摘要
III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3KC3）对自噬体的生物发生至关重要。长期以来，人们推测自噬体膜成核，但这种成核活性的生化机制仍未解决。我们最近确定Barkor/Atg14（L）为PI3KC3对自噬体膜的靶向因子。在这里，我们表明我们已经确定了Barkor/Atg14（L）区域的特征，该区域是自噬体靶向所必需的，并在Barkor的羧基末端鉴定了BATS域[Barkor/Attg14（L）自噬体靶向序列]。生物信息学和突变分析表明，BATS结构域通过内源性两亲性α螺旋的疏水表面与自噬体膜结合。BATS punta以应力诱导的方式与Atg16和LC3重叠，部分与DFCP1重叠。外源性表达的BATS聚集在高度弯曲的小管上，可能代表中间自噬结构。Barkor/Atg14（L）的PI3KC3招募和自噬刺激需要BATS域。此外，我们的生化分析表明，BATS结构域直接与膜结合，有利于由磷脂酰肌醇3-磷酸[PtdIns（3）P]和磷脂酰肌糖4,5-二磷酸[PtdIns（4,5）P2]组成的膜。通过优先结合与PtdIns（3）P（而非PtdIns（4,5）P2）结合的弯曲膜，BATS域能够感应膜的曲率。因此，我们提出了一种新的PI3KC3自噬体膜成核模型，其自噬小体特异性接合器Barkor通过BATS结构域在高度弯曲的富含PtdIns（3）P的自噬膜上聚集，以感知和维持膜的弯曲。
关键词：omegasome，吞噬体，溶酶体，内吞，膜运输
自噬的特点是形成称为自噬体的双膜小泡，吞噬细胞质、细胞器、蛋白质聚集体和微生物，并将这些成分传递到溶酶体进行降解(1). 自噬功能障碍与多种人类疾病有关，包括癌症、神经退行性疾病、糖尿病和传染病(2，三). 从酵母到人类，自噬途径高度保守；至少已经鉴定出34种自噬相关蛋白(4–7). 在这些自噬蛋白中，由Vps34、p150/Vps15和Beclin 1/Atg6组成的III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3KC3）复合体在自噬体形成中具有进化保守作用(8). 长期以来，人们推测PI3KC3使起始的自噬体膜（也称为吞噬细胞或隔离膜）成核(9). 然而，支持PI3KC3成核活性的直接生化证据仍然缺失。
理解PI3KC3在自噬体生物发生中的功能的一个主要障碍是这种脂质激酶在多种膜运输途径中的多效性(8，9). 通过产生磷脂酰肌醇3-磷酸[PtdIns（3）P]（一种可能触发信号通路级联的事件），PI3KC3需要通过组装不同的蛋白质复合物进行自噬和内吞(10–16). 最近对PI3KC3的自噬特异性适配器Barkor/Atg14（L）的鉴定为其在自噬体膜上的特殊作用铺平了道路(10–15). Barkor/Atg14（L）主要定位于起始自噬体膜，与早期自噬体标记物Atg16和omegasome标记物DFCP1共定位证明(17). ω体是起源于内质网（ER）的自噬体的潜在前体(18). N-末端半胱氨酸将靶向Barkor/Atg14（L）重复到ER，这种分布对其在自噬激活中的功能至关重要(17). 然而，Barkor/Atg14（L）的ER靶向既不是由应激诱导的，也不是由显性阴性Ulk1/Atg1突变体抑制的(17). 应激诱导Barkor/Atg14（L）在自噬膜上积累的生化机制尚不清楚。
一般来说，膜相关蛋白不仅是脂类和蛋白质之间相互作用的桥梁；它们还参与生成、传感和稳定膜曲率的局部区域。已知许多蛋白质或蛋白质复合物对膜变形至关重要，包括蛋白质外壳复合物（网格蛋白、COPI和COPII）或含有Bin-Anphiphysin-Rvs（BAR）结构域的蛋白质(19–26). 这些调节膜结构的蛋白质通常通过将两亲性α螺旋的疏水小片插入膜小叶或将膜表面安装到固有弯曲的蛋白质支架上，与两亲性阿尔法螺旋结合。除了疏水性相互作用外，膜相关蛋白还经常与脂类头部基团结合(26). 磷酰肌醇（PtdIns）特别重要，因为其头部组易于修饰(27). 例如，PtdIns（4,5）P2对氯氰菊酯包被囊泡的萌发和液泡的融合很重要(28–31)而PtdIns（3）P是囊泡内陷进入晚期内体和自噬体生物发生所必需的(8，9，13，32).
Barkor/Atg14（L）功能对自噬体的形成具有高度特异性，因为它位于吞噬体上(10–14). 在本研究中，我们通过缺失突变研究了Barkor/Atg14（L）的自噬体靶向性。我们在Barkor/Atg14（L）中发现了一个先前未标记的Barkor/Attg14（R）自噬体靶向序列（BATS）域，该域专门识别早期自噬结构。BATS域是Beclin 1招募和自噬激活所必需的。在这个域中，两亲性α-螺旋的疏水片直接与膜相互作用。此外，我们发现BATS以PtdIns（3）P依赖的方式优先结合到更高弯曲的膜上。因此，我们提出了通过Barkor/Atg14（L）的自噬体结合和膜曲率传感实现PI3KC3自噬小体膜成核的生化机制。
结果
Barkor/Atg14（L）自噬体靶向序列（BATS）的鉴定。
Barkor/Atg14（L）最近被鉴定为PI3KC3的化学计量亚单位(10–12，14)特异性定位于启动自噬体并将PI3KC3靶向自噬体内(10). 据报道，Barkor/Atg14（L）的N-末端半胱氨酸重复序列对内质网定位和自噬功能至关重要(16). 然而，Barkor/Atg14（L）ER膜结合既不是由饥饿诱导的，也不是由Ulk1显性阴性突变体阻断的(16)表明Barkor/Atg14（L）存在另一种应力诱导的膜结合机制。我们进行了深入的缺失突变分析，以寻找自噬体靶向所需的蛋白质序列。为了更好地显示自噬空泡，氯喹（CQ）是一种通过提高内切体/溶酶体的pH值来阻止自噬流动的药物(33)，用于治疗U2稳定表达Myc-tagged LC3的OS细胞。在这些细胞中，我们共表达了Barkor/Atg14（L）的序列缺失突变体，这些突变体标记有人源化肾形肾小球绿色荧光蛋白（hrGFP），并在CQ处理后测试了它们与LC3的共定位(A类和图S1). 通过这种方法，我们将自噬体膜结合域映射到Barkor/Atg14（L）的C末端。我们发现Barkor的最后80个氨基酸C末端足以作为自噬体靶向( A类和B类和图S1). 因此，我们确定Barkor/Atg14（L）C末端的最后80个氨基酸定义了自噬体结合所需的最小区域，并将该区域命名为Barkor/Attg14（R）自噬体靶向序列的BATS。BATS斑点不仅在CQ处理后积累，而且在雷帕霉素和饥饿处理后也能强烈诱导(B类和图S2). 为了巩固Barkor/Atg14（L）的羧基末端在自噬体靶向中的需求，我们从Barkor的C末端产生缺失不同长度氨基酸的突变体。从全长Barkor/Atg14（L）中删除最后10个氨基酸足以消除细胞溶质点并与LC3共定位( A类和B类). 这证明了这些氨基酸在自噬体结合中的重要作用。
识别自噬体靶向和自噬激活所需的BATS结构域。(A类). Barkor缺失突变体的示意图。所有突变体都用hrGFP和FLAG标记。自噬体定位被定义为CQ处理后与LC3重叠的细胞溶质点。(B类). 用hrGFP标记的各种Barkor/Atg14（L）片段转染稳定表达Myc-LC3的细胞。用200μM CQ处理细胞2 h，并用LC3抗c-Myc抗体和Barkor/Atg14（L）突变体的绿色荧光染色。(C). U型2过度表达全长Barkor、BarkorΔ10aa和U的OS细胞2使用透射电子显微镜观察OS亲代细胞。AV用黑色箭头标记。比例尺，2μm。(D类). 计算每个横截面的AVs（对照组，3.45±0.35；Barkor/Atg14（L）Δ10aa，3.5±0.32；Barkor/Atg14（L）重量：12.6±0.9）。(E类). 在中描述的细胞中检测到LC3和微管蛋白C; 用50 nM Bafilomycin处理2小时以阻止溶酶体降解。
为了测试Barkor/Atg14（L）膜结合对其自噬功能是否必要，我们在U2OS细胞。该突变体只缺少自噬体靶向所需的C末端的最后10个氨基酸；它仍然能够与Beclin 1进行交互。我们推测，如果Barkor/Atg14（L）膜结合是自噬所必需的，BarkorΔ10aa突变体可能无法像野生型Barkor那样刺激自噬。电子显微镜可以直接分析自噬体的形成。自噬空泡（AVs）可以通过高分辨率透射电子显微镜捕获。Barkor/Atg14（L）的过度表达导致U中AV的数量和大小增加2OS细胞(C) (10). 然而，在U2OS细胞过度表达Barkor/Atg14（L）Δ10aa突变体，Barkor/Attg14（L）对自噬体形成的促进作用被取消( C和D类). 在Barkor/Atg14（L）野生型和Δ10aa突变表达细胞中也测定了自噬通量。与表达Barkor/Atg14（L）野生型细胞的细胞相比，表达Δ10aa突变的正常细胞或Bafilomycin处理的细胞中LC3-II转化受到抑制(E类). 这些综合结果表明，Barkor/Atg14（L）自噬小体通过其羧基末端结合是自噬体形成所必需的。
BATS通过两亲性α螺旋的疏水侧与自噬体膜结合。
Barkor/Atg14（L）C末端的最后80个氨基酸定义了自噬体结合所需的最小区域(A类). 通过生物信息学分析，我们确定了BATS的特定特征，这些特征有助于其作为靶向序列发挥作用。BATS结构域在脊椎动物中高度保守(A类). 二级结构分析表明，BATS的19个氨基酸形成了一个经典的两亲性α螺旋轮，其疏水和亲水残基排列在螺旋的相反侧(B类). 这种布置可以允许BATS结构域的疏水性贴片浅嵌入脂质双层中。为了研究BATS两亲性α-螺旋和脂质双层之间的疏水相互作用，我们用精氨酸（R）残基替换了三个疏水残基，色氨酸（W）、苯丙氨酸（F）和酪氨酸（Y）。正如所料，WFYm突变体的表达缺乏BATS点(C). 或者，极性侧两个亲水性残基（K486A，R492A）的突变对BATS点状点的形成没有影响(C)这表明BATS和脂质双层之间的疏水相互作用对膜结合至关重要。
BATS的两亲性α螺旋负责自噬体膜结合。(A类). 对脊椎动物Barkor/Atg14（L）同源物的最后80个氨基酸（BATS）进行了比对，并用方框预测和标注了高度保守的膜相互作用螺旋。(B类). 预测的膜相互作用螺旋呈现为两亲性螺旋轮。疏水残基为黄色，亲水残基为蓝色，带正电残基为绿色。三个疏水残基在C用箭头标记。(C). 稳定表达Myc-LC3的细胞与不同的BATS突变体共表达，这些突变体被hrGFP标记（BATS K486A、R492A和BATS WFYm-BATS突变型W484R、F485R、Y488R）。用200μM CQ处理细胞2h，并用LC3的c-Myc抗体和BATS突变体的绿色荧光染色。(D类). U型2OS细胞与Myc-Beclin 1和不同的Barkor/Atg14（L）突变体共表达，用hrGFP标记，并用200μM CQ处理(E类). 稳定表达Myc-LC3的细胞与GFP-Beclin 1或GFP-Beclin 1-BATS共表达，并用200μM CQ处理2 h。
我们之前已经证明，Barkor/Atg14（L）招募Beclin 1到自噬体需要其卷曲-线圈结构域（CCD）(10). 如果BATS足以用于膜靶向，我们预计与BATS相连的CCD可能足以将Beclin 1引导至自噬体。为了验证这一假设，我们制作了一种仅由CCD和BATS融合而成的嵌合蛋白。这个同源的Barkor/Atg14（L）足以定位于LC3修饰的细胞溶质点(图S3)并招募Beclin 1进入自噬体(D类). 为了通过CCD绕过Barkor–Beclin 1相互作用，我们生成了另一个由Beclin l直接融合到BATS（Beclin 1-BATS）的嵌合蛋白。我们假设仅BATS就足以引导Beclin 1进入自噬体。我们表达了Beclin 1–BATS融合结构并确定了其亚细胞定位。Beclin 1–BATS，但不只是Beclin一个，定位于自噬体并与LC3重叠(E类)表明BATS足以补充Beclin 1到自噬体。此外，雷帕霉素和CQ处理可显著诱导Beclin 1–BATS以及与LC3重叠的BATS斑点(图S2). 因此，BATS足以以应激诱导的方式将Barkor/Atg14（L）和Beclin 1引导至自噬体并触发自噬激活。
BATS定位于高度弯曲的早期自噬结构。
据报道，Barkor/ATG14L定位于ER，与DFCP1阳性的omegasomes重叠或相邻，后者是自噬体形成的平台(16，34). 我们推测，应激诱导的BATS斑点可能与早期自噬体标记物重叠。我们检查了BATS与DFCP1和Atg16的共定位。BATS部分与DFCP1共定位，DFCP1是ER相关的ω染色体标记(17)饥饿或CQ治疗后(A类). 值得注意的是，BATS斑点菌在饥饿或雷帕霉素处理后与吞噬细胞或隔离膜标记物Atg16显著共定位(B类). 这些数据表明BATS位于早期自噬结构上。
BATS定位于高度弯曲的早期自噬结构。(A类). U型2将hrGFP-BATS与Myc-DFCP1一起转染OS细胞。转染后48小时，用EBSS处理细胞1小时，或用200μM CQ处理细胞2小时；Myc-DFCP1用罗丹明红抗体染色，激光共聚焦显微镜检测。(B类)单位2用hrGFP-BATS和Myc-Atg16转染OS细胞。转染后48小时，用EBSS处理细胞1小时或用2μM雷帕霉素处理细胞4小时；用罗丹明红抗体对Myc-Atg16进行染色，并用激光共聚焦显微镜进行检测。(C和D类)U型2表达GFP标记BATS的OS细胞（转染后2天）用EBSS培养基处理，并在荧光显微镜下观察。添加EBSS培养基后立即拍摄图像(C)或在30分钟的时间点(D类)（另请参见电影S1). 箭头标记管子。(E类). 饥饿后，沿着时间进程（0–30分钟）的箭头标记出一个具有代表性的小管。(F类). U型2加入EBSS培养基后捕获表达GFP-BATS和番茄-LC3的OS细胞；每2秒捕获一次两个通道。展示了两幅具有代表性的图像（另请参见电影S2). 箭头标记小管。
自噬体经历动态变化，从一个新月形小室发展到杯状膜，最后发展到封闭的环状结构(35)，可以用延时视频显微镜拍摄。我们观察到BATS与Atg16和LC3在稳态下有明显重叠，这促使我们研究饥饿时BATS与自噬膜的动态相互作用。GFP标记的BATS在U2并在饥饿后的延时视频显微镜分析中观察到。将培养在富营养培养基中的表达GFP-BATS的细胞切换到厄尔平衡盐溶液（EBSS）培养基中，在荧光显微镜下进行动态观察。BATS信号最初表现为胞浆点状。饥饿时，BATS在许多生长的细管中富集。这些BATS阳性小管通常高度弯曲，但弯曲度相当不直（在凹面和凸面之间切换）( C–E类和电影S1). 在表达GFP-BATS和番茄-LC3的细胞中拍摄的时间推移视频证明，BATS小管也呈LC3阳性(F类和电影S2)表明BATS修饰高度弯曲的自噬结构。BATS小管的半衰期（约30分钟）远长于形成的自噬体（约5-10分钟）(35). 这一观察以及曲率不稳定的小管表明，BATS可能参与膜曲率传感和稳定，这一过程可能需要额外的因素（PtdIns的产生等）。
为了探讨这些BATS小管与ER之间的关系，我们在延时实验中观察了饥饿时GFP-BATS和DsRed2-ER信号。大多数BATS点状细胞与内质网共定位。我们发现BATS小管是从内质网相关的BATS点延伸而来的(电影S3)，表明BATS小管可能代表了从omegasomes发芽的新形成的高度弯曲的膜。
直接结合PtdIns（3）P富集膜的重组BATS结构域。
BATS结构域的自噬体膜结合使我们推测BATS可以直接结合脂质体。重组GST标记的BATS野生型和WFYm突变体从大肠杆菌，并从杆状病毒感染的昆虫细胞中表达和纯化全长His-tagged Barkor/Atg14（L）(A类). 重组内白素1和PLCδ的PH结构域也从大肠杆菌在共沉淀分析中，这些蛋白质与从脑脂提取物的Folch组分制备的脂质体孵育(B类). BATS域本身不会沉淀。相反，BATS域与脂质体共沉淀(B类)表明BATS直接与脂质双层结合。相反，疏水残基改为亲水氨基酸的BATS WFYm突变体不能与脂质体沉淀(B类). 从昆虫细胞纯化的全长Barkor/Atg14（L）也能与脂质体结合(B类). 由于Barkor/Atg14（L）不稳定，我们未能从昆虫细胞中纯化出C末端10氨基酸缺失的Barkor/Attg14（L）。然而，我们推测沿着Barkor/Atg14（L）可能存在多个膜结合域。例如，其N末端能够与ER膜结合(16). 作为阳性对照，内白素1和PLCδ的pH域与脂质体共沉积(B类). 这些数据表明，BATS脂质体结合是由两亲性α螺旋中的疏水残基介导的。
BATS结构域的膜结合活性。(A类). GST标记的野生型BATS、BATS WFYm突变体、嗜内素1和PLCδ的PH结构域的构建物从大肠杆菌从杆状病毒感染的昆虫细胞中表达并纯化全长His-tagged Barkor/Atg14（L）。(B类). 中描述的纯化重组蛋白A类在共沉淀试验中测试其脂质体结合活性。本试验使用了从牛脑脑提取物的Folch组分I中生成的脂质体。S表示上清液，P表示颗粒。结合效率计算为结合蛋白（P）与输入（P+S）。(C). 重组野生型BATS、BATS WFYm突变体和PLCδ的PH域与不同形式的磷脂酰肌醇结合的脂质体孵育，并在共沉淀试验中测试其脂质体结合。S表示上清液，P表示颗粒。(D类). 表达GFP-BATS和Myc-LC3的细胞未经处理，仅用雷帕霉素或与3-甲基腺嘌呤（3-MA）联合处理，并在荧光显微镜下观察。从三个独立的实验中计算出至少50个细胞的每个细胞点数。
由于早期自噬体结构由PtdIns（3）P修饰，我们研究了BATS结构域是否与磷脂酰肌醇结合。我们测试了BATS与中性脂质体、磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）组成的脂质体以及不同的磷脂酰肌醇。有趣的是，BATS优先结合结合有PtdIns（3）P或PtdIns（4,5）P2的脂质体，但不结合PtdInss（4）P或(C). 这表明PtdIns（3）P和PtdIns（4,5）P2可能参与BATS介导的膜结合。PtdIns（3）P的产生一直被认为是自噬体形成过程中的重要事件(8，9). 为了研究PtdIns（3）P结合是否是BATS自噬体结合所必需的，我们用PI3KC3抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理BATS表达细胞。雷帕霉素治疗可诱发BATS点状斑，但3-MA联合用药可减轻斑点状斑(D类)表明BATS自噬体的结合依赖于PtdIns（3）P的产生。
BATS膜曲率传感。
延时视频显微镜分析表明BATS可能与弯曲的膜结合。BATS结构域的两亲性α螺旋不带高电荷，但其极性侧富含丝氨酸/苏氨酸(B类)，类似于用作膜曲率传感器的BAR域(26，36–38). 我们推测BATS结构域可能是曲率的传感器，与弯曲的膜（而不是扁平的膜）结合得更紧密。我们使用不同固有曲率的脂质体来测试这一假设。为此，我们用脑脂提取物的Folch组分制备了不同大小的脂质体。重组BATS结构域优先与小脂质体的高度弯曲膜结合，而不是与大脂质体的相对平坦膜结合(A类). 脂质体的数量通过加入到脂质体中的Texas-Red标记PE标准化(B类). BATS结构域对囊泡大小以及曲率范围的敏感性证实了它是一种膜曲率传感器。
BATS域的膜曲率传感。(A类). 在共沉淀试验中，将不同粒径（100–800 nm）的Folch分数衍生脂质体与重组BATS孵育。S表示上清液，P表示颗粒。(B类). 脂质体结合被评估为BATS与脂质体结合的百分比，而BATS与800nm脂质体的结合百分比。通过测量脂质体中荧光标记的PE来评估脂质体的载量。(C). 将等量PC、PE与PtdIns（3）P（0.2、0.6、2和6 mol%）的梯度增加比例相结合的350微摩尔脂质体制成两种不同尺寸（100和800 nm）的脂质体，并通过共沉淀法检测其与重组BATS的结合。S表示上清液，P表示沉淀。结合效率（结合蛋白与输入）表示为P/（P+S）。(D类). 中描述的类似脂质体结合试验(C)使用PtdIns（4,5）P2进行。(E类). 提出了Barkor/Atg14（L）BATS结构域在高弯曲PtdIns（3）P富集膜上靶向Barkor/Attg14（L）的功能模型。N、 N终点；C、 C终点。请参阅文本了解更多说明。
为了研究PtdIns（3）P在BATS膜曲率传感中的作用，我们将重组BATS与两种不同大小的脂质体（100和800 nm）孵育，脂质体由不同数量的PtdIns3 P（0.2、0.6、2和6%）组成。无论脂质体大小如何，BATS与含有0.2和0.6%PtdIns（3）P的脂质体的膜结合几乎无法检测到。当脂质体中PtdIns（3）P的浓度增加到2%时，BATS明显倾向于与100-nm脂质体相互作用，而不是与800-nm脂质体相作用(C). 进一步将脂质体中的PtdIns（3）P增加到6%，BATS与脂质体之间产生强烈的相互作用，而BATS与100nm或800nm脂质体的结合没有明显差异(C). 这些数据表明，BATS以PtdIns（3）P依赖的方式感知细胞膜曲率，局部高浓度PtdIns3 P足以覆盖BATS的曲率感知活动。有趣的是，BATS只能检测与PtdIns（3）P结合的脂质体的膜曲率，而不能检测到PtdIns（4,5）P2(D类).
讨论
在本研究中，我们确定了Barkor/Atg14（L）的一个膜关联BATS结构域，该结构域特异性地靶向Barkor/Attg14（R）高度弯曲的富含PtdIns（3）P的早期自噬膜。BATS结构域对Barkor/Atg14（L）在自噬激活中的功能至关重要。我们还确定BATS域利用两亲性α螺旋内的疏水残基与膜相互作用。BATS定位于Atg16和LC3阳性自噬膜，也部分与DFCP-1标记的omegasome共定位。在体外，BATS结构域以PtdIns（3）P依赖的方式优先与高度弯曲的膜结合。这些数据表明，Barkor/Atg14（L）以应力诱导的方式集中在通过BATS结构域富集PtdIns（3）P的弯曲自噬膜上。
据报道，Barkor/Atg14（L）通过其N端半胱氨酸重复序列靶向内质网膜。在自噬应激下，Barkor/Atg14（L）招募Beclin 1-Vps34-p150复合物到内质网，在局部内质网膜上产生PtdIns（3）P，并可能支撑自噬体的前体膜。应力诱导的高膜曲率吸引了Barkor/Atg14（L），因为C末端BATS结构域与弯曲膜的高结合亲和力，导致更多PtdIns（3）P的产生，并通过BATS进一步增强Barkor/Attg14（L）膜的结合。弯曲膜上Barkor/Atg14（L）的浓度可能对稳定膜曲率至关重要，也对将下游效应物Atg5/Atg12/Atg16和LC3募集到弯曲膜上并延长膜曲率以吞噬货物和完成自噬体至关重要(E类). 当融合开始时，PtdIns（3）P很可能被磷酸酶去磷酸化，从而导致PI3KC3复合体和Atg5/Atg12/Atg16从自噬体中分离出来。Barkor/Atg14（L）和PI3KC3从自噬体中分离可能导致膜曲率不稳定，并使膜与内切酶/溶酶体融合形成自溶体。
强管化膜的蛋白质，如epsin1-ENTH结构域，通常在其两亲性螺旋的极性侧带高电荷，并独立于脂质体曲率结合膜(29). 相反，弱电荷的两亲性螺旋往往用作膜曲率传感器。在本研究中，我们证明Barkor/Atg14（L）作为膜曲率传感器发挥作用。BATS结构域和Barkor/Atg14（L）是否能单独或与其他PI3KC3亚基协同作用使膜变形尚待研究。自噬体膜曲率的驱动和传感可以与蛋白质支架和脂质修饰相协调。一种可能的蛋白质支架是Atg5/Atg12/Atg16复合物，它将LC3/Atg8及其结合酶招募到有核自噬体膜。Atg5/Atg12/Atg16和LC3的募集和结合对起始膜的伸长至关重要。PI3K激酶产生PtdIns（3）P对膜的形成也是必不可少的，这是Atg5/Atg12/Atg16复合物定向到自噬体膜而不是其他类型膜所必需的(39). BATS结构域作为初始膜曲率传感器的鉴定应提供一个生化平台，以测试不同蛋白质或非蛋白质因子在不久的将来重建自噬体生物发生的必要性。
