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分子生物学细胞。2008年5月；19（5）：2092–2100。
数字对象标识：10.1091/桶。E07-12-1257号
预防性维修识别码：PMC2366860型
PMID：18321988
MBC选择中的一个InCytes

Atg16L复合物指定了LC3脂质氧化的位置，用于自噬中的膜生物发生

藤田直男，*† 伊藤隆志，‡ 大本弘子，* 福田光彦（Mitsunori Fukuda），‡ 野田毅，*和吉森田松（Tamotsu Yoshimori）通讯作者*§
霍华德·里兹曼，监控编辑器
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关联数据

补充资料

摘要

两种泛素样分子Atg12和LC3/Atg8参与自噬体的生物发生。Atg12与Atg5偶联，并与Atg16L形成～800-kDa蛋白复合物（称为Atg16L-复合物）。LC3/Atg8与磷脂酰乙醇胺结合，并与自噬体形成相关，可能是通过使膜伸长。虽然Atg16L复合物是高效LC3脂质化所必需的，但其作用尚不清楚。在这里，我们表明Atg12或Atg16L的过度表达抑制了自噬体的形成。从机理上讲，LC3脂质化的位置取决于Atg16L复合物的膜定位以及Atg12与Atg3（LC3脂质氧化过程中的E2酶）的相互作用。Atg16L在质膜上的强制定位使该部位发生异位LC3脂质沉积。我们认为Atg16L复合物是一种新型的E3类酶，通过动态定位于自噬体形成的假定来源膜，作为LC3脂质氧化的支架。

简介

大自噬，在这里被称为自噬，是一种细胞内过程，通过这种过程，称为自噬体的双层膜结构将胞质溶胶和细胞器螯合并输送到溶酶体/液泡进行降解。除了自噬作为饥饿反应的生理作用外，越来越多的证据表明，自噬参与细胞分化、组织重塑、生长控制、不利环境适应和细胞免疫等过程(Cuervo，2004年；莱文和克林斯基，2004年；吉森，2004).

自噬体的形成模式与其他膜运输过程中的囊泡形成不同，如内吞和分泌途径。这些途径中的运输囊泡是由供体细胞器膜的出芽和断裂产生的。相反，自噬体是在细胞溶质中从头形成的(野田佳彦等。, 2002)扁平的膜囊，即哺乳动物中的隔离膜，会伸长并弯曲，直到末端融合，包裹货物并形成自噬体。这一过程需要独特的机制，而不是在典型的膜贩运途径中使用的机制。酵母遗传学研究揭示了一组参与自噬途径的基因，称为自动液位计，用于自噬相关，并且至少17自动液位计迄今为止，基因已被证明与自噬体的形成有关(铃木和大树，2007年).

Atg机器的一个特点是它有两个类泛素结合系统(Ohsumi，2001年；水岛等。, 2002). 第一个泛素样分子是Atg12。Atg12的C端羧基碱基通过一系列泛素化样反应通过异肽键与Atg5的内部Lys残基共价偶联，该反应涉及E1同源物（Atg7）和E2类似物（Atg10）(水岛等。, 1998). 然后，Atg12-Atg5结合物与Atg16（哺乳动物中的Atg16L）结合，然后这些复合物均聚。因此，Atg12-Atg5和Atg16L形成一个～800-kDa蛋白复合物（称为Atg16L-复合物）。多聚体复合物的一部分定位于分离膜，而大部分扩散到整个细胞质(水岛等。, 2001，2003). 复合物在自噬体完成之前或之后从膜上释放出来，因此它是分离膜的良好标记。虽然Atg5对隔离膜伸长至关重要，但其功能尚不清楚。最近，通过全基因组关联扫描进行的三项独立研究表明，ATG16L突变是回肠克罗恩病的危险因素(TWTCC财团，2007年；汉普等。, 2007；里乌等。, 2007)表明Atg16L是预防疾病发病的关键分子。

第二个泛素样分子是Atg8（哺乳动物中的LC3）。LC3/Atg8的C端羧基通过酰胺键与磷脂酰乙醇胺（PE）的头部胺结合，通过一系列泛素化反应，涉及蛋白酶（Atg4）、Atg7和不同的E2类似物（Atg3）(市村真一等。, 2000). LC3/Atg8的脂化形式与自噬体膜相关(卡贝亚等。, 2000；基里萨科等。, 2000). 脂化过程是可逆的，因为Atg4蛋白酶在体外也能催化LC3/Atg8的脱脂(基里萨科等。, 2000；卡贝亚等。, 2004). 事实上，大多数LC3/Atg8在自噬、自噬体和溶酶体融合的最后阶段从膜上释放出来(基里萨科等。, 1999；木村等。, 2007). 与Atg5类似，Atg8是自噬体形成所必需的。虽然脂化LC3/Atg8可能直接参与膜的伸长，但其实际功能尚不清楚。

有趣的是，在缺乏Atg12-Atg5结合物的情况下，PE结合的Atg8/LC3的数量严重减少，并且细胞溶质Atg8/LC3在酵母或哺乳动物中不是靶向细胞膜的(水岛等。, 2001；铃木等。, 2001). 最近，有报道称，Atg12-Atg5偶联物在体外促进了Atg8的PE偶联(藤冈等。, 2007；花田等。, 2007). 然而，Atg16L复合物，尤其是Atg16L分子，影响体内Atg8/LC3脂质氧化的机制仍基本未知。

自噬中最基本的问题之一是形成自噬体的膜的起源(斯特龙豪格等。, 1998；Juhasz和Neufeld，2006年). Atg5定位于一个新月形的膜结合小室，已被确定为哺乳动物细胞中的早期自噬结构(水岛等。, 2001); 然而，人们对这种结构知之甚少。在酵母中，前自动吞噬体结构（PAS）被认为是自噬体的起源，因为大多数Atg蛋白至少在那里短暂积累(铃木等。, 2001). 然而，PAS的性质仍有争议，它是否是膜结构仍是一个问题。此外，在哺乳动物细胞中还没有发现与PAS相对应的结构。那么，最初的新月形膜结构是从哪里来的呢？脂质是如何提供给隔离膜进行延伸的？阐明控制LC3脂质化如何发生以及在何处发生的分子机制将增加重要的见解。

为了解决这些问题，我们利用了过度表达产生的抑制作用，并成功地剖析了Atg16L复合物的多种功能。Atg16L或Atg12的过度表达在不同阶段抑制了自噬体的形成，尽管这两种蛋白与Atg5是一个复合物。基于这些结果，我们讨论了如何以及在何处添加LC3。我们相信这项研究对自噬体的生物发生过程提供了重要的见解。

材料和方法

试剂和抗体

细胞培养试剂购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。使用了以下抗体：兔多克隆抗鼠LC3(卡贝亚等。, 2000); 抗人Atg5(水岛等。, 2001); 抗鼠Atg16L(水岛等。, 2003); 抗人Atg12(水岛等。, 2001); 与mStrawberry反应的抗单体红色荧光蛋白（MBL，日本名古屋）；小鼠单克隆抗GFP（克隆7.1和13.1；印第安纳波利斯罗氏）；反旗M2（西格玛，密苏里州圣路易斯）；抗c-myc（克隆9E10；Gentaur Molecular Products，日本神户）；抗α-微管蛋白（克隆B5-1-2；Sigma）。Wortmannin（Calbiochem，La Jolla，CA）在Me中制备为100μM储备2所有其他试剂均购自Sigma-Aldrich。

DNA构建与重组腺病毒

编码单体红色荧光蛋白（mStrawberry）的质粒是Roger Y.Tsien博士（加利福尼亚大学圣地亚哥分校）慷慨赠送的礼物(沙纳等。, 2004). GFP-LC3、Myc-LC3-HA和Myc-LC3的表达载体G120A型-HA和GFP-Atg5之前已经描述过(卡贝亚等。, 2000；水岛等。, 2001). pCI-neo-Atg12G140A型或-Atg12G140A，F108使用QuikChange定点突变系统（Stratagene，La Jolla，CA）生成了双突变体（F108A、F108L或F108D）。编码myc-tagged Atg7的cDNA重量和-Atg7c572秒，3x标记为Atg3的标志重量和-Atg3C264S型，Atg5，Atg12，mStrawberry标记的Atg12G140A型，mStrawberry标记的Atg12F108A、G140A、mStrawberry标记的Atg16L删除、Flag-taged Atg16L删除（请参阅图1A） ，mStrawberry标记的Atg16L-N与K-ras（Atg16L-N）的C末端17氨基酸（KDGKKKKKSKTKCVIM）嵌合克拉斯-卡亚克斯)，标记为Atg16L-N的标志克拉斯-卡亚克斯将mStrawberry亚克隆到pENTR 1A质粒（Invitrogen）中。pENTR-1A中的cDNA插入物通过使用LR克隆酶（Invitrogen）的Gateway系统转移到pAd/CMV/V5-DEST载体（Invit罗gen）。根据制造商的说明，使用ViraPower腺病毒表达系统（Invitrogen）制备重组腺病毒。

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Atg12和Atg3之间的相互作用在LC3脂质化中的作用。（A） PC12细胞要么未经治疗，要么感染了携带Atg12（12）、Atg5（5）或Atg16L（16L）的腺病毒。培养40h后，细胞在HBSS（饥饿）中培养2h并收集。用抗LC3抗体进行Western blotting检测裂解产物。（B） 用Myc-tagged LC3和Atg12瞬时共转染HEK293A细胞G140A型或Atg12G140A，F108双突变体（F108A、F108L或F108D）。用每种抗体对裂解液进行免疫印迹。顶部面板，抗Atg12；中间面板，抗myc；底部面板，抗α-微管蛋白。（C） 用3xFlag标记的Atg3和Atg12瞬时转染HEK293A细胞G140A型或Atg12G140A，F108双突变体（F108A、F108L或F108D）。将裂解液进行抗标记免疫沉淀，并使用每个抗体通过Western blotting检测免疫复合物。顶部面板，防旗；中间面板，抗Atg12；底板，抗Atg5。（D） 如图所示，使用重组腺病毒组合共感染PC12细胞。培养40小时后，收集细胞。使用每种抗体通过Western blotting检测裂解液样本。从顶部面板，反Flag、反RFP、反LC3和反α-微管蛋白。

细胞培养、质粒转染和腺病毒感染

MDCK、PC12、HEK293A和MCF7细胞在补充有10%胎牛血清、2 mM的DMEM中生长我-谷氨酰胺和适当的抗生素237°C培养箱。对于营养缺乏，细胞在HBSS（Invitrogen）中培养2 h。根据制造商的协议，使用LipofectAMINE2000试剂（Invit罗gen）进行瞬时转染。在添加500μg/ml G418的生长培养基中选择稳定系。腺病毒感染按如下方式进行：感染前一天，～2×105将细胞置于六孔板中，并在37°C的CO中培养过夜2孵化器。然后用含有重组腺病毒的1.5 ml培养基替换培养基。培养16小时后，用1.5毫升培养基替换培养基。在额外培养24小时后，将细胞用于实验。

西方印迹法

用冰镇PBS冲洗细胞，刮取细胞，在4°C下通过离心收集，并在含有1%Triton X-100、1 mM苯甲基磺酰基氟化物和蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）的PBS中溶解。在15000×克在4°C下持续15分钟，收集上清液。样品通过SDS-PAGE分离并转移至聚偏二氟乙烯膜。用0.1%吐温20/TBS中的1%脱脂牛奶封闭膜，并用一级抗体孵育。使用辣根过氧化物酶结合二级抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove）和鲁米诺溶液（1.25 mM鲁米诺，65 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.2 mM香豆酸，0.01%H）检测免疫反应带2O（运行）2).

荧光显微镜

在盖玻片上培养的细胞用4%多聚甲醛/PBS固定。样品在荧光激光扫描共聚焦显微镜（FV1000；日本东京奥林巴斯）或配备汞灯和冷却电荷耦合器件相机的奥林巴斯IX81显微镜（Roper Cool Snap HQ，亚利桑那州图森）下进行检查，在SlideBook软件（Intelligent Imaging Innovations，Denver，CO）的控制下。检测了100多个细胞，并测定了每个细胞内GFP-LC3或GFP-Atg5点的数量。

凝胶过滤

如前所述进行凝胶过滤分析(水岛等。, 2003). 简单地说，PC12细胞在均质缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，和蛋白酶抑制剂混合物；罗氏）中通过1 ml注射器和23号针头重复传代（～15次）进行均质。匀浆以10000×离心克持续10min，上清液进一步以100000×克持续60分钟。通过尺寸排阻色谱法在Superose 6柱（GE Healthcare，Waukesha，WI）上分离得到的上清液（胞质部分）。

电子显微镜

如前所述进行常规电子显微镜检查(水岛等。, 2001).

统计

图中显示的所有值均表示为平均值和SD。

结果

Atg12过度表达抑制LC3脂质过氧化依赖于Atg12和Atg3之间的相互作用

Atg12、Atg5和Atg16L形成化学计量复合物（称为Atg16L复合物），并且在稳态条件下几乎检测不到每种蛋白质的单体形式(水岛等。, 2003). 为了平衡化学计量，我们使用了一个基于腺病毒的系统来高水平表达每个蛋白质。Atg5的过度表达不影响自噬；相反，Atg12或Atg16L的过度表达对LC3的脂质过氧化和自噬有严重影响(图1A和见下文）。

我们首先探讨了Atg12过度表达影响的分子基础。为了确定Atg12作为Atg12-Atg5结合物的一部分或作为未结合形式是否具有抑制作用，我们将Atg12的C末端甘氨酸（G140）替换为丙氨酸，这使得该蛋白无法与Atg5接合。该突变体对LC3脂质过氧化的抑制作用与结合竞争性Atg12相似，表明未结合的Atg12是LC3脂质过氧化反应的抑制剂(图1B） ●●●●。据报道，酵母Atg12中的疏水残基[F154]对自噬很重要。F154突变对Atg12-Atg5结合没有影响，但残基对Atg8-PE结合很重要(花田和大树，2005年). 酵母Atg12中的F154对应于小鼠Atg12的F108。因此，我们研究了F108突变如何影响Atg12过度表达时观察到的LC3脂质过氧化的抑制。附件12F108A飞机形成与野生型Atg12和酵母Atg12相同程度的Atg12-Atg5结合物154A层（未显示数据）。然而，F108突变显著降低了LC3脂化的抑制作用(图1B） ，表明F108残基对Atg12功能至关重要（因此在Atg12过度表达时用于阻断LC3脂质氧化）。

在酵母和哺乳动物中，Atg12和Atg3之间存在物理相互作用(乌埃茨等。, 2000；谷多等。, 2002；花田等。, 2007); 然而，这种相互作用的功能意义尚未完全阐明。因此，我们使用Atg12分析了Atg3和Atg12之间的相互作用108财年突变体。从瞬时转染小鼠Atg12突变体（Atg12）的HEK293A细胞中免疫沉淀标记小鼠Atg3G140A型或带有F108A、F108L或F108D的双突变体）。然后通过Western blotting检测共表达蛋白的相互作用。如所示图1C、 附件12G140A型与Atg3联合免疫有效。相比之下，Atg12F108A、G140A和附件12F108D、G140A几乎没有共免疫沉淀，而Atg12F108L，G140A与Atg3共免疫沉淀，尽管程度低于Atg12G140A型这些结果表明，Atg12的F108是与Atg3相互作用的必要条件。因为Atg12突变体对LC3脂质氧化的抑制作用强度与Atg12突变对Atg3的结合能力相关(图1可以想象，Atg3-LC3中间体被过量的Atg12单体滴定出来。

为了确认Atg12-过度表达细胞中是否形成了Atg3-LC3中间产物，我们使用E2（Atg3C264S型)活性位点半胱氨酸残基被丝氨酸取代的酶。通过使用这种突变体，高分子量Atg3C264S型-LC3中间体是稳定的，因为酶和底物之间形成稳定的酯键，而不是不稳定的硫酯键(谷多等。, 2002). 如所示图1D、 LC3-Atg3C264秒在模拟细胞或mStrawberry-Atg12中，中间产物的形成同样良好G140A型–过度表达细胞。此外，反应动力学几乎不受Atg12的影响G140A型过度表达（补充图1、A、B和D）。因此，Atg12可能会阻止LC3从Atg3传输到PEG140A型而不是前面的E1或E2步骤。

最后，为了确定Atg12突变体的过度表达是否抑制了自噬体的形成，将稳定表达GFP-LC3的MDCK细胞感染带有mStrawberry、mStrawberry-Atg12的重组腺病毒G140A型，或mStrawberry-Atg12F108A、G140A计算GFP-LC3点（自噬体标记物）的数量。mStrawberry-Atg12G140A型（但不是mStrawberry-Atg12F108A、G140A)-在营养丰富和饥饿条件下，感染细胞的GFP-LC3点显著减少(图2、A和B）。同样，我们检测了Atg12突变体过度表达对GFP-Atg5点形成的影响。GFP-Atg5与Atg16L一起定位在分离膜上，这是一个新生的自噬体，完成后，它分离到胞质溶胶中。与对GFP-LC3的影响相反，mStrawberry-Atg12的过度表达G140A型对GFP-Atg5斑点形成几乎没有抑制作用(图2、C和D）。这些结果表明，小鼠Atg12的F108在LC3的靶向和脂质化中起作用，但不参与Atg16L复合物的膜定位。总之，我们认为Atg12和Atg3之间的相互作用对于LC3在体内的PE偶联非常重要。

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小鼠Atg12的F108对LC3的靶向性很重要。（A和B）稳定表达GFP-LC3的MDCK细胞感染了携带mStrawberry（Mock）、mStrawbery-Atg12的腺病毒G140A型（G140A）或mStrawberry-Atg12F108A、G140A（F108A，G140A）并孵育40 h。然后将细胞在HBSS（饥饿；A和B）或生长培养基（Fed；B）中培养2 h，固定，并使用荧光显微镜观察（A）。棒材，10μm。每个细胞（B）的GFP-LC3点数检测超过100 mStrawbery-阳性细胞。数据表示为平均值±SD。（C和D）稳定表达GFP-Atg5的MDCK细胞感染了携带mStrawberry（Mock）、mStrawbery-Atg12的腺病毒G140A型（G140A）或mStrawberry-Atg12F108A、G140A（F108A，G140A）并培养40 h。然后将细胞在HBSS（饥饿；C和D）或生长培养基（Fed；D）中培养2 h并固定。通过共焦激光扫描显微镜（FV1000，Olympus）（C）从间隔0.3μm的连续光学切片获得三维图像堆栈。棒材，10μm。每个细胞（D）的GFP-Atg5点数检测超过100 mStrawbery-阳性细胞。数据表示为平均值±SD。

Atg16L线圈结构域的过度表达抑制自噬

上述结果表明，Atg16L复合物在LC3脂质化中起作用。为了进一步探讨Atg16L复合体的功能，我们接下来检查了Atg16L过度表达的影响。我们产生了一系列携带mStrawberry标记的Atg16L缺失突变体的腺病毒(图3A） ●●●●。Atg16L蛋白由一个参与Atg5结合的N末端结构域、一个自我多重聚合所需的中心卷曲-卷曲结构域和一个作用未知的C末端WD重复结构域组成。哺乳动物中至少有三种亚型Atg16L-α、-β和-γ通过选择性剪接事件产生(水岛等。, 2003). 将稳定表达GFP-LC3的MDCK细胞感染Atg16L缺失序列中携带腺病毒的构建物，并计算GFP-LC3dots的数量。所有带有线圈区域（16L-M、-ΔN或-ΔC）的结构都抑制GFP-LC3点的形成，相当于全长Atg16L(图3，B和C，以及补充图2）。接下来，我们评估了LC3点形成所必需的LC3脂质过氧化是否受到缺失结构过度表达的影响。用相同的腺病毒感染PC12细胞，并对细胞裂解液进行LC3的Western印迹。如所示图3D、 LC3脂质过氧化被含有线圈区域的Atg16L结构的过度表达所抑制。为了确定对自噬体形成的影响，我们用电子显微镜检查了细胞。在过表达Atg16L的细胞中很少观察到自噬体(图3、E和F）。综上所述，这些结果表明Atg16L线圈区的过度表达抑制了自噬体的形成。

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Atg16L线圈结构域过度表达对自噬的影响。（A） 鼠标Atg16L和删除结构的示意图。线圈区域由阴影表示，WD重复显示为黑色框。将稳定表达GFP-LC3的（B和C）MDCK细胞感染带有mStrawberry（Mock）或mStrawberry-frused Atg16L缺失结构的腺病毒，并孵育40 h。然后将细胞培养在HBSS（Starved；B and C）或生长培养基（Fed；C）中2 h，固定，并使用荧光显微镜观察（B）。棒材，10μm。每个细胞（C）的GFP-LC3点数检测超过100 mStrawbery-阳性细胞。数据表示为平均值±标准偏差。（D）PC12细胞要么未经治疗，要么感染了带有mStrawberry（Mock）或mStrawberry-frused Atg16L缺失结构的腺病毒。培养40h后，细胞在生长培养基（F；Fed）或HBSS（S；饥饿）中培养2h并收集。用所示抗体通过Western blotting检测裂解产物。抗RFP抗体与mStrawberry反应。将稳定表达GFP-LC3的（E和F）MDCK细胞感染带有mStrawberry（E）或mStrawberry-frused Atg16L（F）的腺病毒并培养40h。然后将细胞在HBSS中培养2h，固定，并进行常规电子显微镜分析。显示自噬结构（箭头）。棒材，1μm。

Atg16L的过度表达干扰了Atg16L复合物的膜定位以及LC3从Atg3向PE的转移

Atg16L过度表达可能对自噬产生间接影响。或者，改变Atg16L复合物的适当亚单位化学计量比可能会对LC3脂质氧化产生抑制作用。为了评估这些可能性，用携带Atg16L、Atg5和Atg12的重组腺病毒组合感染PC12细胞，并测定LC3脂质过氧化。全长Atg16L过度表达的抑制作用仅通过同时过度表达Atg12和Atg5而完全被抑制，而不是仅通过Atg12或Atg5(图4A） ●●●●。以前有报道称，Atg12-Atg5和Atg16L通过Atg16L的线圈-线圈区域的自多重聚合形成一个～800-kDa复合物(水岛等。, 2003). 我们证实，共表达的Atg12、Atg5和标记的Atg16L在胞浆中形成了～800-kDa多聚物复合物（补充图3）。这一结果表明，LC3脂质过氧化的抑制是由亚单位化学计量比的改变引起的，而不是由Atg16L过度表达的间接影响引起的。

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在存在过量Atg16L的情况下组织Atg16L复合体。（A） 如图所示，使用重组腺病毒组合共感染PC12细胞。培养40h后，细胞在生长培养基（Fed）或HBSS（Starved）中培养2h，用Western blotting对每种抗体进行裂解产物分析。从顶部面板，反Flag、反Atg5、反Atg 12、反LC3和反α-微管蛋白。（B–E）通过尺寸排除色谱分离对照组和过度表达Flag-Atg16L构建物的PC12细胞匀浆的细胞溶胶部分。使用每种抗体对每一部分进行Western印迹。顶部面板，抗Atg5；中间面板，抗Atg16L；底部面板，防旗（B除外）。（B） 模拟。（C） 标记-Atg16L。（D） 标志-Atg16L-ΔC。（E） 标记-Atg16L-M。分子质量标准的位置如图所示。PC12细胞仅表达Atg16L-α和-β亚型。Vo，空隙率。

基于这些结果，我们假设～800-kDa多聚体复合物是一种功能复合物，并且Atg16L线圈区域的过度表达导致形成不完整和无功能复合物（缺乏适当比例的Atg12-Atg5亚基）。为了检验这种可能性，我们通过大小排阻色谱法测试了Flag-Atg16L或含有线圈结构域的缺失结构体的过度表达对Atg16L复合物分子质量的影响。出乎意料的是，这些结构的过度表达并没有改变Atg16L复合物的分子量(图4，B–E）。此外，在含有Atg16L复合物的分数4到7中只发现了极低水平的缺失结构(图4、D和E）。这些结果表明，在存在过量的Atg16L线圈区域时，Atg16L复合体保持完整。因此，我们推断Atg16L复合物是稳定的，它不经历频繁的亚单位交换，并且Atg16L的短暂过度表达不会干扰预先存在的Atg16L-复合物。

接下来，我们观察复合物的定位，以确定它是否受到Atg16L过度表达的影响。沃特曼素是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）的抑制剂，是已知抑制Atg5定位的唯一条件(水岛等。, 2001). 将稳定表达GFP-Atg5的MDCK细胞感染带有mStrawberry或mStrawberry-Atg16L-M的重组腺病毒，并计算GFP-Atg 5点的数量。与Atg12的效果形成对比(图2表达mStrawberry-Atg16L-M的细胞GFP-Atg5点显著减少(图5、A和B）。这些结果表明，Atg16L的过度表达阻止了～800-kDa多元复合物定位于膜。对该观察结果的一个可能解释是，假设的Atg16L相互作用因子（Atg16L-复合物的膜定位所需）被过量的Atg16 L滴定出来。在隔离膜的假设来源处，复合物失去了正确的定位，导致LC3脂质化受到抑制。

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Atg16L过度表达对Atg16L复合物膜定位和LC3脂质氧化反应的影响。将稳定表达GFP-Atg5的（A和B）MDCK细胞感染带有mStrawberry（Mock）或mStrawberry-Atg16L-M的腺病毒并培养40h。然后将细胞培养在HBSS（Starved；A和B；或生长培养基（Fed；B）中2h并固定。通过共焦激光扫描显微镜（FV1000，奥林巴斯）（A）从间隔0.3μm的连续光学切片获得三维图像堆栈。棒材，10μm。每个细胞（B）的GFP-Atg5点数检测超过100 mStrawbery-阳性细胞。数据表示为平均值±标准偏差。如图所示，使用重组腺病毒组合对（C和D）PC12细胞进行联合感染。培养40小时后，收集细胞。使用每种抗体通过Western blotting检测裂解液。（C） 从顶部面板，反myc、反RFP、反LC3和反GFP。（D） 从顶部面板，防旗帜、防RFP、防LC3和防GFP。

最后，我们询问了Atg16L过度表达抑制LC3脂质化的哪一步。我们使用了E1（Atg7C567S型)和E2（Atg3C264S型)活性位点半胱氨酸残基被丝氨酸取代的酶(谷多等。, 2001，2002). 如所示图5C、 在过度表达Atg16L的PC12细胞中，Atg7-LC3的生成水平与模拟对照相当。同样，生成了正常量的Atg3-LC3(图5D） ●●●●。Atg3-LC3反应动力学也不受Atg16L过度表达的影响（补充图1、A、C和D）。这些结果表明，过量的Atg16L抑制了Atg3-LC3中间体形成后的步骤，但在E1和E2反应步骤之前没有影响。

异位Atg12-Atg5将LC3-共轭反应导向质膜

综上所述，上述结果表明Atg16L络合物直接参与LC3共轭反应。一种假设是，Atg16L络合物是共轭反应位置的直接决定因素。如果是这样，LC3脂质将在Atg16L复合物定位的膜上发生。为了直接评估这一假设，我们将Atg12-Atg5结合物体外靶向质膜（PM）。我们选择PM作为本实验的靶点，因为该膜的内叶中含有丰富的PE(Emoto和Umeda，2000年).

为了将Atg12-Atg5偶联物靶向PM，将全长Atg16L的C末端或参与Atg5结合的Atg16L-N末端融合到K-ras（Atg16L-N）的17个氨基酸（KDGKKKKSKTKCVIM）上克拉斯-卡亚克斯)，足以将异源蛋白靶向PM(汉考克等。, 1991). 两种构建体主要定位于PM，但mStrawberry-Atg16L-N克拉斯-卡亚克斯显示了更清晰的PM定位；因此，我们使用这个结构进行进一步分析(图6A和未显示）。Atg16L-N克拉斯-卡亚克斯通过10万倍离心，细胞表达的蛋白质在颗粒组分中完全恢复克持续60分钟（数据未显示）。GFP-Atg5也被mStrawberry-Atg16L-N招募到PM克拉斯-卡亚克斯表达式（补充图4）。

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定位于质膜的异位Atg12-Atg5对LC3脂质氧化反应的影响。（A） 使用重组腺病毒组合对稳定表达GFP-LC3的MCF7细胞进行共感染。培养40h后，将细胞在含有100 nM沃特曼的HBSS或HBSS中培养2h，固定，并通过共焦激光扫描显微镜（FV1000，奥林巴斯）进行观察。棒材，10μm。（B） 稳定表达GFP-LC3的MCF7细胞与携带Atg12、Atg5和Flag-Atg16L-N的重组腺病毒共感染克拉斯民航局培养40h后，细胞在HBSS中培养2h，在PEM缓冲液（80 mM PIPES-KOH，pH 6.8，5 mM EGTA，1 mM MgCl）中预发酵5min2)含有50μg/ml洋地黄素，并固定。样品通过共焦激光扫描显微镜观察（FV1000，奥林巴斯）。还显示了从Z截面重建的侧面图像。棒材，10μm。（C） 使用所述重组腺病毒的组合感染稳定表达GFP-LC3的MCF7细胞。培养40h后，细胞在生长培养基（F）、HBSS（S）或含100 nM沃特曼蛋白（W）的HBSS中培养2h。使用每种抗体通过Western blotting检测裂解液。从顶部面板，抗RFP、抗Atg5、抗GFP、抗LC3和抗α-微管蛋白。

在确定我们可以将Atg16L和Atg5蛋白靶向/错定位到PM后，我们检查了对LC3脂质化的影响。稳定表达GFP-LC3的MCF7细胞与携带mStrawberry-Atg16L-N的重组腺病毒共感染克拉斯-卡亚克斯、附件12和附件5。如所示图6在PM上，A和B、GFP-LC3信号明显，这不受沃特曼治疗的影响；然而，饥饿诱导的代表自噬体的细胞溶质LC3点大大减少。在MDCK和PC12细胞中也得到了类似的结果。然后，我们研究了Atg12-Atg5·mStrawberry-Atg16L-N对LC3脂质过氧化的影响克拉斯-卡亚克斯复杂。如所示图6C、 当mStrawberry-Atg16L-N克拉斯-卡亚克斯、Atg12和Atg5共表达。有趣的是，Atg16L克拉斯-卡亚克斯-依赖性LC3脂质化是磷脂酰肌醇3-磷酸和饥饿信号依赖性。即使在仅支持低基础水平LC3脂质沉积的营养丰富的条件下，这些结构物也有助于LC3脂质的沉积。LC3的脂质化通常依赖于PI3K的活性，因为沃特曼治疗可以防止这种修饰。然而，这些结构物能够在沃特曼的存在下实现LC3脂质化。在这些条件下，细胞内代表自噬体的GFP-LC3点实际上消失了，但PM-localized GFP-LC3-仍然存在，这表明脂质LC3必须定位在PM上。Atg16L线圈区域的过度表达并没有抑制GFP-LC3.的PM定位（补充图5）。这一结果表明，Atg16L对自噬的抑制作用是由于其复合物靶向错误所致；过度表达的蛋白质不再定位于脂质氧化反应正常发生的部位。

讨论

在本研究中，我们阐明了Atg16L复合物的功能。这种复合物将LC3带到脂质氧化的位置，并对反应的最后一步进行催化。基于这些结果，我们提出了LC3脂质化的动态局部化模型(图7). 在诱导自噬时，Atg16L复合物以依赖Atg16L-的方式从胞浆重新定位到未知的膜。被Atg7激活的高能Atg3-LC3中间体通过Atg16L复合体中Atg3和Atg12之间的相互作用被招募到膜上。这使得LC3与膜中的PE接近，导致随后的脂质氧化。

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LC3润滑的动态定位模型。在自噬诱导时，胞质溶胶中的Atg16L复合物以Atg16L依赖的方式定位在尚未确定的膜上。由Atg7激活的高能Atg3-LC3中间体通过Atg3和Atg12之间的相互作用补充到该膜。因此，LC3与膜中的PE接近，导致脂质氧化。Atg16L复合体起着支架的作用，LC3在其上从Atg3转移到PE。

体外重组实验表明，Atg8/LC3脂质化所需的最低成分为Atg7、Atg3、Atg8/LC3、磷脂脂质体和ATP(市村真一等。, 2004；苏等。, 2006). 在比体内观察到的浓度高得多的Atg8/LC3和PE存在的情况下，含有PE的胶束/囊泡和Atg8/LC3将以足以支持脂质化反应的某个频率相遇。据报道，Atg12-Atg5偶联物有助于体外形成Atg8-PE(花田等。, 2007). Atg16是体内高效Atg8-PE形成所必需的；然而，在体外观察到Atg16对Atg8的PE结合几乎没有加性作用(花田等。, 2007). 根据我们的模型，人工脂质体上可能不存在Atg16识别的假定膜因子。然而，我们在此表明，Atg16L通过指定反应位置直接参与LC3脂质化。基于体外和体内结果，有理由提出，在体内，Atg16L复合物可以作为LC3从Atg3转移到PE的支架。与泛素化反应类似，从E3组分在底物与E2酶的结合中起作用的意义上讲，该复合物可以被视为LC3结合系统中的类E3因子(铃木等。, 2005；松下等。, 2007). 一般来说，E3特异性地识别其蛋白质底物；然而，在这种情况下，识别过程可能归因于复合物与膜的结合。因此，Atg16L复合物是一种独特的新型E3，可识别特定的膜作为底物。LC3靶向特定膜的机制一直很神秘，因为PE是一种丰富的磷脂，可能存在于所有膜细胞器中，而未磷脂LC3是一种可溶性蛋白质。我们的结果表明，LC3的膜靶向性是由Atg16L复合物定义的，而不是LC3中的一些固有靶向信息。LC3的体内靶标仅限于PE，但磷脂酰丝氨酸（PS）可能是LC3的体外靶标(苏等。, 2006). 体内选择性可能与Atg16L复合物的膜定位有关。

我们的结果表明，Atg16L复合物的定位位点是脂化位点。这个位置可能对自噬体的形成至关重要，因为Atg16L复合物被迫定位于PM可以实现LC3脂质氧化，但不能形成自噬小体。唯一已知Atg5（或Atg16L）定位的地方是哺乳动物细胞中形成自噬体的隔离膜的外表面(水岛等。, 2001). 因此，隔离膜是LC3脂质化位置的首选。与这种可能性相关的谜团是，Atg3-LC3中间产物的补充以形成自噬体并不能解释包括PE在内的新脂质是如何被供应的。最近，中川县等。(2007)结果表明，Atg8-PE在体外能引起囊泡/胶束的半融合，这一特性可能与自噬体形成的膜伸长步骤有关。另一种可能性是，Atg16L复合物可能与膜结构存在未检测到的、可能是暂时的关联，从而实现LC3的脂质化。在这种情况下，脂化后的LC3可能与Atg16L复合物一起被输送到自噬体。这种膜可以被认为是自噬体膜脂的来源。就酵母而言，PAS就是这样一个候选者。酵母遗传研究表明Atg12系统和Atg8的PAS定位相互依赖，可以用我们的模型来解释(铃木等。, 2007). 然而，PAS尚未检测到膜结构。PAS模型是否适用于哺乳动物是另一个有趣的问题。

PM-localized Atg16L复合物绕过了两个通常对LC3脂质过氧化至关重要的重要因素：饥饿信号和PI3K信号(卡贝亚等。, 2000). 这一结果表明，这些信号通路的输出是将Atg16L复合物靶向源膜。最简单的模型是，包括Beclin-1在内的自噬特异性PI3K复合物被饥饿激活，由此产生的磷脂酰肌醇3-磷酸招募Atg16L复合物；然而，可能涉及另一种更复杂的机制。最重要的是，我们表明，靶向膜的Atg16L复合物足以进行LC3脂质氧化。这表明靶向Atg16L复合体是调节自噬体形成的重要步骤。

我们表明，Atg16L线圈区域的过度表达仅影响Atg16L复合物的定位，而不影响其作为脂质氧化催化剂的功能。抑制机制尚不清楚，但我们推测与Atg16L线圈区域相关的因子被过量的Atg16L滴定出来。这一因素将与Atg16L复合体相互作用，并对其定位是必要的。我们现在正在寻找这种因子的鉴定，它必须是自噬体形成的关键。

我们已经揭示了Atg12和LC3系统之间的直接功能联系。最重要的发现是Atg16L复合物可以特异性识别自噬体的膜起源。因此，Atg16L复合物的膜定位机制是理解自噬中膜动力学的关键。通过研究细节，我们正在接近自噬这一长期存在的基本问题的核心。

克罗恩病是一种常见的病因不明的慢性炎症性肠病(特拉维斯等。, 2006). 最近，有报道称克罗恩病与变异型Atg16L之间存在关联，尽管该变异型易引起肠道炎症的机制尚不清楚(TWTCC财团，2007年；汉普等。, 2007；里乌等。, 2007). 我们的发现可能是理解这种疾病的重要一步，通过提供有关Atg16L的精确功能和通过Atg16L调节自噬的信息。

补充材料

【补充资料】

致谢

作者感谢木村俊介博士（吉森实验室）提供稳定表达GFP-LC3或GFP-Atg5的MDCK细胞；Kouichi Matsunaga博士（吉森实验室）赠送稳定表达GFP-LC3的MCF7细胞；Roger Y.Tsien博士赠送草莓cDNA；Noboru Mizushima博士（日本东京医科牙科大学）赠送抗Atg16L抗体；Kyouhei Umebayashi博士（吉森实验室）进行有益的讨论；和Daniel Klonsky博士（密歇根大学）对手稿进行批判性阅读。本报告所述的工作得到了教育、文化、体育、科学和技术部促进科学技术特别协调基金的部分支持。

使用的缩写：

哈佛商学院汉克斯平衡盐溶液
聚乙烯磷脂酰乙醇胺
PI3K系列磷脂酰肌醇3-激酶
颗粒物质膜。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E07-12-1257)2008年3月5日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会