国际癌症杂志。作者手稿；PMC 2010年12月15日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院133558
Akt介导的NFκB调控及NFκ）B对PI3K和Akt致癌性的重要性
斯克里普斯研究所，分子和实验医学部，10550 N.Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037，USA
摘要
丝氨酸/苏氨酸激酶Akt（小鼠胸腺瘤病毒akt8癌基因的细胞同源物），也称为PKB（蛋白激酶B），由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的脂质产物激活。Akt磷酸化许多控制细胞存活、增殖和运动的蛋白质靶点。先前的研究表明，Akt通过诱导κB抑制剂（IκB）的磷酸化和随后的降解来调节核因子-κB（NFκB）的转录活性。我们在这里显示，肉豆蔻酰化Akt（myrAkt）转化的鸡胚成纤维细胞（CEF）中NFκB驱动的转录增加。因此，Akt和Akt抑制剂的显性阴性突变体均抑制NFκB依赖性转录。在Akt转化的细胞中，IκB蛋白的降解强烈增强，而NFκB超表达物IκBSR的引入导致NFκ子B活性的丧失，干扰了PI3K-和Akt诱导的CEF致癌转化。在Akt转化细胞中，丝氨酸534处NFκB p65亚单位的磷酸化也上调。我们的数据表明，Akt对NFκB的刺激依赖于S534处p65的磷酸化，由IKK（IκB激酶）α和β介导。Akt磷酸化T23上的IKKα，该磷酸化事件是IKKβ和α在S534磷酸化p65的先决条件。我们的结果证明了IKK复合体在具有组成性Akt活性的细胞中NFκB激活中的两个独立功能：IκB的磷酸化和随后的降解以及p65的磷酸化。这些数据进一步支持了以下结论：NFκB活性对PI3K和Akt诱导的致癌转化至关重要。
关键词：NF-κB、PI-3激酶、Akt、IKK、IκB，致癌转化
介绍
核因子-κB（NFκB）是一个转录因子家族，调节与炎症、先天性和适应性免疫反应相关的多种细胞活动。1NFκB活性的放松调节与自身免疫性疾病和癌症的发展有关。2NFκB的常见形式是p65/RelA-p50。在大多数细胞类型中，p65/RelA-p50异二聚体被κB抑制剂（IκB）隔离在细胞质中，因为IκB结合掩盖了p65的核定位序列。刺激后，IκB在关键丝氨酸残基处磷酸化，导致多泛素化和26S蛋白酶体降解。然后，p65/RelA-p50二聚体转移到细胞核，与靶基因增强子区域的特定NFκB位点结合，并调节转录活性。三
除了穿梭于细胞核内外外，NFκB蛋白还通过磷酸化、乙酰化或泛素化进行翻译后修饰。这些修饰可以微调NFκB的活性，并可以改变其对不同启动子的结合特异性。4
NFκB信号级联与几个平行通路相互作用，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和Akt启动的信号级联。5-7两种PI3K抑制剂，LY294002和Wortmanin，阻断了白细胞介素（IL）-1诱导的NFκB DNA结合活性的增加。8作为PI3K的关键下游靶点，Akt被认为是IKK（IκB激酶）激酶。9IKK复合物主要由催化亚单位IKKα和IKKβ以及调节亚单位IKγ/NEMO（NFκB必需调节剂）组成。
在这里，我们表明，组成活性Akt通过IKKα亚单位中T23的磷酸化刺激IKK活性。然后，IKK复合物磷酸化IκB蛋白和p65/RelA亚单位，诱导NFκB转录因子的增强激活。通过过度表达不可降解的IκB抑制NFκB强烈干扰Akt或PI3K诱导的致癌转化。
材料和方法
质粒和诱变
编码小鼠p65、p50和NFκB（IκBSR）非降解超表达物的质粒12是Inder M.Verma博士的礼物。来自Stratagene（加利福尼亚州拉荷亚）的NFκB启动子报告子包含5个NFκ子B二聚体的单独结合位点（TGGGGACTTTCCGC）5描述了肉豆蔻酰化Akt和显性阴性Akt-T308A/S473A表达载体。13FLAG-IKKα和FLAG-IKβ载体是Thomas D.Gilmore博士赠送的礼物。使用QuikChange®II Site-Directed Mutagenesis kit（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内）在p65的276、527和534位置以及p50的335位置从S突变为A或D。
抗体和化学品
针对IκBα、p65和p50的多克隆抗体来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。抗FLAG抗体M2来自西格玛化学公司（密苏里州圣路易斯）。抗磷蛋白p65（S534）、IKKα、IKK-β和GST从Cell Signaling（加州贝弗利）获得。单克隆抗AU1标签抗体来自Covance Research Products Inc.（宾夕法尼亚州丹佛）。Akt抑制剂IV和V购自Calbiochem（加州La Jolla）。
使用禽逆转录病毒载体RCAS进行细胞培养、转染和感染
受精鸡蛋（白色Leghorn）是从查尔斯河育种实验室（马萨诸塞州威明顿）获得的。原代鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备和培养在前面已有描述。14简言之，CEF保存在37°C、5%CO、37°C下添加10%FBS（Omega Scientific Inc.，Tarzana，CA）、5%鸡血清（Sigma，St Louis）、1×MEM维生素溶液（Sigma-，St路易斯，MO）、8 mg/L叶酸和1%L-谷氨酰胺-苄青霉素溶液（Sigrama，St Louis，MO2对于干扰分析，使用2μg B亚群RCAS（复制有能力的ALV LTR与拼接受体）禽逆转录病毒载体进行稳定转染15采用二甲基亚砜/聚砜法（DMSO冲击法）进行。16传代2至3代后，将细胞接种到6孔板上，并感染以下病毒和载体：PR-A（Rous肉瘤病毒布拉格株），携带v-src公司癌基因；ASV17，表示v军癌基因；17，18表达肉豆蔻酰化Akt的A亚组RCAS载体(梅拉克)和表达PI3K肉豆蔻酰化催化亚基的亚群A RCAS载体(我的P3K).13，19每隔3天用营养琼脂喂养细胞，10至14天后用2%结晶紫在20%甲醇中染色。20人胚胎肾细胞HEK293在补充有50单位青霉素和链霉素/ml和10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。将人类乳腺癌细胞系BT-20（美国型培养物收集中心，弗吉尼亚州马纳萨斯）保存在补充了10%胎牛血清、0.1 mM非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠和L-谷氨酰胺的DMEM中，保存温度为37°C。根据制造商的说明，使用PolyFect转染试剂（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根）转染BT-20细胞。
荧光素酶检测
使用PolyFect转染试剂对细胞进行转染。CEF或BT-20细胞以4×10接种于MP-24组织培养板中4或6×104每个孔的细胞数。转染后48小时，用PBS清洗培养物，然后在200μl 1×被动溶出缓冲液（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）中溶解。萤火虫荧光素酶活性和雷尼利亚使用双荧光素酶报告分析系统（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）和Berthold Biolumat LB 9501光度计测量荧光素素酶活性。萤火虫荧光素酶活性根据雷尼利亚荧光素酶活性。每组实验重复至少三次，结果一致。
代谢标记和免疫沉淀
矢量控制或CEF转换为梅拉克用无磷F-10清洗两次，然后用含有1 mCi/ml的培养基培养[32P] 正磷酸盐（Perkin Elmer Life Sciences，Boston，MA）3 h。细胞在1×被动溶解缓冲液中溶解，并用抗p65抗体进行免疫沉淀。沉淀蛋白用冷细胞裂解缓冲液洗涤三次，然后通过Western印迹和放射自显影术进行分析。
蛋白质斑点
细胞在含有蛋白酶抑制剂混合物的Nonide P-40裂解缓冲液（20 mM Tris·HCl，pH 7.5/150 mM NaCl/10%甘油/1%Nonide P40/10 mM NaF/1 mM焦磷酸钠/1 mM原钒酸钠）中裂解。在冰上孵育15分钟后，以13000 rpm离心15分钟，去除细胞碎片。对于免疫印迹，用SDS-PAGE分离含有60μg蛋白质的裂解物，并转移到Immobilon-P膜（Millipore，Billerica，MA）。在室温下，用5%脱脂干乳、Tris缓冲盐水和0.05%吐温20封闭膜1小时，然后用一级抗体探测过夜。与辣根过氧化物偶联抗体孵育后，通过化学发光观察到反应带（Pierce，Rockford，IL）。对于免疫沉淀，细胞提取物与1μl一级抗体孵育4 h，然后与30μl蛋白A-琼脂糖珠孵育1 h（Pierce，Rockford，IL）。用裂解缓冲液洗涤珠子三次，并通过SDS-PAGE和化学发光分析样品。
体外激酶测定
在含有蛋白酶抑制剂混合物（罗氏，印第安纳波利斯，in）和1 mM PMSF/50 mM NaF/1 mM Na的被动裂解缓冲液中裂解细胞三VO（旁白）4.200μl上清液（细胞裂解液）与抗HA标记琼脂糖在4°C下孵育。将产生的免疫沉淀与1μl[γ-32P] ATP（1.0μCi/μl in dH2O、 Perkin Elmer Life Sciences，Boston，MA）和激酶缓冲液中的底物（25 mM HEPES pH7.5，25 mMβ-甘油磷酸，25 mM-MgCl2，2 mM二硫苏糖醇，0.1 mM钠三VO（旁白）4，20μM ATP），并在30°C下孵育30分钟。用冷激酶缓冲液洗涤两次磷酸化蛋白，然后用SDS-PAGE分离并通过放射自显影检测。使用1μg细菌表达的GST融合蛋白IKKα（1-101）、IKKβ（1-101”）或p65（335-550）作为底物。
结果
组成活性Akt增加NFκB结合位点的转录
以前的研究表明，组成活性的Akt或PI3K的组成活性催化亚单位可以在培养基中转化CEF并诱导雏鸡肿瘤。13，21据报道，NFκB在肿瘤发生中起重要作用，并参与PI3K/Akt途径。5-7，9，22为了更好地理解和阐明NFκB在PI3K或Akt诱导的致癌转化中的功能重要性，我们转染了一种肉豆蔻酰化形式的Akt，即myrAkt，13进入CEF。myrAkt的稳定表达导致细胞转化，伴随着S473处Akt和S65处下游靶点4EBP1的磷酸化(). 与转染空RCAS载体的对照细胞相比，这些细胞显示内源性NFκB活性增加(). 用不能被磷酸化激活且缺乏激酶活性的显性阴性Akt突变体T308A/S473A（Akt-AA）瞬时转染Akt转化的细胞13以剂量依赖的方式降低NFκB介导的转录。我们得出结论，Akt介导的NFκB活性增强依赖于Akt激酶活性。
Akt促进NFκB驱动的转录。（A） 使用DMSO方法用载体控制或myrAkt转染CEF。162至3代后，将100 ng p5×κB萤火虫报告质粒和5 ng pRL-CMV转染细胞雷尼利亚荧光素酶结构。将Akt突变体（T308A/S473A，Akt-AA）瞬时转染到0.5μg（Akt-AA-1）和1μg（Ekt-AA-2）的Akt转化CEF中。48小时后，用双荧光素酶报告试验测定荧光素素酶活性。（B） 来自（A）的细胞裂解液中磷酸化Akt（S473）、磷酸化4EBP1（S65）和肌动蛋白的Western分析。（C） 在用DMSO、Akti-IV（62.5nM）或Akti-V（2μM）预处理4 h的P3K转化细胞中进行NFκB驱动的荧光素酶转录检测。通过Western blotting（D）检测S473的总Akt和磷酸化Akt。（E） 在人类BT-20乳腺癌细胞中进行了NFκB驱动的报告细胞分析。用100 ng p5×κB萤火虫报告质粒和5 ng pRL-CMV转染细胞雷尼利亚荧光素酶结构。在收集细胞裂解物前2 h添加Akt抑制剂、Akti-IV（1μM）和Akti-V（2μM）。分别以0.5和1μg的浓度将Akt-AA突变体与报告质粒联合转染。（F） （E）细胞裂解物中磷酸化Akt（S473）、磷酸化4EBP1（S65）和肌动蛋白的Western blot分析。所示数据为三个实验的平均值±标准偏差（SD）。荧光素酶活性以相对单位表示（萤火虫荧光素蛋白酶活性超过雷尼利亚荧光素酶活性）。
Akt抑制剂降低NFκB依赖性转录
Akt是PI3K激活后信号转导的关键成分。两种Akt抑制剂Akti-IV和Akti-V可以有效阻止Akt在T308和S473的磷酸化，并抑制Akt激酶活性。23，24我们将含有PI3K的肉豆蔻酰化催化亚基p110α（myrP3K）的表达载体引入CEF，从而导致Akt的致癌转化和激活。21抑制剂降低S473上Akt的活化磷酸化(). 用Akt抑制剂Akti-IV和Akti-V处理这些细胞2小时也降低了报告者检测中显示的NFκB转录活性(). 为了证明Akt对NFκB活性的调节延伸至人类癌细胞，我们在BT-20乳腺癌细胞中重复了NFκ·B介导的荧光素酶报告试验。BT-20细胞在PI3K催化亚基p110α（P539R和H1047）中含有两个获得功能的突变，因此，Akt的磷酸化增加。25与在CEF中进行的实验一致，Akt的显性阴性突变和Akt抑制剂Akti-IV和Akti-V均导致NFαB活性降低().
IκB蛋白在Akt转化细胞中降解，这种降解是PI3K和Akt诱导的致癌转化的先决条件
NFκB的活性通过与IκB抑制剂蛋白的结合而受到严格控制，从而阻止NFκ的B进入细胞核。一旦在几个NH被IKK复合物磷酸化2-末端丝氨酸IκB与NFκB亚单位分离，被蛋白酶体泛素化并迅速降解。三我们检查了Akt转化细胞中IκB蛋白的内源性水平，发现IκB蛋白的总量显著减少(，顶部）。用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，262小时后IκB恢复正常水平(，下半部）。这一结果表明，Akt转化细胞中IκB蛋白水平的降低是由蛋白水解降解引起的，而不是由IκB表达的降低引起的。
IκB在Akt转化细胞中降解。用DMSO或蛋白酶体抑制剂MG132（2μM）处理转染载体控制的CEF、HA标记的myrAkt（Akt）或HA标记的Akt-T308A/S473A（Akt-AA）2 h。收集全细胞裂解物，电泳并用IκBα、磷酸-S473-Akt、HA或肌动蛋白抗体进行免疫印迹。所提供的数据代表了三个独立的实验。
为了测试IκB蛋白在Akt诱导的细胞转化中的功能意义，我们在CEF中表达了NFκB超表达物（IκBSR），方法是使用带有B亚群包膜蛋白的RCAS载体，然后用携带A亚群包络蛋白的转化RCAS构建物进行激发感染，并表达v-src公司，我的3k，梅拉克或v军致癌基因。IκBSR的过度表达对CEF无毒，并诱导了对转化的强烈抵抗我的3k和梅拉克.IκBSR在通过v军和v-src公司(，).
IκBSR优先干预P3K或Akt诱导的肿瘤转化。用RCAS（B）-IκBSR或空载体转染CEF，培养10天。（A） 用抗IκBα抗体进行Western blotting证实IκBSR的表达。（B） 然后使用A亚群包膜蛋白和携带致癌基因的细胞感染致癌病毒v-src公司，我的3k（PI3K），梅拉克和v军。病毒稀释液（10的指数）显示在每个孔的角落。IκBSR通过我的3k或梅拉克（参见。). 实验至少重复了三次。这里提供的数据来自一个具有代表性的实验。
表1
| RCAS矢量控制
| IκBSR
|
|---|
| 癌蛋白 | FFU/毫升 | EOT公司 | FFU/毫升 | EOT公司 |
|---|
| v-Src公司 | 9×105 | 1 | 3×105 | 0.3 |
| 我的P3K | 3×10三 | 1 | 2×102 | 0.07 |
| 马尔阿克特 | 2.8×106 | 1 | 1.2×105 | 0.04 |
| v-Jun公司 | 1.8×105 | 1 | 6×104 | 0.3 |
在Akt转化细胞中NFκB的p65亚单位被磷酸化
最近的研究集中于NFκB的翻译后修饰，并阐明了磷酸化对NFκ的转录活性的关键重要性。27p65 NFκB亚单位的磷酸化增加转录活性。28因此，我们分析了体内Akt转化细胞中p65的磷酸化状态和检测到的32P标记为p65。Western blot测定的对照细胞和转化细胞中p65的总量具有可比性().
在Akt转化细胞中诱导p65磷酸化。转染载体控制或myrAkt的CEF与[32P] 正磷酸盐3小时，用被动溶解缓冲液溶解。用p65抗体免疫沉淀内源性p65。通过放射自显影检测磷酸化p65(顶部面板). Western blots证实了等量的p65负载和p50的Co-IP(中间面板). 使用抗HA抗体显示Akt的表达(底部面板).
Akt介导p65中S534的磷酸化
一些研究表明，NFκB的磷酸化反应于各种刺激。1单个磷酸化位点由单个或多个激酶靶向。29p50的S335上的磷酸化增加了该亚单位的DNA结合能力。30，31p65的S276被蛋白激酶A和有丝分裂原和应激活化蛋白激酶磷酸化，是cAMP反应元件结合蛋白/p300向p65募集所必需的。32酪蛋白激酶Ⅱ对S527的磷酸化作用33和S53434TNF和LPS刺激后，转录活性增加。S276在NH范围内2-末端Rel同源性35介导二聚和DNA结合的结构域。p65的S527和534位于COOH末端反式激活域中，在人类和小鼠蛋白质中保守（本文中的残基数是指所有实验中使用的小鼠p65）。1
为了确定在NFκB的Akt依赖性调节中至关重要的磷酸化事件，我们分别对p50中的S335和p65中的S276、527和534进行突变。我们产生了缺磷突变体（S至A）和拟磷突变体（S至D）。然后，我们在报告分析中测试了这些突变体对组成活性Akt的转录活性增加和对显性阴性Akt活性降低的反应能力。影响磷酸化位点的突变对于Akt介导的NFκB调节来说是非必要的，但仍会显示Akt的积极作用和显性阴性Akt所产生的消极作用。Akt-NFκB连接所必需的磷酸化位点的突变将不再传递Akt诱导的NFκB活性的调节。结果总结如下通过这一测量，只有一个磷酸化位点被确定为Akt到NFκB信号传导的必需位点：p65的S534。该观察结果表明，S534是连接p65和Akt的关键残基。在Akt转化的细胞中确实检测到S534磷酸化的p65水平增加()因此，Akt还诱导S534上p65的磷酸化体内.
Akt介导S534处的p65磷酸化。（A） 将感染载体控制、myrAkt或显性阴性Akt的CEF瞬时转染150 ng不同p65突变体和150 ng p50野生型或150 ng p65野生型和150 ng突变体，以及100 ng p5×κB和5 ng pRL-CMV报告质粒。48小时后，对细胞裂解物进行萤光素酶活性测定。所有p65或p50突变体仍然对Akt有反应，在myrAkt CEF中表现出活性增加，在Akt AA CEF中表现出活性降低，p65的S534突变体除外，其中Akt的作用被消除。（B） CEF与载体（对照）或HA-Akt和AU1-p65共同感染。传代2～3代后，用抗AU1琼脂糖免疫沉淀全细胞裂解物，电泳并用磷酸化S534-p65和p65抗体免疫印迹。使用抗HA抗体显示Akt的表达。
IKKs桥接Akt和NFκB
p65的S534附近的侧翼序列不符合Akt磷酸化的共识(). 因此，Akt不太可能直接磷酸化p65。然而，该位点与IKKβ磷酸化共识序列相匹配，36IKKα在T23有一个完美的Akt磷酸化位点。9这一信息表明，IKK复合体可能将Akt与p65连接起来。
p65和IKK的磷酸化在体外和体内（A）与潜在底物相比，围绕Akt和IKK共识序列的氨基酸序列的比对。预测的磷酸化位点用粗体字母表示。（B） 用HA-myrAkt转染CEF。传代2～3代后，用抗HA琼脂糖免疫沉淀Akt。使用GST、GST-IKKα（1-101或1-101/T23A）和GST-IKβ（1-101）作为底物进行放射性激酶分析，详见材料和方法(上部面板). HA-Akt和总GST或GST-IKK的水平显示为负载控制。（C） 内源性IKKα从转染myrAkt的HEK239细胞裂解物中免疫沉淀。使用GST和GST-p65（335-550或335-550/S534A）作为底物进行放射性激酶分析(上部面板). 免疫沉淀蛋白用IKKα、IKKβ或GST抗体进行免疫印迹，作为负荷对照。（D） IKKs催化p65磷酸化体内将2μg AU1-p65与2μg IKKβ和IKKα或IKK a-T23A共转染BT-20细胞。以AU1-p65和pcDNA共转染作为对照。用磷酸化S534-p65或p65抗体对α-AU1免疫沉淀蛋白进行免疫印迹。使用IKKα和IKKβ抗体对全细胞裂解物进行Western blot。
Akt催化IKKα在T23的磷酸化在体外以前报告过9，我们在系统中确认了这一结果(). 在一个在体外激酶分析，免疫沉淀HA-myrAkt与GST、GST标记NH孵育2-IKKα或IKKβ的末端片段（1-101）。只有IKKα被Akt磷酸化，而没有IKKβ，后者没有对应于IKK a T23的磷酸化位点。IKKαT23A突变体未磷酸化。使用来自免疫沉淀物的Akt或GST抗体进行的Western blot表明，每个反应中都存在等量的Akt-和底物(). 这些结果表明Akt在T23磷酸化IKKα在体外.
然后我们检测了IKK是否可以在S534磷酸化p65。樱井等报道了内源性IKK复合物、过度表达的IKK和重组IKKβ可以磷酸化p65的S534在体外我们没有通过在Akt转化细胞中过度表达IKKα或IKKβ观察到p65磷酸化（数据未显示），因此提示体内IKKα和IKKβ都有助于p65中S534的磷酸化。我们使用抗IKKα琼脂糖从表达myrAkt的HEK 293细胞免疫沉淀内源性IKK(). p65的COOH末端（335-550）片段被该IKK复合物磷酸化，而p65的S534A突变体没有磷酸化。Western blot显示IKK激酶检测中同时存在IKKα和IKKβ。
我们通过联合转染带有AU1标记的p65和标记的IKK的BT20人乳腺癌细胞来检测IKKα中T23磷酸化的功能意义。与没有IKK的基础水平相比，IKK复合物增加了S534的p65磷酸化。然而，IKK复合物与IKKα中T23A突变的联合转染未能刺激p65 S534磷酸化(). 我们得出结论，T23对p65中S534上的IKK激酶活性很重要。
然后我们检测了IKKα突变体对NFκB报告活性的影响。当空载体（对照）与NFκB萤光素酶报告基因构建体（对照）共转染BT20细胞或Akt转化的CEF时，记录到高水平的NFκB转录活性(). 在myrAkt-CEF中，野生型IKKα未能进一步增强报告活性()，可能是因为NFκB的活性水平已经达到饱和状态。非活性IKKα-T23A突变体的表达在Akt转化的CEF中也没有显示出明显的效果，可能是出于同样的原因(). 在BT20细胞中，T23A突变降低了NFκB活性。重要的是，显性阴性IKKα-S176A/S180A突变体（AA）在Akt转化的CEF和BT-20细胞中强烈抑制了NFκB报告活性的增强，证实了NF kb B活性对IKKβ激酶活性的依赖性。三重突变体IKKα-T23A/S176A/S180A（AAA）的表达与IKKβ-S176A/S180A相比活性进一步降低().
Akt通过IKK激活NFκB。（A） 通过myrAkt转化的CEF转染300 ng pcDNA载体（对照）或编码IKKα野生型（IKK A）或突变体T23A、S176A/S180A（AA）或T23A/S176A/S180A（AAA）的构建物，以及100 ng的p5×κB和5 ng的pRL-CMV报告质粒。48小时后，测定荧光素酶活性。（B） 将300 ng pcDNA载体（对照）或IKKα突变体T23A、AA和AAA转染BT-20细胞，如（A）所示。用FLAG或肌动蛋白抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹。误差条表示三次转染实验的标准偏差。
讨论
这项研究有助于我们理解Akt和NFκB之间的联系。Akt通路积极参与NFκB的调节，NFκ的B活性对于PI3K和Akt的致癌转化至关重要。5-7，9，22在获得Akt功能的细胞中，NFκB的转录活性上调，Akt的抑制干扰NFκ的上调。在肉豆蔻酰化Akt转化的CEF中，IκB蛋白的降解大大增强，p65 NFκB亚基的磷酸化增加。我们的数据排除了Akt直接磷酸化p65或p50 NFκB亚基的可能性。这两种蛋白都不包含Akt磷酸化共识序列，并且Akt在在体外激酶分析。相反，我们的观察结果表明，根据已发表的研究，Akt磷酸化IKKα。9然后，IKK复合物不仅靶向IκB抑制剂蛋白，而且与之前的观察结果一致，还磷酸化p65 NFκB亚单位。22，34，37，38因此，IKK复合物以IκB和NFκB p65蛋白为靶点，并作为Akt和NF kb之间的中介物发挥作用。NFκB p65和IκB位于相同的细胞隔室中，并以类似的时间依赖性模式磷酸化。34推测的IKK磷酸化位点p65，S534与IKKβ一致序列相匹配，位于COOH末端反式激活域1，在人类、小鼠、鸡和爪蟾中保守。该残基的磷酸化消除了与p65中邻近的D531残基的氢键，并导致p65与TAFII31（基础转录机制的组成部分）的有效结合。同时，磷酸化降低了p65对转录共抑制因子AES（Split的氨基末端增强因子）的亲和力。这种亲和力的变化表明了通过磷酸化激活NFκB的可能机制。39一般来说，提供额外负电荷的磷酸基团可能会增强NFκB酸性激活域的转录活性。40我们的数据记录了磷酸化级联反应的功能意义，该级联反应起源于Akt，通过IKKα的T23到p65的S534进行。
Akt和NFκB之间的信号传递是复杂的，并且公布的数据包含几个看似矛盾的观察结果。至少其中一些差异可能反映了不同细胞类型和信号条件的使用。例如，Sizemore等。表明PI3K/Akt对p65的磷酸化和活化是必需的，p65对TNF和IL-1的反应，而Akt介导的NFκB活化需要IKK活性。6，41相比之下，杨等。据报道，在小鼠巨噬细胞中，LPS在S534诱导的p65磷酸化不受PI3K抑制剂LY294002的影响。42Ozes和同事9发现Akt是TNFα诱导NFκB活化的重要介质，通过T23处IKKα的磷酸化起作用，但这一发现受到了Delhase及其同事的挑战。43
对Akt信号成分基因失活细胞的研究产生了一些令人惊讶的结果。糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的缺失会干扰TNFα诱导的NFκB活化，令人惊讶的是，甚至会干扰TNF-α触发的Akt活化。44结节性硬化症复合物1/2蛋白（TSC1/TSC2）缺陷的细胞在TNFα诱导的NFκB激活中也有缺陷，这种缺陷可以通过雷帕霉素消除，这表明在这个星座中，mTOR是TNFα-NFκB信号的负调节器。45相反，PTEN阴性细胞依赖mTOR Rictor复合物进行TNFα诱导的NFκB激活。46，47这些不同的观察结果表明，细胞外刺激对NFκB的激活可能受到许多信号成分的影响，并且这些影响取决于细胞的生理条件和遗传构成。NFκB除了是免疫反应的中心协调器外，还是癌症发展和进展的重要因素。27，48，49病毒蛋白v-rel型（同系物c-rel公司)最初被鉴定为逆转录病毒癌基因。50，51许多肿瘤表现出由基因改变引起的NFκB活性的组成性升高，包括IκB基因的功能丧失突变或上游调控因子（如IKK）的激活。27阻断NFκB活性可降低致瘤性。52-54我们的结果表明，IκBSR对NFκB活性的抑制可诱导对P3K或Akt诱导的致癌转化产生强烈的选择性抵抗，这表明核因子κB在这些癌蛋白诱导的转化机制中起着重要作用。从现有数据中无法确定IκB降解与p65磷酸化在介导转化中的相对重要性。然而，鉴于PI3K通路在许多人类癌症中失调，NFκB活性对PI3K/Akt致癌性的重要性尤为重要。PI3K和Akt被认为是有希望的癌症靶点，在寻找治疗有效的抑制剂时需要考虑这些癌蛋白对NFκB的依赖性。
在Akt转化的CEF和BT20人乳腺癌细胞中，通过Akt的信号上调，下游靶点GSK-3β、核糖体蛋白S6激酶和真核翻译起始因子4E-结合蛋白均磷酸化。16，25Akt在这些细胞中的组成活性定义了一个与PI3K-Akt-TOR通路中功能增强的其他细胞共享的信号通路。这些类型的细胞可能会通过IKK复合物显示激活的Akt到p65的直接信号，这是本文所示的数据所暗示的。该途径是否也适用于所有外部刺激诱导的NFκB激活，将由未来的研究决定。
致谢
我们感谢Sohye Kang博士和Jonathan Hart博士的有益讨论。我们还感谢安贾·泽姆布里奇奇（Anja Zembrzycki）和朝阳博士对手稿的批判性阅读。这项工作得到了国家癌症研究所的资助。这是斯克里普斯研究所19902号手稿。
缩写
| 阿克特 | 小鼠胸腺瘤病毒的细胞同源物akt8（akt8）癌基因 |
| 马尔阿克特 | 肉豆蔻酰化Akt |
| 巴基斯坦中央银行 | 蛋白激酶B |
| PI3K系列 | 磷脂酰肌醇3-激酶 |
| 我的P3K | PI3K的肉豆蔻酰化催化亚基 |
| 核因子κB | 核因子-κB |
| IκB | κB抑制剂 |
| 首席执行官 | 鸡胚成纤维细胞 |
| 伊克 | IκB激酶 |
| IκBSR | NFκB超表达 |
| 伊利诺伊州 | 白细胞介素 |
| NEMO公司 | NFκB必需调节剂 |
| 二甲基亚砜 | 二甲基亚砜 |
| PR-A公司 | 劳斯肉瘤病毒布拉格株 |
| 高铁293 | 人胚胎肾细胞 |
| DMEM公司 | Dulbecco改良的Eagle's培养基 |
| FBS公司 | 胎牛血清 |
| 肿瘤坏死因子α | 肿瘤坏死因子α |
| 液化石油气 | 脂多糖 |
| GSK3β | 糖原合成酶激酶3β |
| TSC1/TSC2 | 结节性硬化1/2 |
| mTOR公司 | 雷帕霉素的哺乳动物靶点 |
| PTEN公司 | 10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物 |
| TAFII31号机组 | 转录因子II31 |
| AES公司 | Split氨基末端增强剂 |
工具书类
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