了意大利癌症协会（AIRC）、Telethon基金会、意大利卫生部和意大利大学与研究部的部分支持。Beth Levine实验室部分由国家卫生研究所（NIH ROI CA109618）支持。弗拉维·斯特拉帕佐恩（Flavie Strappazzon）是玛丽·居里（Marie Curie）博士后资助“追踪”ITN的接受者。Silvia Campello获得了Fp-pEopleE-iEF-2008赠款（赠款协议235595）的支持。我们感谢Palma Mattioli博士的共焦显微镜分析，感谢Martin W Bennett和Magdalena Acuna Villa出色的秘书和编辑工作。