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英国癌症杂志。2010年11月；103(11): 1671–1679.
2010年11月2日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.bjc.6605968
预防性维修识别码：PMC2994230型
PMID：21045835

CXCL12–CXCR4信号轴使吉西他滨对胰腺癌细胞产生耐药性：一种新的治疗靶点

S辛格，1,* S K斯利瓦斯塔瓦，1 巴德瓦吉，1 L B欧文，1和A P辛格1,2,*
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补充资料

摘要

背景：

胰腺癌细胞对药物治疗高度耐药；然而，其根本原因在很大程度上仍不清楚。我们假设CXCL12–CXCR4信号的激活通过增强存活率而赋予胰腺癌细胞耐药性。CXCR4在癌前/恶性胰腺病变和癌干细胞中过度表达，并与其发病机制有关。

方法：

通过MTT、DNA阶梯、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性、免疫印迹和启动子报告分析，检测CXCL12激活CXCR4对抑制吉西他滨诱导的细胞毒性和刺激胰腺癌细胞生存信号的作用。随后，我们检测了CXCR4拮抗剂AMD3100在消除激活的CXCL12–CXCR4信号的救援作用方面的作用。

结果：

与单用药物治疗的细胞相比，用吉西他滨治疗的胰腺癌细胞在CXCL12存在下的细胞毒性降低。CXCL12诱导FAK、ERK和Akt信号通路的激活，增强β-catenin和NF-κB、 以及生存蛋白的表达。AMD3100阻止了CXCL12诱导的胰腺癌细胞生长和耐药性。

结论：

我们的发现首次证明了CXCL12–CXCR4信号转轴在赋予胰腺癌细胞耐药性中的作用，并表明它可以单独或与细胞毒药物联合作为胰腺癌治疗的新靶点。

关键词：CXCR4、CXCL12、胰腺癌、耐药性、治疗靶点

胰腺癌是一种高度致命的恶性肿瘤，预后极差。诊断后的总体中位生存期为2-8个月，所有胰腺癌患者中只有1-4%在诊断后存活5年(辛格等, 2004). 根据美国癌症协会的估计，42 2009年470名美国人被诊断患有胰腺癌，35名 240人死于该病，这标志着该恶性肿瘤是癌症死亡的第四大原因(杰马尔等, 2009). 手术切除是治疗的最佳和最有效的选择，但在大多数病例中，疾病是局部晚期的，或者在诊断时已经转移到远处的器官。在后一种情况下，化疗被视为一种选择，但由于化疗耐药，效果通常不大(Liau和Whang，2008年；雷吉巴等, 2009). 胰腺癌细胞的耐药性被认为主要是由于胰腺肿瘤的纤维化性质导致的积极的生存机制和/或低效的药物输送所致(橄榄色等, 2009；裴等, 2009). 因此，迫切需要开发替代策略和新疗法，以有效治疗这种毁灭性恶性肿瘤并改善临床结果。

趋化因子受体CXCR4在多种恶性肿瘤中表达，并因其在癌症发病机制中的作用而被广泛研究(辛格等, 2007；杰尔梅妮等, 2008). CXCR4在大多数胰腺癌组织和癌前病变中表达升高，提示其在胰腺癌发病机制中的作用(托马斯等, 2008；马雷查尔等, 2009). CXCL12是CXCR4的配体，也由邻近的基质细胞大量产生，CXCL12激活表达CXCR4胰腺癌细胞导致趋化性增强、内皮细胞迁移和基质侵袭(马切西等, 2004；松尾等, 2009). 此外，胰腺转移的常见部位（淋巴结、肝脏、肺部等）存在高浓度CXCL12，这表明CXCL12–CXCR4信号可能在胰腺癌细胞向特定器官归巢中起作用(莫里等, 2004；索尔等, 2005). 重要的是，最近的一项研究还表明，CD133的一个不同亚群+；CXCR4系列+肿瘤干细胞（CSC）位于侵袭性胰腺肿瘤的前沿，表明CXCR4在侵袭过程中可能发挥作用(赫尔曼等, 2007). 胰腺CSC上表达的CXCR4对其侵袭和转移特性至关重要，这表明与疾病侵袭性密切相关(赫尔曼等, 2007). CXCL12–CXCR4信号轴也与周围基质的促结缔组织增生性改变有关，有利于肿瘤细胞生长(马洛等, 2008). 在其他研究中，CXCL12–CXCR4信号传导被证明可以刺激胰腺癌细胞增殖并保护癌细胞免受血清剥夺诱导的凋亡(Koshiba公司等, 2000；马切西等, 2004；索尔等, 2005；马洛等, 2008). 总之，这些观察结果表明CXCR4信号在胰腺癌生存、增殖、侵袭和转移中起着重要作用，表明该信号轴是癌症治疗的潜在靶点。

吉西他滨是FDA批准的治疗晚期和转移性胰腺癌的唯一化疗药物。然而，它在临床上并没有被证明是非常有效的，接受吉西他滨治疗的患者生存率的改善也只是微乎其微(橄榄色等, 2009；Wong和Lemoine，2009年). 在本研究中，我们假设CXCL12–CXCR4信号轴通过刺激固有细胞生存机制参与胰腺癌耐药。我们研究了CXCL12在限制吉西他滨诱导的胰腺癌细胞毒性和激活生存信号通路方面的作用。此外，我们研究了CXCR4拮抗剂AMD3100在阻止激活的CXCL12–CXCR4信号的救援作用方面的治疗意义。我们的数据表明，CXCL12在胰腺癌细胞中诱导一系列信号事件，并抵消吉西他滨的细胞毒性作用。此外，我们的数据显示，AMD3100可以消除CXCL12–CXCR4信号的生存效应，并且可以单独或与吉西他滨联合作为治疗手段，有效抑制胰腺癌细胞的生长。

材料和方法

细胞系和培养条件

人胰腺癌细胞系（Colo357，SW1990，AsPc1，BxPc3，CaPan1，HPAF II，CFPAC1，Panc1，MiaPaCa，Panc10。05，Panc03.27，Panc02.03）从美国类型培养物收藏馆（弗吉尼亚州马纳萨斯，美国）购买。细胞系在RPMI-1640或Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）（Thermo Scientific，Logan，UT，USA）培养基中作为粘附单层保存，补充10%胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA，USA μM（M）青霉素和链霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。细胞在37°C和5%CO下生长2在潮湿的大气中。

试剂

SuperScript II逆转录酶和Vybrant MTT细胞增殖检测试剂盒来自Invitrogen。重组人CXCL12和CXCL12 ELISA试剂盒购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）。AMD3100八盐酸盐和抗-β-肌动蛋白鼠单克隆抗体购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。吉西他滨由USAMCI药房提供。磷酸酶和蛋白酶抑制剂以及FuGENE转染试剂来自Roche Diagnostics（德国曼海姆）。抗CXCR4（兔多克隆）抗体来自Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）。抗Akt、-pAkt和-pFAK（兔单克隆）抗体来自Epitomics（加利福尼亚州伯灵盖姆，美国）。ERK1/2（兔单克隆）、pERK1/2、Bcl-2（兔多克隆）、BAD（兔单抗）、pBAD（家兔多克隆），Bcl-xL（兔单株）、黏着斑激酶（兔多基因）和Survivin（兔单链）的抗体来自Cell Signaling Technologies（美国马萨诸塞州贝弗利）。Notch1（山羊多克隆）和二级辣根过氧化物酶偶联抗兔、抗鼠和抗羊抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。DNAzol试剂来自Molecular Research（辛辛那提，俄亥俄州，美国）。CaspACE FITC-VAD-FMK和双荧光素酶检测系统试剂盒来自Promega（美国威斯康星州麦迪逊）。ECL Plus Western Blotting检测试剂盒，DharmaFECT转染试剂，ON-TARGET加针对CXCR4的非靶向池加扰siRNA和SMARTpool siRNA来自Thermo Scientific。LY294002和PD98059（分别为PI3K和MEK1抑制剂）购自Cell Signaling Technology。TOPflash或FOPflash报告质粒由USAMCI的R Samant博士和pGL4.32善意提供[卢克2P（P）/NF-kB-RE/Hygro]报告质粒购自Promega。

蛋白质印迹分析

使用标准程序对细胞进行蛋白质提取和蛋白质印迹处理。简单地说，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞两次，然后刮到含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的NP-40裂解缓冲液中。细胞裂解物通过针头注射器以促进细胞膜的破坏，并在14 000 20转/分 在4°C下，收集上清液。蛋白质（10–50 μg） 通过10%SDS–PAGE电泳分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并使用特定抗体进行标准免疫检测程序：Akt、pAkt ERK1/2 pERK1/2、Bcl-2、Bcl-xL、FAK、pFAK、Survivin、，β-catenin和BAD（1 : 1000），pBAD（1 : 500），槽口-1（1 : 200），以及β-肌动蛋白（1 : 20 000）。所有次级抗体均在1 : 2500稀释液。用ECL Plus Western印迹检测试剂盒处理印迹，用LAS-3000图像分析仪检测信号（日本东京富士照片胶片公司）。

酶联免疫吸附试验

电池（1×106)在含有添加FBS的生长培养基的六孔板中播种，并培养过夜。24天后 h、 去除生长培养基，在无血清培养基中对细胞进行调节，以备72天之用 h.然后收集培养基，在1500℃下离心 5的r.p.m 在使用前，至少清除在−80°C下冻结的颗粒和上清液。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒测量CXCL12。

LEF/TCF和NF-κB转录活性分析

测量LEF/TCF和NF-κB转录活性，胰腺癌细胞（1×105)在12孔板中播种。24天后 培养h后，用荧光素酶启动子报告结构（TOPflash、FOPflash或pGL4.32）瞬时转染细胞[勒克2P（P）/NF-kB-RE/Hygro]）。TOPflash报告质粒包含胸苷激酶（TK）启动子上游的Tcf/Lef位点和萤火虫荧光素酶基因的三个拷贝，而在FOPflash中，Tcf/Lef位点发生突变，因此它可以作为测量报告者非特异性激活的对照。细胞还与一个报告质粒联合转染，该报告质粒包含TK启动子下游的肾形肾小球荧光素酶基因，以控制转染效率。根据制造商的建议，使用FuGENE作为转染试剂进行所有转染。用CXCL12（100 纳克 毫升−1) 24 h后TOPflash/FOPflash或pGL4.32[卢克2P（P）/NF-kB-RE/Hygro]转染，然后24小时后 h、 在被动裂解缓冲液中分离总蛋白。使用双荧光素酶测定系统测量荧光素素酶活性。所有实验均以一式三份的形式进行，并将相对荧光素酶活性报告为转染效率归一化后的折叠诱导。

细胞活力测定

将Panc1和MiaPaCa细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96个培养皿中，然后在第二天以增加吉西他滨浓度（0–10 μM（M）)无论是否有CXCL12（100 纳克 毫升−1). 72岁之后 处理h后，用Vybrant MTT细胞增殖试验测定细胞生长。增长以百分比（%）计算=[((A类/B类)−1）×100]，其中A类和B类分别为处理细胞和对照细胞的吸光度。为了检测CXCR4靶向作用，用小分子CXCR4拮抗剂AMD3100（5 μ克 毫升−1)，用于1 h.为了描述Akt和ERK通路的作用，对细胞进行1 使用LY294002（20 μM（M）)和PD98059（25 μM（M）)分别是。为了进一步证实CXCR4的作用，根据制造商的协议，使用DharmaFECT转染试剂（Thermo Scientific），用CXCR4或非靶向siRNA池瞬时转染Panc1和MiaPaCa细胞。24天后 h、 用吉西他滨处理细胞（5 μM（M）)检测细胞活力72 h后处理。

DNA片段分析

Panc1和MiaPaCa细胞在含有和不含吉西他滨（5和10）的10%DMEM中培养 μM（M）)和CXCL12（100 纳克 毫升−1)用于48 h.用PBS和DNA清洗细胞两次（2μg） 使用DNAzol试剂提取。在含有溴化乙锭（EtBr）的1.0%琼脂糖凝胶上解析分离的DNA，并在LAS-3000图像分析仪（富士光电胶片公司）下观察。

细胞凋亡的测量就地

如前所述，将Panc1和MiaPaCa细胞培养在培养箱载玻片上，并用吉西他滨和/或CXCL12处理。通过用PBS中的CaspACE FITC-VAD-FMK溶液染色细胞2小时来检测细胞凋亡 37°C时为h。CaspACE FITC-VAD-FMK公司现场标记物是胰蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK（羧苯氧基-戊基-丙基-天冬氨酸）的荧光类似物-[O（运行）-甲基]-氟甲基酮），与活化的半胱氨酸蛋白酶不可逆结合，是半胱氨酸酶活性的替代物就地用CaspACE FITC-VAD-FMK染色后，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞，并用PBS洗涤。在Nikon Eclipse TE2000-U荧光显微镜（Nikon Instruments Inc.，Melville，NY，USA）下检测结合的荧光标记。

统计分析

每个实验至少进行三次，所有数值均表示为平均值±标准差。使用学生的t吨-测试。A类P（P）-⩽0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

胰腺癌细胞CXCR4和CXCL12的表达及其对CXCL12刺激的生长反应

早期研究表明CXCR4在胰腺肿瘤组织和癌前病变中过度表达(托马斯等, 2008；马雷查尔等, 2009). 此外，CXCR4也由胰腺CSC表达(赫尔曼等, 2007). 在这里，我们分别通过免疫印迹和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了CXCR4及其配体CXCL12在12个胰腺癌细胞系中的表达。我们的数据显示，所有被检测的胰腺癌细胞株均表达CXCR4，CXCL12（13–230）水平较低 pg/ml/10每毫升6单元格）(图1A和B). 我们在两个低分化胰腺癌细胞系MiaPaCa和Panc1中进一步测试了胰腺癌细胞对CXCL12刺激的生长反应性。在无血清和含血清培养基中用CXCL12处理细胞。在不存在血清生长因子的情况下，CXCL12刺激导致胰腺癌细胞的生长诱导率为29-33%，而在存在血清生长因子的情况下观察到适度增加（11-13%）(图1C). 这些发现表明，CXCL12–CXCR4信号在胰腺癌细胞中是活跃的，可以影响肿瘤细胞的生长。

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胰腺癌细胞中CXCR4和CXCL12的表达和生长反应。(A类)从12个胰腺癌细胞株中分离出总蛋白，并通过电泳在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行解析。随后，用抗CXCR4兔多克隆抗体对凝胶进行免疫印迹，并用抗-β-肌动蛋白（内部对照）小鼠单克隆抗体。CXCR4在所有检测的胰腺癌细胞系中均表达（不同水平）。(B类)酶联免疫吸附试验（ELISA）是在无血清条件下培养72小时的胰腺癌细胞的培养基上进行的 h使用商业套件。低水平CXCL12表达（13–230 pg/ml/10每毫升6细胞）。(C类)胰腺癌细胞（MiaPaCa和Panc1）对CXCL12治疗的生长反应（100 纳克 毫升−1)指示CXCL12–CXCR4信令轴的功能。CXCL12刺激（在缺乏血清和补充血清的培养基中）导致显著诱导(*P（P）胰腺癌细胞的生长。无血清条件下的反应比含血清培养物中的反应更明显，这可能是由于其他血清因子的补偿性生长促进作用。

CXCR4激活使胰腺癌细胞免于吉西他滨诱导的细胞毒性

尽管我们的数据表明胰腺癌细胞中CXCL12的表达最低(图1B)，据报道在基质细胞和胰腺癌转移部位高水平表达(莫里等, 2004；索尔等, 2005；松尾等, 2009). 因此，CXCL12–CXCR4信号可能以旁分泌方式影响胰腺肿瘤生长和其他恶性特性。鉴于胰腺癌细胞对化疗具有高度耐药性，而吉西他滨（一种美国食品药品监督管理局批准的药物）对这种恶性肿瘤的疗效最低，我们研究了CXCL12–CXCR4信号轴在胰腺癌化疗耐药性中的作用。我们用不同剂量的吉西他滨（0–10）治疗胰腺癌细胞（Panc1和MiaPaCa） μM（M）)有无CXCL12（100 纳克 毫升−1)在含有血清的培养基中。我们的数据表明，CXCL12治疗诱导了显著的耐药性(P（P）<0.01）对两种胰腺癌细胞株的吉西他滨细胞毒性(图2A和B). 5.0时 μM（M）与未经处理的细胞相比，我们在Panc1和MiaPaCa细胞中观察到52.3%和50.7%的细胞毒性。相反，在与CXCL12联合处理的细胞中，吉西他滨的细胞毒性分别为27.1%和20.5%，表明其具有显著的生存优势。为了证实CXCR4在CXCL12诱导的化学预防作用中的作用，用CXCR4或非靶向siRNA池瞬时转染Panc1和MiaPaCa细胞24 在有无CXCL12的情况下，吉西他滨治疗前h。结果细胞活性数据表明，当细胞沉默表达CXCR4时，CXCL12诱导的细胞保护作用被取消(补充图S1). 接下来，我们研究了CXCL12诱导的化疗耐药是否是由于其对胰腺癌细胞的抗凋亡作用、DNA片段化和caspase减少所致。我们的数据表明，CXCL12处理的细胞减少了DNA片段(图3A)caspase活性降低(图3B)与单独用吉西他滨处理的细胞相比。这些发现强烈表明，CXCL12治疗可通过吉西他滨阻止胰腺癌细胞的凋亡，并提示CXCL12诱导的生存途径的意义。

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从吉西他滨对CXCL12治疗的毒性中拯救胰腺癌细胞。两种胰腺癌细胞系Panc1(A类)和MiaPaCa(B类)，用不同剂量的吉西他滨治疗（0–10 μM（M）)在有无CXCL12（100）的补充血清条件下 纳克 毫升−1). 检测癌细胞活性72 MTT分析后处理h。显著保护胰腺癌细胞免受吉西他滨毒性的影响（5岁和10岁时 μM（M）)通过CXCL12观察。数据显示为未经处理或仅经CXCL12处理的细胞的相对存活率，以控制CXCL12的促生长作用(*P（P）<0.01).

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CXCL12治疗对吉西他滨诱导的细胞死亡的抗凋亡作用。(A类)DNA片段分析。细胞接种在6厘米的培养皿中，并用5和10处理 μM（M）不存在或存在CXCL12的吉西他滨（100 纳克 毫升−1)用于48 h.随后，分离并解析基因组DNA（2 μg每车道）。车道1：未经治疗，车道2和3：吉西他滨治疗（5和10 μM（M）)分别，以及第4和第5车道：吉西他滨治疗（5和10 μM（M）分别）在CXCL12存在下。与仅用吉西他滨治疗的细胞相比，CXCL12治疗的胰腺癌细胞的DNA阶梯减少。(B类)现场细胞凋亡的测定。将Panc1和MiaPaCa细胞培养在培养箱载玻片上，并用吉西他滨（5 μM（M）)在CXCL12（100）缺席和在场的情况下 纳克 毫升-1). 用CaspACE FITC-VAD-FMK溶液在PBS中染色2小时，检测细胞凋亡 37°C时为h。固定后，在共焦显微镜下通过荧光检测显示结合标记。代表性图片（FITC和DAPI叠加）来自未经治疗、仅吉西他滨和吉西他宾+CXCL12治疗的Panc1和MiaPaCa细胞的随机区域之一。FITC-标记标记阳性的凋亡细胞在10个随机域中计数，并以条形图表示（平均值±标准差）。*与仅经吉西他滨处理的细胞相比，差异显著。CXCL12联合处理的细胞显示吉西他滨分别降低了Panc1和MiaPaCa细胞的53%和55%的凋亡。

CXCL12治疗导致FAK、Akt和ERK激活

在接下来的一组实验中，我们研究了可能介导CXCL12诱导的化疗耐药的潜在生存信号通路。因为G蛋白偶联受体通过多种信号途径传递信号，包括激活FAK、PI3K/Akt和ERK(Rozengurt，2007年)，我们研究了这些信号分子对CXCL12治疗的反应。用CXCL12（5-30）短暂处理胰腺癌细胞（Panc1和MiaPaCa） min），并通过用磷形态特异性抗体对总蛋白进行免疫探针检测FAK、Akt和ERK的激活。我们的数据显示，在CXCL12治疗中，所有三种效应蛋白都显著激活(图4). 研究表明，Akt和ERK通过磷酸化BAD（Bcl-2家族的促凋亡成员），从而控制其与Bcl-xL或Bcl-2（家族的抗凋亡成员）的关联，从而促进生存(达塔等, 1997；Scheid和Duronio，1998年；谢里丹等, 2008). 因此，我们检测了CXCL12治疗的胰腺癌细胞中BAD磷酸化的变化。我们的数据显示，CXCL12处理的Panc1和MiaPaCa细胞系中磷酸化-BAD水平增加(图4)表明这可能是CXCL12–CXCR4信号轴保护胰腺癌细胞免受凋亡的机制之一。

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CXCL12诱导FAK、Akt和ERK通路的激活。用CXCL12（100 纳克 毫升−1)用于5、15和30 最小持续时间。蛋白质通过电泳在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上提取和分解。FAK、Akt和ERK通路的激活通过使用所示的总抗体和磷形态特异性抗体的免疫印迹法进行评估。β-Actin担任内部控制。CXCL12治疗诱导了Panc 1和MiaPaCa细胞系中所有三种效应蛋白的磷酸化，同时伴随着促凋亡BAD蛋白的失活磷酸化。

增强的转录活性β-catenin和NF-κCXCL12对胰腺癌细胞B和生存蛋白的诱导作用

除了通过BAD磷酸化直接影响凋亡信号传导外，Akt和ERK还可以对细胞存活产生间接影响。间接途径包括激活β-catenin和NF-κB可以诱导生存蛋白的表达。因此，我们检测了β-catenin和NF-κ胰腺癌细胞CXCL12治疗后的B反应性启动子。荧光素酶报告子分析表明，对β-catenin（2.05倍（Panc1）和1.92倍（MiaPaCa））和NF-κCXCL12处理细胞中的B应答启动子（2.98倍（Panc1）和2.26倍（MiaPaCa）(图5A). 作为的激活β-catenin和NF-κB可能在重要生存基因的诱导中达到顶峰，我们检测了靶向生存蛋白和抗凋亡蛋白的表达。我们的数据表明，在CXCL12治疗胰腺癌细胞的反应中，Bcl-2、Bcl-xL、Notch-1和survivin蛋白的表达显著诱导(图5B). 这些结果表明，关键生存蛋白的上调可能是CXCL12–CXCR4信号轴保护胰腺癌细胞免受吉西他滨诱导的凋亡细胞死亡的另一种机制。

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诱导β-catenin/TCF和NF-κ胰腺癌细胞中CXCL12的B转录活性和生存蛋白表达。(A类)用TOPflash或FOPflash或NF转染胰腺癌细胞-κB荧光素酶报告子构建与Renilla荧光素酶构建一起控制转染效率。用CXCL12 24处理细胞 h后转染和在被动裂解缓冲液中分离蛋白。使用双荧光素酶分析系统评估荧光素素酶活性，数据显示为正常化后荧光素酶活性的倍数变化。条形代表三倍±标准差的平均值。；*统计显著差异(P（P）<0.01). (B类)通过免疫印迹法检测CXCL12处理细胞在不同时间段内Bcl-2、Bcl-xL、Notch 1和survivin表达的变化。在CXCL12治疗的胰腺癌细胞中检测到所有四种生存蛋白的表达增加。

小分子CXCR4拮抗剂AMD3100消除CXCL12诱导的胰腺癌细胞生长和吉西他滨耐药

观察到CXCR4激活在吉西他滨耐药和生存途径增强中的作用，我们研究了小分子CXCR4拮抗剂AMD3100是否可以降低CXCL12诱导的胰腺癌细胞化疗耐药。此外，我们还利用Akt（LY294002）和ERK（PD98059）信号通路的药理抑制剂，来描述它们在CXCL12诱导的抗凋亡反应中的作用。胰腺癌细胞治疗1 在使用CXCL12单独或与吉西他滨联合治疗之前，使用AMD3100、LY294002和PD98059治疗h。AMD3100预处理可消除CXCL12诱导的胰腺癌细胞信号转导、生长促进和化疗耐药性(图6A和B). 虽然Akt和ERK通路的抑制对CXCL12诱导的化疗耐药有显著的负面影响，但观察到Akt信号传导的阻断作用更强(图6B). 这些发现表明，CXCL12介导的生存反应通过CXCR4发出信号，并通过Akt和ERK信号通路的激活介导。考虑到新的CXCL12受体CXCR7至少在转录水平上在胰腺癌细胞中的表达，这一点尤其重要（数据未显示）。

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CXCR4靶向和阻断PI3K或Erk通路对CXCL12在胰腺癌细胞中对吉西他滨诱导毒性的细胞保护作用的影响。(A类)用AMD3100（5 μ克 毫升−1)或LY294002（20 μM（M）)或PD98059（25 μM（M）)对于1 用CXCL12诱导前h。分离出总蛋白15 在CXCL12治疗后min，通过免疫印迹法检测Akt和ERK的总形态和磷酸化形态。AMD3100抑制了Akt和ERK通路的激活，而LY294002和PD98059分别特异性抑制了Att和ERK途径。(B类)用AMD3100或LY294002或PD98059或PBS预处理细胞1 h.随后，用CXCL12或吉西他滨单独或联合治疗细胞。MTT法检测细胞活力。条形代表三倍±标准差的平均值。；*统计学显著性差异(P（P）<0.01）关于吉西他滨+CXCL12处理的细胞。条形图1：未治疗，2:CXCL12治疗，3:AMD3100治疗，4:AMD3100+CXCL12处理，5:吉西他滨治疗，6:吉西他宾+CXCL12+治疗，7:AMD3100-预治疗+吉西他宾+CXCL12-治疗，8:LY294002预治疗+吉西他宾+CXCL12-治疗，9:PD98059-预处理+吉西他滨+CXCL12.治疗。

讨论

胰腺癌在大多数情况下诊断较晚，因为它已经局部进展或转移到远处(辛格等, 2004). 在这种情况下，化疗是唯一的治疗选择。然而，化疗耐药是胰腺癌的主要临床问题，而吉西他滨是FDA批准的唯一用于胰腺癌治疗的药物，仅能将患者的生存期提高2周(橄榄色等, 2009). 因此，了解胰腺癌耐药机制是胰腺癌研究的一个主要焦点，以促进新的治疗方法的开发或改进现有的治疗方法。

长期以来，趋化因子信号通过自分泌或旁分泌机制参与癌症的进展和转移(辛格等, 2007). 重要的是，在以前的研究中，趋化因子受体CXCR4在胰腺癌组织和CSC中过度表达(赫尔曼等, 2007；托马斯等, 2008；马雷查尔等, 2009)并被证明能增强胰腺癌的生长和侵袭(马切西等, 2004；莫里等, 2004；赫尔曼等, 2007). 在这里，我们研究了该信号节点在保护胰腺癌细胞免受化疗药物诱导的凋亡中的另一个方面。我们观察到，所有受试胰腺癌细胞系均表达CXCR4，但CXCL12水平较低。尽管如此，我们观察到与外源性CXCL12联合治疗可以显著保护胰腺癌细胞免受吉西他滨毒性的影响，表明CXCL12–CXCR4信号轴在胰腺癌化疗耐药中的作用。由于基质细胞大量表达CXCL12(松尾等, 2009)，这可能是肿瘤微环境相互作用在调节治疗反应中的作用的示例。为了深入了解保护作用的机制基础，我们检查了下游信号通路的激活。与以前的报告一致(格洛德克等, 2007；卢等, 2009；沈等, 2010)，CXCL12诱导FAK、Akt和ERK的激活。在最近的一项研究中，细胞外基质-整合素信号对FAK的激活被证明可以促进胰腺癌细胞的化疗耐药性(焕文等, 2009). Akt和ERK也被证明可以促进生存信号(米德尔顿等, 2008)ERK和Akt通路的组成性或诱导性激活先前与胰腺癌细胞的化疗耐药行为有关(Yokoi和Fidler，2004年；赵等, 2006). 事实上，胰腺癌细胞的FAK相关化疗耐药被证明部分通过PI3K/Akt通路的激活介导(焕文等, 2009).

Akt和ERK都能直接或间接地传递生存信号。在直接过程中，Akt和ERK被证明磷酸化了BAD，BAD是Bcl-2家族的促凋亡成员(达塔等, 1997；Scheid和Duronio，1998年；谢里丹等, 2008). 磷酸化阻止BAD与Bcl-2或Bcl-xL结合，从而抑制细胞凋亡。在间接途径中，通过激活β-catenin和NF-κB途径。ERK的激活已被证明可以促进β-磷酸化连环蛋白α-连环蛋白(季等, 2009). 此外，Akt可以激活β-通过诱导直接磷酸化或使GSK-3失活的连环蛋白β(莫尼克等, 2001；方等, 2007；科尔卡亚等, 2009). 在其他报告中，Akt途径被证明调节NF-κB、 和NF-κPI3K和Akt证明B对致癌转化至关重要(Ozes公司等, 1999；Romashkova和Makarov，1999年；Sizemore公司等, 1999；马德里等2000年). Akt诱导的NF活化-κB可能通过IKK磷酸化发生α然后瞄准IκB抑制剂蛋白和磷酸化p65 NF-κB亚基(Ozes公司等, 1999；马德里等, 2000；白等, 2009). 与这些发现一致，我们还观察到β-catenin和NF-κCXCL12治疗胰腺癌细胞中B反应性启动子和下游靶点的表达。增强的转录活性β-catenin和NF-κB已被证明能诱导上皮细胞向间充质细胞转化（EMT），在最近的研究中，EMT与胰腺癌细胞的耐药性有关(锂等, 2009；王等, 2009). 事实上，胰腺癌细胞的相对耐药性与间充质表型相关(沙阿等, 2007). 其他研究表明，对凋亡的潜在抵抗部分是由于NF的结构性激活-κ胰腺癌中的B(哈里库马尔等, 2010；王等，2010年). 我们的结果还表明，CXCL12诱导胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性可能在一定程度上也归因于NF的激活-κB和下游生存蛋白的诱导（Bcl-2、Bcl-xL、survivin等）。

小分子抑制剂的使用是一种有吸引力的靶向治疗方法。以前，我们发现小分子拮抗剂在恶性黑色素瘤中靶向趋化因子受体CXCR1和CXCR2可减少肿瘤生长、侵袭和血管生成(辛格等, 2009). 在此，我们利用CXCR4的特异性拮抗剂AMD3100靶向CXCR4激活，以响应CXCL12治疗，并证明其在消除CXCL12–CXCR4信号轴的化学保护作用方面的功效。AMD3100在对抗HIV感染方面的治疗潜力已被大量研究(2003年12月)尽管最近也有一些报道强调了其在癌症治疗中的作用(安本等, 2006；阿扎布等, 2009). 同样，我们的数据也表明AMD3100可能有助于在胰腺癌中靶向CXCL12–CXCR4信号轴。AMD3100的药代动力学和安全性已经在人类志愿者静脉注射后进行了研究，结果表明其副作用最小(亨德里克斯等, 2000). 因此，AMD3100可以作为一种新的治疗胰腺癌的药物单独或与细胞毒药物联合使用。

总之，我们的发现为CXCL12–CXCR4信号在胰腺癌中的病理作用提供了额外的支持，并首次证明了该轴在耐药性中的作用。我们的数据表明，诱导的化疗耐药性部分是由Akt和ERK信号通路的激活介导的，而针对CXCR4的小分子拮抗剂可以有效地消除生存信号，并使胰腺癌细胞对吉西他滨的细胞毒性重新敏感。因此，未来胰腺癌的临床试验可能受益于单独或联合化疗靶向该信号轴。

致谢

这项工作在一定程度上得到了美国国立卫生研究院（CA137513）的资助和美国海军陆战队司令部（USAMCI）的研究支持。

脚注

补充信息随附《英国癌症杂志》网站上的论文(网址：http://www.nature.com/bjc)

补充材料

补充图1

补充图图例

工具书类

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文章来自英国癌症杂志由以下人员提供英国癌症研究