CXCL8/IL-8 and CXCL12/SDF-1α Co-operatively Promote Invasiveness and Angiogenesis in Pancreatic Cancer

Yoichi Matsuo; Nobuo Ochi; Hirozumi Sawai; Akira Yasuda; Hiroki Takahashi; Hitoshi Funahashi; Hiromitsu Takeyama; Zhimin Tong; Sushovan Guha

doi:10.1002/ijc.24040

国际癌症杂志。作者手稿；PMC 2010年2月15日提供。

以最终编辑形式发布为：

国际癌症杂志。2009年2月15日；124(4): 853–861.

数字对象标识：10.1002/ijc.24040

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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院99334

PMID：19035451

CXCL8/IL-8和CXCL12/SDF-1α协同促进胰腺癌侵袭性和血管生成

松尾洋一,^1,² 诺布·奥奇,^1,² Hirozumi Sawai先生,² 安田章男,² 高桥广树,² Hitoshi Funahashi先生,² Hiromitsu Takeyama先生,² 智敏通,¹和苏肖万·古哈^1,^*

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关联数据

补充资料: 补充图1：补充图1（A）重组CXCL12对AsPC-1PaCa细胞系产生CXCL8的影响。为了确定CXCL12对不同PaCa细胞系产生CXCL8的影响，AsPC-1细胞以2×10的密度接种⁵细胞/mL放入含有10%FCS的24孔培养基中，培养过夜。然后交换培养基，用或不用CXCL12（20ng/mL）处理的细胞再培养48小时。使用材料和方法中描述的ELISA试剂盒测量CXCL8的浓度。数值表示为平均值±标准偏差**，P（P）< 0.05.（B）重组CXCL8对成纤维细胞产生CXCL12的影响。为了确定CXCL8对成纤维细胞产生CXCL12的影响，用或不用CXCL8（20 ng/mL）处理成纤维细胞48 h，用ELISA试剂盒以相同的方式测定上清液中CXCL12浓度。数值表示为平均值±标准偏差，无显著差异。（C）为了确定与不同PaCa细胞系共同培养对成纤维细胞产生CXCL12的影响，我们使用双室法（AsPC-1；5×10⁴细胞插入具有0.4微米孔的插入物[BD Biosciences]，成纤维细胞；2×10⁵细胞放入24孔板中）。培养48小时后，用ELISA试剂盒以同样的方式测定上清液中CXCL12的浓度。数值表示为平均值±标准偏差**，P（P）< 0.05.
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补充图2：补充图2CXCL12对HUVEC或PaCa细胞MMP-2和MMP-9活性的影响。（A） HUVEC的酶谱分析。HUVEC细胞以2×10的密度接种⁶细胞/3mL放入60mm培养皿中培养过夜。然后交换培养基，再培养细胞24小时，用或不用重组CXCL12（100 ng/ml）处理。使用这些上清液和细胞裂解液进行酶谱分析。在不使用还原剂或加热的情况下，将样品与样品缓冲液混合，并装入酶谱凝胶中（Invitrogen，Carlsbad，CA）。在恒压电泳后，按照他们的指示，用酶谱更生缓冲液（Invitrogen）和酶谱显影缓冲液（Initrogen.）处理凝胶。最后，按照说明用SimplyBlue安全染色剂（Invitrogen）对凝胶进行染色。（B）PaCa细胞的酶谱分析。以同样的方式，收集经CXCL12或不经CXCL1处理的AsPC-1、Panc-1和BxPC-3细胞的上清液，并按照上述方法进行酶谱分析。
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摘要

CXC-趋化因子参与中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的趋化性。然而，这些趋化因子在肿瘤发生中的作用，特别是在肿瘤及其微环境之间的相互作用方面，尚未明确阐明。本研究旨在分析CXCL8和CXCL12在胰腺癌（PaCa）中肿瘤-基质相互作用中的协同作用。利用ELISA和RT-PCR，我们初步确认CXC-趋化因子配体和受体分别在PaCa和基质细胞中的表达。我们分别通过MTS、Matrigel侵袭和血管生成分析，检测了CXCL8和CXCL12在PaCa和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖/侵袭以及通过肿瘤-基质相互作用在HUVEC管形成中的协同作用。我们在所有的PaCa细胞和成纤维细胞中检测到CXCR4的表达，但没有检测到CXCR2的表达。PaCa细胞分泌CXCL8，成纤维细胞分泌CXCL12。CXCL12显著增强了PaCa中CXCL8的产生，并且与PaCa共培养显著增强了成纤维细胞中CXCL12的产生。CXCL8增强了HUVEC的增殖/侵袭，但不促进PaCa的增殖/侵入。重组和PaCa衍生的CXCL8均能增强与成纤维细胞共同培养的HUVEC的试管形成。CXCL12增强了HUVEC的增殖/侵袭和PaCa细胞的侵袭，但对HUVEC的管形成没有影响。我们发现，PaCa衍生CXCL8和成纤维细胞衍生CXCL12协同诱导血管生成在体外通过促进HUVEC增殖、侵袭和管形成。因此，相应的受体CXCR2和CXCR4是PaCa潜在的抗血管生成和抗转移治疗靶点。

关键词：胰腺癌、血管生成、CXCL8/IL-8、CXCL12/SDF-1α

介绍

胰腺癌（PaCa）是美国第四大癌症相关死亡原因，每年约有32000例新诊断病例和同等数量的死亡病例(1). PaCa预后差的原因是其临床表现晚、局部侵袭性强、早期转移和化疗反应差(2). 因此，需要更好地了解这种癌症的基本性质，以改善临床结果。

最近，越来越多的证据表明，趋化因子在肿瘤生物学中发挥作用。趋化因子最初被描述为控制细胞迁移的小肽，特别是炎症和免疫反应期间白细胞的小肽。自那时以来，广泛的生物活性被描述为趋化因子调节肿瘤发生，影响肿瘤及其微环境。趋化因子在肿瘤生物学中的作用很重要，因为这些肽可能影响肿瘤的生长、侵袭和转移(3–11). CXCL8（白细胞介素-8[IL-8]）是一种ELR（Glu-Leu-Arg）基序阳性（ELR+）CXC-趋化因子，由白细胞和肿瘤细胞分泌(12). CXCL8介导的细胞反应受其两个高亲和力细胞表面受体G蛋白偶联受体CXCR1和CXCR2的影响，CXCL8与这两个受体交联并对其发挥生物功能(13). CXCL8在免疫监测、炎症和血管生成方面具有多种功能。大多数原发性和转移性实体瘤，如乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤，组成性表达IL-8（CXCL8）(12–18). CXCL8在肿瘤中的一个已知功能是促进血管生成(15). 一些研究表明，肿瘤衍生的CXCL8直接调节内皮细胞增殖和迁移，从而促进血管生成(16,17). 另一方面，基质细胞衍生因子-1（SDF-1），现在被指定为CXCL12(19)是一种通过其受体CXCR4发出信号的稳态趋化因子(20)它反过来在造血、免疫系统的发育和组织中起着重要作用。CXCR4在HIV感染发病机制中的作用(21). 随后，许多报告显示了造血恶性肿瘤与CXCL12-CXCR4轴的相关性(22–24). 最近，一些其他非造血肿瘤也被描述为表达CXCR4趋化因子受体。CXCL12激活CXCR4可诱导肿瘤细胞（包括神经母细胞瘤细胞的肿瘤细胞）迁移、血管生成和/或存活(25)，结直肠癌(26)，前列腺癌(27)、黑色素瘤(28)，卵巢癌(29)和PaCa(30). 这些报道描述了这些趋化因子在肿瘤血管生成中的重要作用。

肿瘤血管生成是指从现有的血管网络中形成新的毛细血管，对肿瘤的生长和转移至关重要。恶性实体瘤的进行性生长依赖于为肿瘤细胞提供氧气和营养的新血管的发育(31). 血管生成是一个复杂的多步骤过程，涉及细胞外基质重塑、内皮细胞迁移和增殖以及毛细管形成(32). 在肿瘤中，这些步骤取决于肿瘤细胞和基质细胞产生血管生成因子(33,34). 嵌入肿瘤中的新血管为肿瘤细胞进入循环并转移到肝脏或肺部等远处器官提供了通道。

CXCL8和CXCL12可能在各种肿瘤的进展和血管生成中发挥重要作用，但这些趋化因子的协同作用尚未明确阐明。因此，本研究的目的是确定CXCL8和CXCL12对PaCa血管生成的协同作用，尤其是肿瘤与微环境之间的相互作用。

材料和方法

细胞培养

PaCa细胞系BxPC-3、AsPC-1、MIA PaCa-2、Panc-1、Capan-2和SW 1990来自美国类型培养物收集（Rockville，MD）。BxPC-3和AsPC-1细胞保存在添加了10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640（西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯）中。MIA PaCa-2、Panc-1、Capan-2和SW 1990细胞保存在Dulbecco改良的Eagle's培养基（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）中，培养基中含有高糖和10%FCS。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）取自Kurabo Co.（日本大阪），并按照供应商的说明保存在HuMedia-EG2培养基中，该培养基补充有2%FCS、5 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10µg/mL肝素、10 ng/mL表皮生长因子和1µg/mL氢化可的松（日本大坂Kurabo.Co.）。成纤维细胞取自Lonza（Walkersville，MD），并按照供应商的说明保存在补充有2%FCS、1 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和1µg/mL胰岛素的FGM-2培养基中（Lonza.Walkersvelle，MD.）。人类胰腺导管上皮（HPDE）细胞是加拿大安大略省多伦多大学（University of Toronto，Ontario，Canada）的Ming-Sound Tsao博士慷慨捐赠的。HPDE细胞在角质形成细胞无血清（KSF）培养基中培养，该培养基提供5 ng/mL EGF和50µg/mL牛垂体提取物（Invitrogen，Carlsbad，CA）。所有细胞在37°C的5%CO增湿环境中培养₂在空中。

试剂和抗体

重组人CXCL8和CXCL12由R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）提供。R&D Systems（明尼阿波利斯）提供了中和单克隆抗人CXCL8、CXCL12和CXCR4抗体（抗CXCL8 Ab、抗CXCL12 Ab和抗CXCR4 Ab）。

RT-PCR分析

使用Qiagen（加利福尼亚州巴伦西亚）的RNeasy迷你试剂盒从所有细胞系中制备总RNA。根据制造商的说明，使用Qiagen的OneStep RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。对于CXCR2的RT-PCR，我们使用了研发系统的CXCR2引物对试剂盒（PCR产品大小，350 bp；GenBank登录号，NM_001557号)对于CXCR4 RT-PCR，我们使用了以下两对正向和反向引物：5'-gaagcttgtgctgaaagg-3'和5'-Gagttgtgatccaat-3'（PCR产物大小，345 bp；GenBank登录号，NM_003467). 对于CXCR2，进行35个周期的PCR，在94°OTC下变性45秒，在55°C下退火45秒，并在72°C下延伸45秒；对于CXCR4，进行30个周期的PCR，在94°C下变性30秒，在54°C下退火30秒，并在72°C下延伸60秒。扩增的DNA片段在含有溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶上通过电泳进行解析。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

所有细胞系以2×10的密度接种⁵细胞/mL放入含有10%FCS的24孔培养基中，培养过夜。然后交换培养基，将细胞再培养48小时。然后收集培养基，并在1500 rpm下进行5分钟的微滤，以去除颗粒，上清液在−80°C下冷冻，直到用于ELISA。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（研发系统）测量CXCL8和CXCL12的浓度。为了确定CXCL12对PaCa细胞产生CXCL8的影响，我们用培养细胞的CXCL12（20 ng/mL）刺激Panc-1细胞48小时，然后用与上述相同的方法测量CXCL8浓度。为了确定肿瘤-基质相互作用的协同效应，我们培养了成纤维细胞（1×10⁵细胞成24孔板），有或没有SW 1990（5×10⁴将细胞插入具有0.4µm孔的插入物[BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ]）中48小时，然后使用与上述相同的方法测量CXCL12浓度。此外，为了研究成纤维细胞衍生的CXCL12对PaCa、PaCa细胞系[Panc-1、AsPC-1和Mia PaCa-2细胞（2×10⁵将细胞放入24孔板中）]与成纤维细胞（5×10⁴使用双室法将细胞插入具有0.4微米孔的插入物[BD Biosciences]）中48小时，然后如上所述测量CXCL8浓度。此外，为了确定抗CXCR4抗体（CXCR4 Ab）对成纤维细胞从PaCa中增强CXCL8生成的影响，将PaCa细胞用CXCR4阿布（15µg/mL）预处理1h，然后与成纤维细胞共培养48h，并测量CXCL8浓度。在5个独立样本中评估每种情况。

增殖试验

为了确认这些趋化因子对HUVEC的影响，我们首先根据制造商的说明，使用Celltiter 96水溶液细胞增殖试验（MTS-assay）（普罗米加，麦迪逊，威斯康星州）进行了增殖试验。简单地说，HUVEC的播种密度为5×10³细胞/100µL，置于96-well板中，并允许过夜粘附。然后，用含有不同浓度CXCL8或CXCL12的新鲜培养基重新喂养培养物。培养48小时后，向每个孔中添加20µl CellTiter 96水溶液试剂，并在37°C下培养托盘3小时，然后使用测试波长为490 nm的微孔板阅读器测量吸光度。每种情况在5个独立样本中进行评估。

侵入试验

根据制造商的说明，使用BD Bio-Coat Matrigel入侵检测系统（BD Biosciences）进行体外入侵检测。简单地说，BxPC-3细胞（2×10⁵单元）或HUVEC（5×10⁴细胞）悬浮在含有2%FCS的培养基中，接种到Matrigel预涂层跨阱室中，跨阱室内由具有8-µm孔的聚碳酸酯膜组成。然后将跨阱室放置在24孔板中，我们在其中仅添加基础培养基或包含不同浓度CXCL8或CXCL12的基础培养基。在培养BxPC-3细胞24小时和HUVEC 16小时后，用棉签擦拭跨孔室的上表面，固定入侵细胞并用Diff-Quick染色。在五个随机显微镜场（x200）中计算入侵细胞的数量。为了确认成纤维细胞衍生的CXCL12是否导致PaCa细胞侵袭力的增加，我们使用双腔法对BxPC-3进行了侵袭试验。简单地说，我们共同培养了BxPC-3细胞（2×10⁵细胞进入transwell室）和成纤维细胞（1×10⁵用或不使用抗CXCL12抗体（10µg/mL）封闭24小时；然后，以同样的方式对入侵细胞进行计数。同样，为了研究内皮细胞和PaCa或成纤维细胞之间的相互作用，我们将HUVEC与PaCa（BxPC-3或MIA-PaCa-2）或与阻断或不阻断抗CXCL8 Ab（PaCa）或抗CXCL12 Ab（成纤维细胞）的成纤维细胞共培养。每种情况评估一式三份。

酶谱学

HUVEC细胞以2×10的密度接种⁶细胞/3mL放入60mm培养皿中培养过夜。然后交换培养基，再培养细胞24小时，用或不用重组CXCL12（100 ng/ml）处理。使用这些上清液和细胞裂解液进行酶谱分析。在不使用还原剂或加热的情况下，将样品与样品缓冲液混合，并装入酶谱凝胶中（Invitrogen，Carlsbad，CA）。在恒压电泳后，按照他们的指示，用酶谱更生缓冲液（Invitrogen）和酶谱显影缓冲液（Initrogen.）处理凝胶。最后，按照说明用SimplyBlue安全染色剂（Invitrogen）对凝胶进行染色。以同样的方式，收集经CXCL12或不经CXCL1处理的AsPC-1、Panc-1和BxPC-3细胞的上清液，并按照上述方法进行酶谱分析。

通过共培养PaCa、HUVEC和成纤维细胞进行HUVEC-管形成试验以检测血管生成

为了研究CXCL8对HUVEC形成管的影响，我们根据制造商的协议，使用血管生成试剂盒（Kurabo co.）在含有不同浓度CXCL8的基础培养基中共同培养HUVECs和成纤维细胞(35,36). 简言之，HUVECs和成纤维细胞在24孔板中与仅基础培养基（对照）或含有CXCL8（1或10ng/mL）的基础培养基共培养。每3天更换培养基，HUVEC和成纤维细胞共培养11天。然后根据制造商的方案用抗CD31抗体对HUVEC进行染色。使用图像分析仪（Kurabo Co.）在每种条件下的15个不同区域内定量测量管子形成面积。为了研究PaCa对HUVEC形成管的影响，我们在24孔板中采用双室法联合培养PaCa细胞系（BxPC-3或MIA-PaCa-2）、HUVECs和成纤维细胞。BxPC-3或MIA-PaCa-2细胞（1×10⁴细胞）接种到由聚碳酸酯膜组成的跨阱室中，该膜具有0.45-µm孔（Kurabo Co.），并允许过夜粘附。然后将培养箱置于HUVEC/成纤维细胞共培养系统中，并在第7天进行交换。细胞共培养11天，并如上所述评估HUVEC管的形成。该试验使我们能够定量评估血管生成并检查肿瘤与基质细胞的相互作用。使用相同的方法，我们评估了抗IL-8抗体（10µg/mL）在PaCa细胞存在下对HUVEC管形成的影响。每种情况评估一式三份。

体外血管生成的HUVEC试管形成试验

为了证实CXCL12对HUVEC中试管形成的影响，我们对Matrigel（BD Biosciences）进行了血管生成检测。为了重建基底膜，用冷DMEM（无FCS）将Matrigel稀释2倍，并在4℃下添加到24孔组织培养板（250µl/孔）中。24孔板在37°C细胞培养箱中培养2小时，以使基质凝固。将HUVEC进行胰蛋白酶消化、计数、悬浮在基础培养基中，并将其添加到重建的基底膜（5×10⁴细胞/孔）。培养细胞16小时，以形成毛细血管样结构。通过在显微镜下计数9个随机场/样品（x100）来量化内皮管。每种情况评估一式三份。

统计分析

两个样本平均值的差异由一名未配对的吨测试。通过单因素方差分析（ANOVA）进行多组比较，并对随后的单组比较进行事后检验。一个P（P）值<0.05被认为具有统计学意义。计算三次（或更多）试验的平均值和标准偏差（SD）。

结果

CXCR2和CXCR4 mRNA的RT-PCR

我们的RT-PCR实验表明，没有任何细胞系表达CXCR2 mRNA，但所有这些细胞系和成纤维细胞都表达CXCR4 mRNA(图1A).

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图1

趋化因子受体和配体在PaCa和基质细胞中的表达

（A）PaCa和基质细胞中CXCR2和CXCR4 mRNA的检测。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色。（B）PaCa和基质细胞培养液中CXCL8和CXCL12蛋白的定量。所有细胞培养48小时，然后用ELISA测定两种趋化因子的浓度。（C）肿瘤与基质相互作用导致趋化因子产生的变化。通过CXCL12（20 ng/mL）刺激改变PaCa（Panc-1）产生CXCL8（左）与PaCa共同培养的成纤维细胞中CXCL12生成的改变（SW 1990）（右）值表示为平均值±标准差*，P（P）< 0.01.

ELISA检测CXCL8和CXCL12蛋白分泌

使用ELISA，我们测量了PaCa细胞系和基质细胞中CXCL8和CXCL12的分泌水平。根据CXCL8的检测结果，我们将PaCa细胞系分为两组：分泌高水平CXCL8（BxPC-3和SW 1990）的细胞系和分泌低水平CXCL的细胞系（MIA PaCa-2、Panc-1、Capan-2和AsPC-1）。ELISA检测不到PaCa细胞株分泌的CXCL12水平。成纤维细胞在培养基中分泌高水平的CXCL12（20 ng/mL）(图1B). 用重组CXCL12刺激细胞后，PaCa细胞中CXCL8的生成显著增加。同样，通过与PaCa细胞共同培养，成纤维细胞分泌CXCL12的水平增加(图1C). 与成纤维细胞共培养可显著提高PaCa细胞产生CXCL8（Panc-1、AsPC-1和MIA-PaCa-2分别为2.34、3.17和6.91倍）。此外，CXCR4抗体的加入显著抑制了与成纤维细胞共培养增强的CXCL8生成(图2).

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图2

与成纤维细胞共培养对PaCa产生CXCL8的影响

如材料和方法中所述，通过ELISA评估与成纤维细胞（FB）共同培养PaCa（Panc-1、AsPC-1和MIA-PaCa-2）产生CXCL8的变化。此外，为了检测成纤维细胞衍生的CXCL12对增强PaCa细胞系CXCL8生成的作用，用抗CXCR4抗体（Ab）预处理PaCa电池1 h，并按照材料和方法中的描述进行ELISA实验。FB；对照组仅为成纤维细胞；仅PaCa细胞，含FB；PaCa细胞与成纤维细胞共培养，FB+Ab；PaCa细胞与经抗CXCR4抗体处理的成纤维细胞共同培养。数值表示为平均值±SD.*，P（P）< 0.01.

CXCL8和CXCL12对PaCa细胞、成纤维细胞和HUVEC增殖的影响

在确认了CXCL8在PaCa细胞系中的表达和CXCL12在成纤维细胞中的表达后，我们使用MTS分析来确定这些趋化因子对细胞生长的影响。CXCL8和CXCL12均未增强PaCa细胞（BxPC-3、AsPC-1、MIA-PaCa-2和Panc-1）的生长（数据未显示）。为了确定肿瘤细胞衍生的CXCL8是否以自分泌方式影响PaCa细胞的增殖，我们还使用中和抗CXCL8抗体（CXCL8 Ab）进行了MTS分析。然而，由于CXCL8抗体对CXCL8的阻断，对PaCa细胞的生长没有明显抑制作用（数据未显示）。此外，CXCL8和CXCL12均未促进成纤维细胞增殖（数据未显示）。然而，CXCL8和CXCL12刺激后，HUVEC增殖显著增强(P（P）< 0.01) (图3).

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图3

CXCL8和CXCL12对HUVEC增殖的影响

如材料和方法所述，使用MTS评估细胞增殖。采用单因素方差分析和SNK检验进行多重比较。数值表示为平均值±标准偏差*，P（P）<0.01和**，P（P）与对照组相比<0.05。

CXCL12而非CXCL8增强了PaCa侵袭性

最初，我们使用Matrigel双腔侵袭试验来确定重组CXCL8和CXCL12是否调节PaCa细胞的侵袭性。重组CXCL12以剂量依赖的方式刺激BxPC-3的侵袭行为显著增强(P（P）< 0.01). 在下腔与成纤维细胞共培养也显著增强了BxPC-3的侵袭能力(P（P）< 0.01); 用中和性抗CXCL12抗体预孵育这些细胞可以抑制BxPC-3侵袭性的增强(P（P）< 0.01). CXCL8不影响PaCa细胞的侵袭力(图4A、4B).

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图4

CXCL8和CXCL12对PaCa和HUVEC侵袭力的影响

如材料和方法中所述，通过BD Bio-Coat Matrigel侵袭检测系统（BD Biosciences）评估PaCa侵袭性和HUVEC侵袭性。（A，B）PaCa侵入测定。在含有不同浓度CXCL8或CXCL12的基础培养基条件下，或与经或不经抗CXCL12抗体（10µg/mL）处理的成纤维细胞共培养条件下，进行PaCa（BxPC-3）侵袭试验。侵袭细胞固定，Diff-Quick染色。在5个随机显微镜场（×200）中计数入侵细胞。采用单因素方差分析和SNK检验进行多重比较。横线表示SD*P（P）与对照组相比<0.01。地下一层：控制；地下二层：用CXCL8培养（10 ng/mL）；地下三层：用CXCL12培养（10 ng/mL）；B4类：与成纤维细胞共培养；B5：与经抗CXCL12抗体（10µg/mL）处理的成纤维细胞共同培养。（C、D）HUVEC侵袭试验。HUVEC侵袭试验在仅基础培养基或含有不同浓度CXCL8或CXCL12的基础培养基条件下进行。为了评估HUVEC与PaCa或成纤维细胞之间的相互作用，HUVECs与经或不经抗CXCL8抗体处理的PaCa（MIA-PaCa-2或BxPC-3）共培养，或与经或未经抗CXCL12抗体处理的成纤维细胞共培养。侵入细胞用Diff-Quick染色，并在五个随机显微镜下（×200）计数。采用单因素方差分析和SNK检验进行多重比较。横线表示SD*P（P）与对照组相比<0.01。第1页：控制；D2类：用CXCL8培养（10 ng/mL）；第3天：用CXCL12培养（10 ng/mL）；第4章：与BxPC-3共培养；D5型：与经抗CXCL8抗体处理的BxPC-3共培养（10µg/mL）；第6天：与MIA PaCa-2共培养；D7日：与经抗CXCL8抗体（10µg/mL）处理的MIA PaCa-2共培养；D8日：与成纤维细胞共培养；D9：与经抗CXCL12抗体（10µg/mL）处理的成纤维细胞共同培养。

CXCL8和CXCL12均以剂量依赖性方式增强HUVEC侵袭

已有报道血管内皮细胞中CXCR2（CXCL8受体）的表达(37,38)，我们使用Matrigel双腔侵袭实验再次确认CXCL8对HUVEC侵袭性的影响。CXCL8以剂量依赖性方式增强HUVEC的侵袭性(P（P）< 0.01). 此外，根据CXCL8分泌将PaCa细胞系分为CXCL8高分泌组和CXCL8低分泌组，我们研究了具有不同CXCL8释放潜能的PaCa电池如何影响HUVEC的侵袭能力。与与MIA PaCa-2细胞（低CXCL8分泌组）共培养时HUVECs的侵袭性相比，与BxPC-3细胞（高CXCL8分泌组）共培养显著增强了HUVECs的侵袭能力(P（P）< 0.01). 抗CXCL8抗体显著抑制BxPC-3增强的HUVEC侵袭能力(P（P）< 0.01). 此外，重组CXCL12以剂量依赖的方式增强HUVECs的侵袭能力。与成纤维细胞共培养也显著增强了HUVEC的侵袭能力；这种增强被抗CXCL12抗体的添加所抑制(P（P）< 0.01) (图4C，4D).

CXCL12对HUVEC或PaCa细胞MMP-2和MMP-9活性的影响

由于CXCL12增强了HUVEC和PaCa的侵袭，我们进行了酶学实验，以测定CXCL12刺激后HUVEC-PaCa中MMP-2和MMP-9的活性(补充图2). 我们首次观察到HUVEC具有基础MMP-9活性（在上清液中），CXCL12没有显著增强(补充图2A). 我们还对PaCa细胞进行了类似的实验。有趣的是，CXCL12并没有增强PaCa细胞的MMP-9活性。然而，在CXCL12刺激下，Panc-1细胞显示MMP-2活性适度增加(补充图2B).

趋化因子对HUVEC导管形成的影响

由于CXCL8刺激内皮细胞迁移，我们接下来研究了这种细胞因子对HUVEC形成管的影响。经重组CXCL8处理后，HUVEC管形成显著增强。此外，高CXCL8分泌的BxPC-3细胞显著增强了HUVEC管的形成；这种增强被抗CXCL8抗体抑制(图5A、5B、5C). 另一方面，重组CXCL12对HUVEC管的形成没有显著影响(图5D、5E).

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图5

两种趋化因子对血管生成的影响

（A）CXCL8对HUVEC试管形成的影响。将HUVEC/成纤维细胞共培养系统（Kurabo co.）在CXCL8存在或不存在的情况下培养11天后，用抗CD31抗体对HUVEC进行染色。使用图像分析仪定量测量管形成面积。采用单因素方差分析和SNK检验进行多重比较。横线表示SD*P（P）与对照组相比<0.01。（B）不同浓度CXCL8产生的PaCa细胞对HUVEC形成试管的影响。BxPC-3或MIA PaCa-2细胞与HUVEC和成纤维细胞一起培养，使用不含抗CXCL8 Ab（白柱）或抗CXCL8Ab（黑柱）的双室培养。HUVEC使用图像分析仪测量每种情况下的试管形成。采用单因素方差分析和SNK检验进行多重比较。横线表示SD*P（P）与抗CXCL8 Ab和MIA PaCa-2细胞治疗相比，<0.01。（C）通过共同培养PaCa、HUVEC和成纤维细胞进行血管生成的试管形成试验。C1类：控制；指挥与控制：用CXCL8培养（1 ng/mL）；C3类：与CXCL8（10 ng/mL）一起培养；补体第四成份：与BxPC-3共培养；C5级：与用抗CXCL8 Ab（10µg/mL）处理的BxPC-3共培养；C6级：与MIA PaCa-2共培养；抄送7：与用抗CXCL8 Ab（10µg/mL）处理的MIA PaCa-2共培养（×40）。（D）CXCL12对HUVEC管形成的影响。Matrigel上血管生成的试管形成试验按照材料和方法中的描述进行。通过在显微镜下计数9个随机区域/样品（x100），进一步量化内毒素的数量。（E）Matrigel上血管生成的试管形成试验。E1级：控件，E2级：用CXCL12培养（10 ng/mL）；E3公司：用CXCL12培养（100 ng/mL）；E4类：用抗CXCL12抗体（10µg/mL）培养。

讨论

我们的研究证明了CXCL8和CXCL12在PaCa和基质细胞之间相互作用的血管生成中的协同作用。CXCL12显著增强了PaCa细胞中CXCL8的生成，而与PaCa上皮细胞共培养可增加成纤维细胞中CXCL12的生成。这些结果表明，PaCa和基质细胞之间的相互作用共同调节这些趋化因子的产生，从而促进血管生成。在血管生成中，涉及到复杂多样的细胞作用，如细胞外基质降解、内皮细胞增殖和迁移，以及内皮细胞形态分化形成管(32). 每个过程都由刺激信号和抑制信号（如生长因子、整合素和趋化因子）之间的平衡调节(39). 在肿瘤中，这些信号不仅由肿瘤产生，也由基质细胞产生(40,41). 因此，我们发现CXCL8和CXCL12均通过PaCa和成纤维细胞之间的相互作用上调，这具有重要的生物学意义。

我们研究的一个显著特征是，与PaCa细胞相比，成纤维细胞分泌高水平的CXCL12。有趣的是，与PaCa细胞共培养可显著提高成纤维细胞分泌的CXCL12水平。这表明PaCa细胞分泌的旁分泌因子增强了CXCL12的产生。在成骨细胞中，这些因子包括IL-1β、PDGF-BB、VEGF-A和TNF-α(42). 然而，关于PaCa相关成纤维细胞对CXCL12生成的调节尚不清楚。先前的一项研究指出AsPC-1细胞迁移增加在体外通过重组CXCL12和CFPAC-1 PaCa细胞与MRC-9成纤维细胞共培养，这些成纤维细胞被CXCR4拮抗剂T22显著抑制(43). 在我们的研究中，我们观察到PaCa细胞衍生的CXCL8和成纤维细胞衍生的CX3CL12在促进侵袭和血管生成方面存在显著的协同作用。这些发现表明，PaCa与基质细胞之间的相互作用可以产生一个重要的细胞因子网络，调节PaCa的侵袭和血管生成。

趋化因子是调节白细胞和其他类型细胞（包括肿瘤细胞和基质细胞）运动活性的趋化细胞因子(44). 然而，对于肿瘤和基质细胞之间的协同作用促进PaCa细胞的迁移/侵袭，人们知之甚少。我们研究的一个重要观察结果是，CXCL12以旁分泌方式通过CXCR4增强PaCa细胞的侵袭性，而CXCL12信号通路的阻断显著抑制了这种侵袭性。最近，CXC12-CXCR4信号轴促进PaCa肿瘤发生的分子机制被报道(45). 在本研究中，Urrutia R等表明CXCR4介导的信号通过EGFR在PaCa细胞中的转磷酸化显著增强ERK激活，并促进HUVEC管的形成在体外我们的结果通过证明CXCL8和CXCL12在促进PaCa相关血管生成方面的协同相互作用，进一步扩展了这一观察结果。此外，我们还发现成纤维细胞衍生的CXL12能有效增强PaCa细胞产生CXCL8，从而增强HUVEC管的形成在体外总的来说，这些观察结果突出了一个事实，即CXCR2和CXCR4，分别是CXCL8和CXCL12的相应受体，是PaCa的潜在治疗靶点。

我们检测了这两种细胞因子对PaCa、成纤维细胞和HUVEC细胞增殖的影响。CXCL8和CXCL12均未增强PaCa或成纤维细胞增殖，但两种趋化因子均显著增强HUVEC增殖，且呈剂量依赖性。因为之前的一份报告表明，内源性CXCL8可能以自分泌的方式在PaCa增殖中发挥作用(46)，我们通过中和抗CXCL8抗体来检测PaCa细胞增殖能力的改变，但没有发现显著差异（数据未显示）。因此，关于细胞增殖，这些CXC-趋化因子似乎只影响血管内皮细胞。这可能是因为包括EGF、IGF、PDGF和VEGF在内的多种生长因子为PaCa细胞和成纤维细胞提供了大量的存活和增殖优势。因此，包括CXCL8和CXC12在内的趋化因子在肿瘤发生过程中具有独特的生物学功能。

为了总结我们的研究结果，我们提出以下模型(图6). 该模型描述了PaCa细胞、内皮细胞和成纤维细胞之间关于趋化因子生物效应的协同作用。我们发现，PaCa细胞衍生的CXCL8和成纤维细胞衍生的CX3CL12促进HUVEC增殖、迁移/侵袭和管形成。此外，CXCL12以旁分泌方式增强PaCa细胞产生CXCL8。我们的研究并不是为了详细分析这些细胞类型中趋化因子受体介导的信号通路。我们还忽略了生长因子（包括EGF和VEGF）与趋化因子（包括CXCL8和CXCL12）合作促进PaCa迁移/侵袭和血管生成的可能性。进一步的研究将确定CXCR2和CXCR4下游的关键信号分子，它们是PaCa肿瘤发生的关键介质。此外，了解生长因子或细胞因子对成纤维细胞CXCL12生成的调节将有助于开发新的治疗靶点。总之，我们的数据为临床测试靶向CXCR4和CXCR2的药物以及其他已知的生物靶点提供了理论依据，以阻止PaCa的转移和血管生成。

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图6

CXCL8和CXCL12协同促进PaCa的侵袭和血管生成。PaCa细胞分泌CXCL8。成纤维细胞衍生的CXCL12增强了PaCa细胞中CXCL8的生成。来自PaCa的CXCL8上调HUVEC的增殖、侵袭和管形成。成纤维细胞产生CXCL12；通过与PaCa细胞共同培养，可以提高产量。CXCL12不仅上调PaCa的侵袭，而且上调HUVEC的增殖和侵袭。这样，CXCL8和CXCL12协同促进PaCa的侵袭和血管生成。

补充材料

补充图1

补充图1：

（A）重组CXCL12对AsPC-1 PaCa细胞株产生CXCL8的影响。为了确定CXCL12对不同PaCa细胞系产生CXCL8的影响，AsPC-1细胞以2×10的密度接种⁵细胞/mL放入含有10%FCS的24孔培养基中，培养过夜。然后交换培养基，再培养细胞48小时，用或不用CXCL12（20 ng/mL）处理。使用材料和方法中描述的ELISA试剂盒测量CXCL8的浓度。数值表示为平均值±标准偏差**，P（P）< 0.05.（B）重组CXCL8对成纤维细胞产生CXCL12的影响。为了确定CXCL8对成纤维细胞产生CXCL12的影响，用或不用CXCL8（20 ng/mL）处理成纤维细胞48 h，用ELISA试剂盒以相同的方式测定上清液中CXCL12浓度。数值表示为平均值±标准偏差，无显著差异。（C）为了确定与不同的PaCa细胞系共培养对成纤维细胞产生CXCL12的影响，我们使用双室法（AsPC-1；5×10⁴细胞插入具有0.4微米孔的插入物[BD Biosciences]，成纤维细胞；2×10⁵将细胞分成24孔板）。培养48小时后，用ELISA试剂盒以同样的方式测定上清液中CXCL12的浓度。数值表示为平均值±标准偏差**，P（P）< 0.05.

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补充图2

补充图2：

CXCL12对HUVEC或PaCa细胞MMP-2和MMP-9活性的影响。（A） HUVEC的酶谱分析。HUVEC细胞以2×10的密度接种⁶细胞/3mL放入60mm培养皿中培养过夜。然后交换培养基，再培养细胞24小时，用或不用重组CXCL12（100 ng/ml）处理。使用这些上清液和细胞裂解液进行酶谱分析。在不使用还原剂或加热的情况下，将样品与样品缓冲液混合，并装入酶谱凝胶中（Invitrogen，Carlsbad，CA）。在恒压电泳后，按照他们的指示，用酶谱更生缓冲液（Invitrogen）和酶谱显影缓冲液（Initrogen.）处理凝胶。最后，按照说明用SimplyBlue安全染色剂（Invitrogen）对凝胶进行染色。（B）PaCa细胞的酶谱分析。以同样的方式，收集经CXCL12或不经CXCL1处理的AsPC-1、Panc-1和BxPC-3细胞的上清液，并按照上述方法进行酶谱分析。

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致谢

作者感谢科学出版部的戴安·哈克特仔细审阅了这份手稿。

拨款支持：部分由AGA导师研究学者奖（授予SG）、德克萨斯大学MD安德森癌症中心医师科学家计划奖（授予SB）和NIH拨款CA16672（授予MD安德逊癌症中心癌症中心支持拨款）支持。

缩写

伊利诺伊州	白细胞介素
SDF-1型	基质细胞衍生因子-1
帕卡	胰腺癌
HUVEC公司	人脐静脉内皮细胞
未来作战系统	胎牛血清
高性能柴油发动机	人胰腺导管上皮
肯尼亚先令	无血清角质形成细胞
抗体	抗体
逆转录聚合酶链反应	逆转录聚合酶链反应
酶联免疫吸附试验	酶联免疫吸附试验
方差分析	方差分析
PDGF-BB公司	血小板衍生生长因子-BB
血管内皮生长因子-A	血管内皮生长因子-A
肿瘤坏死因子-α	肿瘤坏死因子-α
表皮生长因子受体	表皮生长因子受体
SNK测试	检验法

脚注

我们的研究表明第一次胰腺癌细胞衍生的CXCL8和基质成纤维细胞衍生的CX3CL12协同促进血管生成在体外因此，它们各自对应的受体CXCR2和CXCR4是潜在的新治疗靶点。

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