跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2009年12月15日；125(12):2863-70.
doi:10.1002/ijc.24748。

Akt介导的NFkappaB调控及NFkappa B对PI3K和Akt致癌性的重要性

董白 1, 林恩·尤诺, 彼得·K·沃格特
附属公司

Akt介导的NFkappaB调控及NFkappa B对PI3K和Akt致癌性的重要性

董白等。 国际癌症杂志. .

摘要

丝氨酸/苏氨酸激酶Akt（小鼠胸腺瘤病毒akt8癌基因的细胞同源物），也称为PKB（蛋白激酶B），由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的脂质产物激活。Akt磷酸化许多控制细胞存活、增殖和运动的蛋白质靶点。先前的研究表明，Akt通过诱导κB抑制剂（IkappaB）的磷酸化和随后的降解来调节核因子κB（NFkappaB）的转录活性。我们在这里显示，NFkappaB驱动的转录在肉豆蔻酰化Akt（myrAkt）转化的鸡胚成纤维细胞（CEF）中增加。因此，Akt和Akt抑制剂的显性负突变体均抑制NFkappaB依赖性转录。在Akt转化的细胞中，IkappaB蛋白的降解强烈增强，NFkappaB-超表达物Ikappa BSR的引入导致NFkappa B活性的丧失，干扰了PI3K-和Akt诱导的CEF致癌转化。在Akt转化细胞中，丝氨酸534处NFkappaB p65亚单位的磷酸化也上调。我们的数据表明，Akt对NFkappaB的刺激依赖于S534处p65的磷酸化，由IKK（IkappaBkinase）α和β介导。Akt在T23上磷酸化IKKalpha，该磷酸化事件是IKKalbha和β在S534磷酸化p65的先决条件。我们的研究结果证明了IKK复合物在具有组成型Akt活性的细胞中的NF-κB激活中的两个独立功能：IkappaB的磷酸化和随后的降解以及p65的磷酸化。数据进一步支持了NFkappaB活性对PI3K和Akt诱导的致癌转化至关重要的结论。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
Akt促进NFκB驱动的转录。（A） 使用DMSO方法用载体控制或myrAkt转染CEF。2至3代后，将100 ng p5×κB萤火虫报告质粒和5 ng pRL-CMV转染细胞雷尼利亚荧光素酶结构。将Akt突变体（T308A/S473A，Akt-AA）瞬时转染到0.5μg（Akt-AA-1）和1μg（Ekt-AA-2）的Akt转化CEF中。48小时后，用双荧光素酶报告试验测定荧光素素酶活性。（B） 来自（A）的细胞裂解液中磷酸化Akt（S473）、磷酸化4EBP1（S65）和肌动蛋白的Western分析。（C） 在用DMSO、Akti-IV（62.5nM）或Akti-V（2μM）预处理4 h的P3K转化细胞中进行NFκB驱动的荧光素酶转录检测。通过Western blotting（D）检测S473的总Akt和磷酸化Akt。（E） 在人类BT-20乳腺癌细胞中进行了NFκB驱动的报告细胞分析。用100 ng p5×κB萤火虫报告质粒和5 ng pRL-CMV转染细胞雷尼利亚荧光素酶结构。在收集细胞裂解物前2 h添加Akt抑制剂、Akti-IV（1μM）和Akti-V（2μM）。分别以0.5和1μg的浓度将Akt-AA突变体与报告质粒联合转染。（F） （E）细胞裂解物中磷酸化Akt（S473）、磷酸化4EBP1（S65）和肌动蛋白的Western blot分析。所示数据为三个实验的平均值±标准偏差（SD）。荧光素酶活性以相对单位表示（萤火虫荧光素蛋白酶活性超过雷尼利亚荧光素酶活性）。
图2
图2
IκB在Akt转化细胞中降解。用DMSO或蛋白酶体抑制剂MG132（2μM）处理转染载体控制的CEF、HA标记的myrAkt（Akt）或HA标记的Akt-T308A/S473A（Akt-AA）2 h。收集全细胞裂解物，电泳并用IκBα、磷酸-S473-Akt、HA或肌动蛋白抗体进行免疫印迹。所提供的数据代表了三个独立的实验。
图3
图3
IκBSR优先干预P3K或Akt诱导的肿瘤转化。用RCAS（B）-IκBSR或空载体转染CEF，培养10天。（A） 用抗IκBα抗体进行Western blotting证实IκBSR的表达。（B） 然后使用A亚群包膜蛋白和携带致癌基因的细胞感染致癌病毒v-src公司，我的3k（PI3K），梅拉克和v军。病毒稀释液（10的指数）显示在每个孔的角落。IκBSR通过我的3k或梅拉克（参见表1）。实验至少重复了三次。这里提供的数据来自一个具有代表性的实验。
图4
图4
在Akt转化细胞中诱导p65磷酸化。转染载体控制或myrAkt的CEF与[32P] 正磷酸盐3小时，用被动溶解缓冲液溶解。用p65抗体免疫沉淀内源性p65。通过放射自显影检测磷酸化p65(顶部面板). Western blots证实了等量的p65负载和p50的Co-IP(中间面板). 使用抗HA抗体显示Akt的表达(底部面板).
图5
图5
Akt介导S534处的p65磷酸化。（A） 将感染载体控制、myrAkt或显性阴性Akt的CEF瞬时转染150 ng不同p65突变体和150 ng p50野生型或150 ng p65野生型和150 ng突变体，以及100 ng p5×κB和5 ng pRL-CMV报告质粒。48小时后，对细胞裂解物进行萤光素酶活性测定。所有p65或p50突变体仍然对Akt有反应，在myrAkt CEF中表现出活性增加，在Akt AA CEF中表现出活性降低，p65的S534突变体除外，其中Akt的作用被消除。（B） CEF与载体（对照）或HA-Akt和AU1-p65共同感染。传代2～3代后，用抗AU1琼脂糖免疫沉淀全细胞裂解物，电泳并用磷酸化S534-p65和p65抗体免疫印迹。使用抗HA抗体显示Akt的表达。
图6
图6
p65和IKK的磷酸化在体外和体内（A）与潜在底物相比，围绕Akt和IKK共识序列的氨基酸序列的比对。预测的磷酸化位点用粗体字母表示。（B） 用HA-myrAkt转染CEF。传代2～3代后，用抗HA琼脂糖免疫沉淀Akt。使用GST、GST-IKKα（1-101或1-101/T23A）和GST-IKβ（1-101）作为底物进行放射性激酶分析，详见材料和方法(上部面板). HA-Akt和总GST或GST-IKK的水平显示为负载控制。（C） 内源性IKKα从转染myrAkt的HEK239细胞裂解物中免疫沉淀。使用GST和GST-p65（335-550或335-550/S534A）作为底物进行放射性激酶分析(上部面板). 免疫沉淀蛋白用IKKα、IKKβ或GST抗体进行免疫印迹，作为负荷对照。（D） IKKs催化p65磷酸化体内将2μg AU1-p65与2μg IKKβ和IKKα或IKK a-T23A共转染BT-20细胞。以AU1-p65和pcDNA共转染作为对照。用磷酸化S534-p65或p65抗体对α-AU1免疫沉淀蛋白进行免疫印迹。使用IKKα和IKKβ抗体对全细胞裂解物进行Western blot。
图7
图7
Akt通过IKK激活NFκB。（A） 通过myrAkt转化的CEF转染300 ng pcDNA载体（对照）或编码IKKα野生型（IKK A）或突变体T23A、S176A/S180A（AA）或T23A/S176A/S180A（AAA）的构建物，以及100 ng的p5×κB和5 ng的pRL-CMV报告质粒。48小时后，测定荧光素酶活性。（B） 将300 ng pcDNA载体（对照）或IKKα突变体T23A、AA和AAA转染BT-20细胞，如（A）所示。用FLAG或肌动蛋白抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹。误差条表示三次转染实验的标准偏差。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Li Q，Verma IM。免疫系统中的NF-kappaB调节。Nat Rev免疫学。2002;2:725–34.-公共医学
    1. Okamoto T、Sanda T、Asamitsu K.NF-κB信号转导与致癌。当前药物设计。2007;13:447–62.-公共医学
    1. Karin M.核因子-kappaB在癌症发展和进展中的作用。自然。2006;441:431–6.-公共医学
    1. Ito K.蛋白质翻译后修饰对炎症过程的影响。生物化学Soc Trans。2007;35:281–3.-公共医学
    1. Kane LP，Shapiro VS，Stokoe D，Weiss A.通过Akt/PKB激酶诱导NF-kappaB。当前生物量。1999;9:601–4.-公共医学

出版物类型

MeSH术语