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EMBO J。2002年7月15日；21(14): 3728–3738.
数字对象标识：10.1093/emboj/cdf387
预防性维修识别码：PMC126129项目
PMID：12110585

PDK1在调节小鼠细胞大小和发育中的重要作用

玛格丽特·劳勒,1 阿方索·莫拉,彼得·阿什比,2 米凯拉·威廉姆斯,维多利亚·默里-塔特,三 洛林·马龙,三 阿兰·普雷斯科特,三 约翰·卢科克,三和达里奥·阿莱西
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

PDK1作为主激酶发挥作用，磷酸化并激活PKB/Akt、S6K和RSK。为了进一步了解PDK1的作用，我们培育了缺乏PDK1或具有PDK1亚型等位基因的小鼠，其表达量仅为PDK1正常水平的～10%。PDK1系列–/–胚胎在胚胎第9.5天死亡，表现出多种异常，包括缺乏体节、前脑和神经嵴衍生组织；然而，后脑和中脑的发育相对正常。相反，低形态PDK1小鼠可以存活和繁殖，胰岛素注射可诱导PKB、S6K和RSK的正常激活。然而，这些小鼠比对照动物小40-50%。PDK1亚型小鼠的器官体积按比例减少。我们还确定，一些PDK1缺陷细胞的体积减少了35-60%，并表明PDK1缺乏不会影响细胞数量、核大小或增殖。我们提供了基因证据，证明PDK1对小鼠胚胎发育至关重要，并独立于细胞数量或增殖调节细胞大小，以及胰岛素激活PKB、S6K和RSK的能力。

关键词：细胞生长/细胞大小/胚胎发育/PDK1/PKB–Akt/PI 3-激酶

介绍

3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）在调节一组胰岛素和生长因子刺激的蛋白激酶的活性中起着关键作用，这些蛋白激酶属于蛋白激酶的AGC亚家族(Niederberger和Schweingruber，1999年；托克和牛顿，2000年；阿莱西，2001)。其中包括蛋白激酶B（PKB，也称为Akt）的亚型(巴西和海明斯，2001年；Scheid和Woodgett，2001年)，p70核糖体S6激酶（S6K）(阿弗鲁奇等., 2001；沃拉雷维奇和托马斯，2001年)和p90核糖体S6激酶(弗罗丁等2000年)。一旦激活，这些酶通过磷酸化关键调节蛋白调节胰岛素和生长因子对细胞的多种影响，这些调节蛋白在控制细胞生存、增殖、营养吸收和储存等过程中发挥重要作用。

哺乳动物中只有一个基因编码PDK1。PDK1通过磷酸化这些酶的保守残基（称为T环残基）来激活AGC激酶成员，该残基位于其激酶催化域的核心(Niederberger和Schweingruber，1999年；托克和牛顿，2000年；阿莱西，2001)。PDK1对PKB和S6K的激活依赖于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-激酶）的先前激活。这产生第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸[PtdIns（3,4,15）P三]，与PKB和PDK1的序列同源域结合，将这些酶招募到质膜上，在那里PKB被PDK1磷酸化(巴西和海明斯，2001年；Scheid和Woodgett，2001年)。相反，S6K不与PtdIns（3,4,5）P相互作用三而是PtdIns（3,4,5）P三通过一种未知的机制，刺激位于疏水基序中S6K催化结构域C末端的Thr残基的磷酸化(阿弗鲁奇等., 2001；沃拉雷维奇和托马斯，2001年)。该位点S6K的磷酸化增强了PDK1与S6K相互作用、磷酸化和激活S6K的能力(比昂迪等., 2001)。RSK亚型的激活是由ERK/MAP激酶磷酸化启动的，以响应激活Ras/Raf途径的激动剂。为了使RSK被ERK激活，RSK还需要通过PDK1在其N-末端激酶结构域的T环残基处磷酸化(Frodin和Gammeloft，1999年).

PDK1在激活某些AGC激酶成员中所起的关键作用是通过发现缺乏PDK1的小鼠胚胎干细胞未能激活PKB、S6K和RSK，以响应激发野生型ES细胞中这些酶激活的刺激(Williams等人，2000年)。可能出乎意料的是，缺乏PDK1的ES细胞是可行的，因为据报道PKB和RSK在调节其他细胞类型的存活和增殖中起着重要作用(Nebreda和Gavin，1999年；劳勒和阿莱西，2001年)。此外，敲除PDK1同源物酿酒酵母(Casamayor等人，1999年；Inagaki等人，1999年),葡萄裂殖酵母(Niederberger和Schweingruber，1999年),秀丽隐杆线虫(Paradis等人，1999年)和果蝇属(Cho，K.S.等人，2001年；Rintelen等人，2001年)揭示了PDK1是这些生物体正常发育和生存所必需的。为了进一步了解PDK1在哺乳动物中的作用，我们生成并分析了PDK1基因敲除小鼠和PDK1亚型突变小鼠的表型，这些小鼠在所有检查的组织中表达的PDK1水平明显较低。

结果

调控ES细胞中PDK1的水平

我们产生了小鼠ES细胞系PDK1飞行/飞行其中新霉素抗性基因与液氧磷CRE切除位点插入两个等位基因的外显子2和3之间的内含子序列中PDK1系列基因（图1A） ●●●●。我们观察到，这些细胞的PDK1表达状态较低，因为PDK1蛋白水平明显较低（图1B） 和PDK1激酶活性（图1C） 与控制PDK1相比+/+而两种细胞类型中PKBα蛋白水平相同。与导致PDK1水平降低的新霉素耐药基因的存在一致，使用CRE重组酶去除该基因，以生成PDK1flΔneo/flΔneoES细胞，导致PDK1蛋白和激酶活性水平恢复到PDK1中的水平+/+ES细胞。杂合子PDK1+/佛罗里达州ES细胞具有正常水平的PDK1蛋白和激酶活性（图1B和C）。PDK1+/–，PDK1+/佛罗里达州和PDK1+/流量Δneo使用标准程序将ES细胞注射到小鼠胚泡中以产生具有这些基因型的小鼠。

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图1。低形态PDK1 ES细胞的生成。(A类)图示5′端PDK1系列基因和我们产生的不同等位基因。黑盒子代表外显子，连续的线代表内含子，三角形代表液氧磷位点，neo-box代表新霉素抗性基因盒。用于对ES细胞和小鼠进行基因分型的PCR引物的位置用箭头表示，野生型等位基因；fl，包含新霉素耐药基因侧翼的等位基因液氧磷外显子2和3之间的位点以及液氧磷内含子4中的位点；flΔneo，用CRE重组酶切除新霉素抗性基因盒，但仍具有液氧磷外显子3和4两侧的位点，表示CRE去除外显子3和4的等位基因，这也会导致移码突变(Williams等人，2000年)这将阻断PDK1蛋白在外显子2以外的表达，外显子包括激酶和pleckstrin同源结构域。(B类)将所示ES细胞系生长到汇合处，进行裂解，并在10%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上电泳20µg蛋白提取物，并用识别小鼠PDK1（顶面板）或PKBα（底面板）的抗体进行免疫印迹。在三个单独的实验中也得到了类似的结果。(C类)对ES细胞进行裂解，并对PDK1进行免疫沉淀和分析。数据表示为两个单独实验±SEM的平均值，每次测定一式三份。

PDK1的胚胎致死性–/–老鼠

PDK1+/–杂合小鼠健康，无明显表型。为了产生完整的PDK1基因敲除小鼠，在杂合子PDK1之间建立了交配+/–对小鼠及其后代进行基因分型（表我)。无PDK1–/–出生后的小鼠曾被恢复，表明该基因型导致胚胎致死表型。接下来，我们分析了从PDK1衍生的7.0至12.5天胚胎的基因型+/–交配，显示PDK1的存在–/–胚胎期（E）7.5至E9.5的预期孟德尔分布胚胎（表我)。我们无法分离PDK1–/–E10或更晚的胚胎，表明突变胚胎死亡，并在E9.5后被重新吸收。

表一。

本研究中报告的小鼠交配
十字架阶段基因型总计
PDK1系列+/–×PDK1+/–E7.5级PDK1系列+/+（25%）PDK1+/–（45%）PDK1–/–(30%)20
PDK1系列+/–×PDK1+/–E8.5段PDK1系列+/+（27%）PDK1+/–（50%）PDK1–/–(23%)26
PDK1系列+/–×PDK1+/–公式9.5PDK1系列+/+（23%）PDK1+/–（52%）PDK1–/–(25%)61
PDK1系列+/–×PDK1+/–断奶PDK1系列+/+（34%）PDK1+/–（66%）PDK1–/–(0%)81
PDK1系列+/佛罗里达州×PDK1+/佛罗里达州断奶PDK1系列+/+（32%）PDK1+/佛罗里达州（47%）PDK1飞行/飞行(21%)106
PDK1系列飞行/飞行×PDK1+/–断奶PDK1系列+/佛罗里达州（63%）PDK1–/fl(37%)78
PDK1系列飞行/飞行×PDK1飞行/飞行断奶PDK1系列飞行/飞行(100%)27
PDK1系列–/fl×PDK1–/fl断奶PDK1系列–/fl（30%）PDK1飞行/飞行（70%）PDK1–/–(0%)20

按照材料和方法中的描述，建立了指示的交配，并对后代进行了基因分型。括号中显示了观察到的每个基因型的百分比。Total表示分析的子代数量。按照材料和方法中的描述断奶。

因此，为了检测E7-9胚胎中PDK1 mRNA的表达模式，我们进行了完整的就地杂交（图2)。该分析表明，PDK1 mRNA在E7至E9的所有胚胎和胚外组织中普遍表达。

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图2。PDK1在早期胚胎中广泛表达。全量mRNA就地在PDK1上进行PDK1表达的杂交+/+处于指定发育阶段的胚胎。胚胎在PDK1探针存在（+）或不存在（-）的情况下进行处理。在两个单独的实验中观察到类似的结果。

PDK1分析–/–表型

在E7.0，PDK1–/–胚胎已经小于PDK1+/+室友（图三A） ●●●●。它们定义了胚胎和胚外片段，但没有明显的外部表型差异。通过E8.0（四到六个体节），PDK1–/–胚胎明显小于PDK1+/+室友长得很长，有很小的头巾，没有可见的体节或后中胚层，有一个小尿囊。PDK1中存在胚外膜–/–胚胎。目前尚不清楚这些胚胎是否具有特定表型或发育迟缓。

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图3。PDK1分析–/–和PDK1+/+胚胎。(A类——E类)PDK1系列–/–和PDK1+/+胚胎在PBS中解剖，在徕卡M275显微镜上成像，并拍摄整体照片。hd，头部；hf，头巾；他，心；al，尿囊；胚胎外膜；psm，眼前中胚层；exr，胚外区；emr，胚胎区；nt，神经管；所以，索米特。(F类)E7.5 PDK1的代表性图像+/+和PDK1–/–脂质染料DilC染色的胚胎内皮细胞16（3） 使用蔡司LSM410显微镜。(G公司)E7.5 PDK1的尺寸+/+和PDK1–/–按照材料和方法中的描述对胚胎内胚层细胞进行定量。对每个基因型的两个胚胎进行了分析，并对每个胚胎中的120个细胞进行了测量(对< 0.0004).

然而，在E8.5（8到10个体节），PDK1的表型差异–/–胚胎变得明显。头部不太发达，像一个小而致密的肿块，虽然存在前中胚层，但仍没有体节，可见形成的神经管和增大的尿囊（图三C） ●●●●。

在E9.0–9.5，PDK1+/+胚胎已经翻转，并漂浮在羊膜囊内，脐带血管发达。相比之下，PDK1–/–胚胎还没有翻转，并沿着羊膜囊的顶部边缘躺着，头缩进胎膜，中断了正常的光滑轮廓（数据未显示）。E9.0 PDK1的尿囊–/–胚胎进一步发育并与胎盘接触，尽管未发现血管分化（图三D和E），胚胎和卵黄囊中可见血管（数据未显示）。

我们还调查了E7.5 PDK1的大小–/–和PDK1+/+使用定量体视学程序的胚胎内胚层细胞（参见材料和方法）。该分析表明PDK1–/–胚胎内胚层细胞明显较小，仅为野生型细胞的40%（图三F和G）。

检测E9-9.5 PDK1的表型–/–通过扫描电子显微镜对胚胎进行检查（图4)。该分析揭示了晚期和异常发育的特征：PDK1的后生长–/–胚胎似乎已经停止；体节不存在，胸前中胚层出现肿胀，这可能是由于体节细胞积聚所致（图三E和​和4A）；4A） ；神经管已闭合，但背根神经节缺失（图4A和C）；在一些胚胎中，耳窝清晰可见（图4D） ，但未见鳃弓（图4G和H）；并且没有心脏或心脏管（图4G） 。

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图4。E8.5 PDK1的扫描电镜图像+/+和E9.5 PDK1–/–胚胎。按照材料和方法中的描述，将胚胎解剖成PBS并准备用于扫描电子显微镜。(A类和C类——E类)E9.5 PDK1的背面视图–/–胚胎；(F类)和(H（H）)是E9.5 PDK1的背视图和腹视图+/+胚胎。(G公司)突变胚胎的腹视图，而(B类)是E8.5 PDK1的背面视图+/+胚胎。hd，头部；hf，头部褶皱；al，尿囊；nt，神经管；后脑开放部；pos，耳前沟；psm，眼前中胚层；rp，Rathke的眼袋；op，耳窝；所以，体节；ba，鳃弓；fb，前脑；*，无体节；#，无背根神经节；§，没有心。

值得注意的是，在E9.5 PDK1中头部发育正常–/–胚胎（图4D–H）。早期看到的头巾（图三B） 融合，有明显的耳前沟和后脑开放部分的开始（图4E） ●●●●。腹侧明显缺乏前脑，包括眼睛（图4G） ，一个可见的凹陷出现在Rathke囊的正确位置和时间，向间脑内陷形成垂体，这是正常E9.5胚胎的诊断（图4G和H）。PDK1未发现异常+/–与PDK1无法区分的胚胎+/+胚胎。

亚晶PDK1的分析飞行/飞行和PDK1–/fl突变小鼠

因为不可能生成可行的PDK1–/–小鼠，我们决定繁殖PDK1飞行/飞行和PDK–/fl小鼠以确定这些小鼠的组织是否显示PDK1水平降低，以及是否显示任何可识别的表型。PDK1飞行/飞行小鼠存活，出生时孟德尔频率略低于预期（～5%）（表我)。可行PDK1–/fl然而，也获得了出生频率比预期低约25%的小鼠（表我)。PDK1和飞行/飞行和PDK1–/fl小鼠可以生育（表我)。在图中5，我们量化了4个月大雄性PDK1八种不同组织中PDK1的特异性活性+/+，PDK1+/–，PDK1+/佛罗里达州，PDK1飞行/飞行，PDK1–/fl和PDK1flΔneo/flΔneo老鼠。在所有研究组织中，PDK1飞行/飞行与PDK1相比，小鼠的PDK1激酶活性降低了3-5倍+/+小鼠，而PDK1–/fl小鼠PDK1激酶活性降低了5到10倍。正如预期的那样，PDK1激酶活性恢复到野生型动物PDK1中观察到的水平flΔneo/flΔneo切除了新霉素抗性基因的小鼠。在大多数组织中，PDK1+/–和PDK1+/佛罗里达州与野生型动物相比，小鼠PDK1活性降低了25-50%（图5).

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图5。PDK1中PDK1活性降低飞行/飞行和PDK1–/fl老鼠。制备了所示小鼠的组织提取物。对PDK1进行免疫沉淀和分析。数据以平均值±SEM表示，代表三个单独的实验，每次测定一式三份。Δneo，flΔneo/flΔneo2。

低形态PDK1中PKB、S6K和RSK的正常激活–/fl老鼠

确定PDK1中PDK1的表达是否减少–/fl小鼠受损特征PDK1底物PDK1的激活+/佛罗里达州和PDK1–/fl将不同剂量的胰岛素、骨骼肌、肝脏和脂肪组织产生的提取物注射给同窝婴儿，并评估PKB、S6K和RSK活性（图6)。PKB的激活通过免疫印迹细胞裂解物和识别T环PDK1磷酸化位点（PKBα中的Thr308）和疏水基序（PKBβ中的Ser473）的PKB磷酸特异性抗体来确定。用于刺激受检组织中PKB T环或疏水基序磷酸化的胰岛素剂量没有重大差异（图6A） ●●●●。即使在诱导PDK1中可检测到的PKB磷酸化的最低剂量的胰岛素下+/佛罗里达州小鼠PDK1的组织中观察到类似的磷酸化–/fl老鼠。通过免疫沉淀该酶并测量其磷酸化肽底物的能力来检测S6K1活性（图6B） ●●●●。使用的胰岛素剂量是PDK1中显著激活S6K1的最低剂量+/+小鼠（数据未显示）。这些实验表明，S6K1在PDK1中的激活类似+/佛罗里达州和PDK1–/fl老鼠。胰岛素还刺激骨骼肌ERK1磷酸化（图6C） ，但在肝脏或脂肪细胞中检测不到（数据未显示）。这使我们能够比较PDK1骨骼肌中RSK的激活+/佛罗里达州和PDK1–/fl老鼠。在两个PDK1中，胰岛素同样激活RSK+/佛罗里达州和PDK1–/fl鼠标（图6C） ●●●●。我们还研究了非禁食PDK1中PKB、S6K和RSK亚型的活性+/佛罗里达州和PDK1–/fl未注射胰岛素的小鼠。在这些动物中，PKB、S6K和RSK在肌肉、肝脏和脂肪组织中的基础活性与未注射胰岛素的禁食小鼠中观察到的水平相似（数据未显示）。

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图6。PDK1中PKB、S6K1和RSK的激活正常–/fl老鼠。(A类)将小鼠禁食过夜，注射生理盐水（–）或增加剂量的胰岛素（0.0625、0.625、12.5或250 mU/g小鼠）10分钟，并按照材料和方法中的描述采集指示组织。用识别在Thr308（顶部面板，P-T308）和Ser473（中部面板，P-S473）磷酸化的PKBα或PKBα蛋白（底部面板，Total PKB）的抗体对裂解液进行免疫印迹。(B类)如上所述，但小鼠注射生理盐水或胰岛素（12.5 mU/g小鼠）20分钟。免疫沉淀并测定S6K1。(C类)如（B）所示，除了骨骼肌细胞裂解物用识别磷酸化ERK1/ERK2（P-ERK1）或ERK1/ERG2蛋白质（总ERK1，以及RSK1和RSK2亚型的抗体进行免疫印迹。值得注意的是，骨骼肌中ERK2的水平似乎低于我们可以检测到的水平。RSK亚型也进行了免疫沉淀和分析。对于显示的免疫印迹数据，在两个单独的实验中获得了结果。对于S6K和RSK酶测定，数据以两个单独实验的平均值±SEM表示，每次测定一式三份。

小尺寸PDK1亚形态小鼠

男性和女性低形态PDK1飞行/飞行小鼠出生时比PDK1小约30%+/+或PDK1+/佛罗里达州在他们的成年生活中一直保持着较小的体型。对于雄性小鼠，PDK1之间的重量差异飞行/飞行和PDK1+/+到6个月大时，小鼠增加到～45%，而雌性PDK1之间的差异飞行/飞行和PDK1+/+小鼠保持～30%（图7A） ●●●●。PDK1之间的重量差异更为显著–/fl和PDK1+/佛罗里达州同窝的人。男女PDK1–/fl小鼠分别比PDK1小45-50%和～35%+/+室友（图7B和C）。与PDK1尺寸的减小一致飞行/飞行和PDK1–/fl小鼠由于PDK1水平降低，无论是雄性还是雌性PDK1flΔneo/flΔneo小鼠的大小与PDK1相似+/+和PDK1+/佛罗里达州鼠标（图7C） ●●●●。

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图7。PDK1尺寸缩小飞行/飞行和PDK1–/fl老鼠。(A类)男女PDK1的平均体重+/+，PDK1+/佛罗里达州和PDK1飞行/飞行指定年龄的小鼠。数值代表每个数据点的平均值±SEM。数字(n个)图上显示了每个基因型的基因型。(B类)PDK1的代表性照片–/fl和PDK1+/佛罗里达州图中显示了E14.5、1周龄和6周龄的室友。(C类)如（A）所示的小鼠基因型。(D类)PDK1的肾脏、胰腺、脾脏和肾上腺的器官体积+/佛罗里达州和PDK1–/fl如材料和方法中所述，使用Cavalieri方法测量同窝婴儿。数据以每个基因型三只不同小鼠的平均值±SEM表示，仅显示大于符号大小的误差条。

接下来，我们比较了PDK1中肾脏、胰腺、脾脏和肾上腺的器官体积+/佛罗里达州和PDK1–/fl用定量卡瓦列里法分析同窝卵的切片(冈德森和延森，1987年)。PDK1中这四个器官的平均体积减小了约50%–/fl小鼠与PDK1的比较+/佛罗里达州室友（图7D） ●●●●。

PDK1调节细胞大小的证据

如果细胞大小正常但数量较少和/或细胞较小且数量相同，则可以解释PDK1亚型小鼠器官尺寸减小的原因。为了区分这些可能性，我们采用了一种定量无偏见的方法来测定完整器官中的细胞体积（如材料和方法中所述）。该方法使用一种称为分离原理的体视学方法，在估计细胞体积之前以无偏见的方式对细胞进行采样[其他非体视学的体积估计方法可能会产生有偏见的估计值（参见斯特里奥，1984年；冈德森，1986年)]。在肾上腺束状带中，我们发现PDK1–/fl细胞比PDK1小45%+/佛罗里达州单元格（图8B） 图中的和8A、 我们展示了这些肾上腺细胞的代表性切片。值得注意的是，两种PDK1中细胞核的大小–/fl和PDK1+/佛罗里达州类型没有显著差异（图8A和C）。将细胞体积数据与材料和方法中所述的细胞聚集体积的体视学估计相结合，我们可以估计束状带中的细胞总数。这些数据表明，PDK1肾上腺区域的细胞数量没有显著差异+/佛罗里达州和PDK1–/fl鼠标（图8D） ●●●●。

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图8。PDK1系列–/fl小鼠的肾上腺细胞较小。(A类)顶部面板显示了PDK1肾上腺束状带细胞的显微照片（放大×250）–/fl（右）和PDK1+/佛罗里达州（左）小鼠。这些面板代表了所拍摄的显微照片。(B类)使用材料和方法中所述的分离原理测量细胞大小。数据以PDK1的百分比表示为三个单独实验的平均值±SEM+/佛罗里达州单元格大小。星号表示PDK1的大小–/fl细胞显著(对<0.005）低于PDK1+/佛罗里达州细胞。(C类)原子核的大小也用离焦原理测量。数据以PDK1的百分比表示为来自两个单独实验的平均值±SEM+/佛罗里达州核尺寸。(D类)存在于束状带中的细胞数量是通过将束状带细胞的总体积除以单个细胞的体积来确定的。数据以三个独立实验的平均值±SEM表示。

PDK1诱导表达小鼠成纤维细胞的增殖和大小

从PDK1中分离出小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）+/佛罗里达州和PDK1–/fl胚胎和PDK1，与本研究的其他结果一致–/fl细胞PDK1激酶活性比PDK1低6倍+/佛罗里达州单元格（图9A） ●●●●。我们用Cavalieri方法测量了这些细胞的大小（图9B） ，这些结果表明PDK1–/fl细胞比PDK1小35%+/佛罗里达州细胞。我们还比较了PDK1的增殖率+/佛罗里达州和PDK1–/flMEF细胞经过5天的培养，发现其增殖速度没有显著差异（图9C） ●●●●。我们还分析了PDK1的活性+/佛罗里达州和PDK1–/flMEF细胞凋亡TUNEL分析。PDK1中观察到极低水平的凋亡细胞+/佛罗里达州和PDK1–/flMEF细胞在血清中生长，通过添加非特异性激酶抑制剂staurosporine诱导这些细胞凋亡。PDK1与PDK1之间的细胞凋亡无差异+/佛罗里达州和PDK1–/flMEF电池（图9D） ●●●●。去除血清中MEF细胞24小时后，两种细胞类型的基本凋亡水平均未显著增加（数据未显示）。

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图9。PDK1系列–/flMEF细胞小于PDK1+/佛罗里达州但是以相同的速率增殖。(A类)PDK1由PDK1免疫沉淀而来+/佛罗里达州和PDK1–/fl从原代MEF细胞裂解细胞并进行分析。分析一式三份，以两个独立实验的平均值±SEM表示。(B类)PDK1的大小+/佛罗里达州和PDK1–/flMEF细胞采用材料和方法中所述的Cavalieri方法进行测量。36个PDK1+/佛罗里达州和32个PDK1–/fl对细胞进行分析。(C类)PDK1的扩散+/佛罗里达州和PDK1–/flMEF细胞按照材料和方法中的描述进行测量。数据以四个独立实验的平均值±SEM表示。(D类)PDK1的凋亡+/佛罗里达州和PDK1–/flMEF细胞通过TUNEL分析使用荧光就地细胞死亡检测方法。细胞生长到50%的汇合处，然后在有（+）或无（-）5µM staurosporine的情况下处理以诱导凋亡。根据制造商的说明进行荧光细胞死亡检测，并对每种情况下的150个细胞进行分析。在两个实验中获得了类似的结果。

讨论

我们之前证明，尽管PKB、S6K和RSK在PDK1中不能被激活，但缺乏PDK1的小鼠ES细胞在形态学上与野生型细胞无法区分，并且以相同的速度增殖–/–单元格(Williams等人，2000年)。因此，至少对于ES细胞来说，PDK1在本质上并不是生存和增殖所必需的。然而，其他研究已经证实，在酵母中(Casamayor等人，1999年；Inagaki等人，1999年；Niederberger和Schweingruber，1999年),线虫(Paradis等人，1999年)和果蝇属，PDK1同源物在调节正常发育和生存中起着关键作用。具体而言，PDK1-缺陷果蝇属胚胎在早期幼虫阶段死亡(Cho，K.S.等人，2001年；Rintelen等人，2001年)。在这里，我们证明了PDK1在哺乳动物系统中对正常发育的重要性。PDK1在小鼠E7-9胚胎中普遍表达（图2)。PDK1系列–/–胚胎明显完成原肠胚形成，体积较小，从E8.5天开始，出现明显异常，包括体节、背根神经节、前脑以及后脑区发育和循环系统缺失。体节的缺乏似乎不仅仅是分割的失败，因为闭合的神经管外侧没有中胚层，也没有鳃弓，这可能是由于组织组织的改变或细胞死亡造成的（图4A和C）。突变胚胎中缺少鳃弓和背根神经节表明神经嵴的规格和/或迁移存在问题。PDK1中尿囊后无明显发育–/–胚胎，表明PDK1是正常后部生长所必需的，也可能是该区域肿胀的原因（图三E和​和4A）。4A） ●●●●。PDK1系列–/–胚胎缺乏前脑形态，因此缺乏眼睛（图4G） ●●●●。这些观察结果表明PDK1在前脑规范中发挥作用。有趣的是，尽管没有前脑，中脑和后脑的发育相对正常（图4E） 头皮融合，弯曲形成，Rathke眼袋出现（图4G） ●●●●。此外，在PDK1中–/–胚胎，尽管缺乏体节或背根神经节，神经管仍被E9.5封闭（图4A和C）。死亡原因似乎是由于缺乏功能性循环。然而，应该注意的是，在PDK1中没有相邻结构的情况下，形态区域的一些发育程序相对正常地进行–/–胚胎。

许多证据表明，细胞的生长和增殖受独立的信号通路调节(Neufeld和Edgar，1998年；Conlon和Raff，1999年；科埃略和利弗斯，2000年；Conlon等人，2001年)。在识别参与这些过程的信号成分方面取得了一些进展，在果蝇属确定了胰岛素受体/PI3-激酶途径在调节细胞大小和数量方面的重要性（在科埃略和利弗斯，2000年；Kozma和Thomas，2002年)。例如，dPI3-激酶的过度表达(Leevers等人，1996年；Weinkove等人，1999年)或PtdIns（3,4,5）P失活三3-磷酸酶dPTEN(Goberdhan等人，1999年；Huang等人，1999年；Scanga等人，2000年)导致细胞数量和细胞大小增加。此外，胰岛素受体底物适配器蛋白的苍蝇同源物Chico的功能丧失突变体(Bohni等人，1999年)dPI 3-激酶或dPTEN过度表达导致细胞大小和数量减少。最近，发现dPDK1的部分功能丧失突变导致苍蝇体重减少15%，细胞数量减少7%(Rintelen等人，2001年)。后一个观察结果与我们在PDK1亚型小鼠肾上腺中的发现相反，PDK1的束状带细胞体积减少，但细胞数量相同（图8).

dS6K1的失能突变体(Montagne等人，1999年)或dPKB减少果蝇属单元大小不影响单元数(Verdu等人，1999年；Scanga等人，2000年)。PKB和S6K在小鼠中也被敲除，但这些研究由于存在两种不同基因编码的S6K亚型（S6K1和S6K2）和三种PKB亚型（PKBα、PKBβ和PKBγ）而变得复杂，而这两种亚型是由不同的基因编码的果蝇属具有这些酶的一种亚型。缺乏S6K1的小鼠可以存活，但成年小鼠体积小15%，器官重量减少10-20%(Shima等人，1998年)。随后发现S6K1基因敲除小鼠的胰岛β细胞尺寸减小，但其他类型细胞的尺寸明显未受影响(Pende等人，2000年)。据报道，缺乏PKBα的小鼠比野生型动物小20%，但尚不确定缺乏PKBβ是否会导致细胞大小或细胞数量减少(Chen等人，2001年；Cho，H.等人，2001b)。相反，PKBβ的缺失导致胰岛素抵抗，但不影响小鼠大小(Cho，H.等人，2001a).

PDK1在小鼠中的研究仅因存在该酶的单一亚型而便利。在这项研究中，我们证明了许多不同组织中PDK1的水平与小鼠的整体大小和器官体积之间存在着很强的相关性（图5和​和7）。7)。PDK1系列–/fl表达约10–20%正常水平PDK1的低形态突变小鼠较小40–50%，器官体积相应减少（图7)。尽管如此，PDK1–/fl老鼠很健康，甚至可以生育（表我).

通过使用定量方法，我们证明在PDK1的肾上腺中–/fl动物的束状带细胞数量相同，但它们小45%。有趣的是，两种PDK1的细胞核大小相同–/fl和PDK1+/佛罗里达州束状带细胞，表明PDK1的减少是由细胞质体积的特定减少引起的。因此，调控细胞核大小的途径独立于那些控制细胞质体积的途径。与细胞大小是细胞本身的遗传决定因素相一致，我们发现从PDK1培养的原代MEF细胞–/fl小鼠也比PDK1细胞小35%+/佛罗里达州动物（图9B） ●●●●。与调节细胞大小和增殖的单独途径一致(Conlon和Raff，1999年；科埃略和利弗斯，2000年)，我们发现PDK1–/fl和PDK1+/佛罗里达州MEF细胞增殖速度相同，尽管大小不同（图9C） ●●●●。发现完全缺乏PDK1的胚胎内胚层细胞比野生型细胞小60%（图三F和G）。

需要解决的一个关键问题是：PDK1调节哺乳动物细胞大小的机制是什么？我们的数据表明，尽管PDK1的水平和活性在PDK1中显著降低–/fl小鼠，用低剂量胰岛素注射这些动物仍然可以诱导肝脏、脂肪和骨骼肌中PKB和S6K的正常激活（图6)。正如引言中所讨论的，PDK1在调节RSK AGC激酶活性方面也起着关键作用，但在PDK1的骨骼肌中，RSK亚型的激活程度相似–/fl和PDKl飞行/飞行注射胰岛素后的小鼠。此外，我们在PDK1中发现飞行/飞行ES细胞（图1)和PDK1–/flMEF电池（图9)PDK1水平显著降低，IGF1诱导的PKB和S6K激活是正常的，TPA诱导的RSK激活也是正常的（M.A.Lawlor，未发表的数据）。因此，在PDK1亚型小鼠以及ES和MEF细胞中，仍然存在足够的PDK1来触发其三种已知胰岛素刺激底物的正常磷酸化。这些观察结果可能表明，PDK1可以独立于S6K、PKB或RSK调节细胞大小。然而，不能排除的是，在组织发育过程中，低形态小鼠中PDK1的水平不足以完全激活PKB、S6K或RSK，以响应未知的内源性刺激物调节细胞尺寸。也有人认为PDK1可以通过其非催化N末端与PI3-激酶调节的Ral-GTP交换因子相互作用，从而激活PDK1(田等., 2002)。据我们所知，Ral GTPase尚未参与调节细胞大小，但在未来的研究中，研究PDK1亚型小鼠中Ral GTPase的激活是否有缺陷可能很重要。最近，发现缺乏p190-B Rho GTPase的小鼠体积小30%，这表明这种体积的减少是通过Ser133转录因子CREB的磷酸化介导的(索尔代拉等., 2002)。我们分析了PDK1不同组织中CREB磷酸化+/佛罗里达州和PDK1–/fl小鼠和未观察到任何显著差异（数据未显示），表明PDK1并没有通过此机制调节细胞大小。

总之，我们提供了确凿的遗传学证据，证明哺乳动物胚胎发育需要PDK1，因为胚胎中完全缺乏PDK1会导致多种缺陷，最终导致胚胎死亡。有趣的是，PDK1的水平比野生型小鼠低10倍，足以使胚胎正常发育，产生可存活和可繁殖的动物。然而，小鼠体内PDK1水平的降低不足以影响PKB、S6K或RSK在胰岛素注射反应中的激活，这对其整体身体和器官大小有很大影响，并且这种影响似乎主要是通过细胞大小而不是数量的减少起作用。未来研究的一个关键挑战是确定PDK1调节哺乳动物细胞大小的机制。

材料和方法

材料

塔克DNA聚合酶购自Promega。蛋白酶抑制剂鸡尾酒片、DNA分子量标记物、T7 RNA聚合酶、荧光原位细胞死亡检测试剂盒和地高辛RNA标记混合物由罗氏公司提供。Bradford试剂由Pierce提供，staurosporine由Calbiochem提供。人胰岛素购自诺和诺德，电子显微镜级葡-塔醛购自西格玛。脂类染料1,1′-二己基癸基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐[DilC16（3） ]购自Molecular Probes。

抗体

识别在Ser473和Thr308磷酸化的PKB以及总的和激活的ERK1/ERK2的磷酸化特异性抗体来自细胞信号。抗地高辛-AP、Fab片段抗体由罗氏分子生物化学公司提供。针对RKIQEVWRQQYQSNPDAAVQ序列（小鼠PDK1的540-559残基；威廉姆斯等2000年); 针对人类蛋白的残基1–421（包含T412E和His标签）产生识别S6K1的抗体。针对大鼠PKBα的序列RPHFPQFSYSASGTA（残基466-480）提高PKB总抗体，针对人类RSK2的肽RNQSPVLEPVGRSTLAQRRGIKK（残基712-734）提高识别RSK亚型的抗体。

嵌合体和突变小鼠的产生及基因型分析

PDK1的ES细胞系+/佛罗里达州，PDK1+/–和PDK1flΔneo/flΔneo如前所述生产(Williams等人，2000年)。嵌合体小鼠是使用标准方案生成的。简而言之，PDK1的杂合ES细胞克隆+/佛罗里达州，PDK1+/–和PDK1flΔneo/flΔneo将其注射到C57Black6×Balb/c囊胚中，然后将其重新植入受体雌性小鼠。通过皮毛颜色鉴定出具有高度ES细胞贡献的嵌合体小鼠，然后将其与Balb/c小鼠和杂合小鼠杂交，通过灰色皮毛鉴定出杂合小鼠。利用从尾部或胚胎膜分离的基因组DNA进行PCR基因分型。使用位于第四内含子[sense引物（p99），5′-ATCCCAAGTTACTGAGTGTGTTGGAAG-3′；antisense引物（p 100r），5’-TGTGGACAAACAGCAATGAACATACACGC-3′；见图1A] ●●●●。PDK1（fl）等位基因的存在是通过一个针对新霉素耐药基因的特异性引物和一个存在于第二内含子中的引物来检测的PDK1系列基因[sense引物（p80），5′-CTATGC TGTGTTACTTGGAGCAG-3′；反义引物（p81r），5’-TGCCGAAAAATGGCCG-3′；见图1A] ●●●●。使用引物p80和p100r检测PDK1（–）等位基因（见图1A） ●●●●。进行30个循环（变性1 min，94°C；退火2 min，63°C；伸长率3 min，72°C），并用2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。

全贴装原位杂交

阴道塞当天中午被视为胚胎发生时间的性交后0.5天。当胚胎从蜕膜中取出时，根据形态学标准分期(考夫曼，1992年)并按上述方法进行基因分型。胚胎在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的4%多聚甲醛中固定过夜，并进行整体固定就地如前所述，使用地高辛-UTP标记的单链RNA探针进行杂交(威尔金森，1992年)。PDK1 RNA探针是通过亚克隆1.45 kb巴姆上半年–巴姆与小鼠PDK1 cDNA（DDBJ/EMBL/GenBank登录号：。NM_011062)进入pBSks质粒。将质粒线性化后，使用T7 RNA聚合酶生成0.7 kb反义RNA探针Bgl公司一、。

扫描电子显微镜

将胚胎固定在1.25%戊二醛、1%多聚甲醛和0.08 M pH值为7.2、含有0.02%CaCl的二羧酸缓冲液中2在室温下保持1小时，在4°C下过夜。随后在二甲氨基甲酸缓冲液中清洗，并在1%OsO中固定4在水中，按照标准方案用酒精清洗和脱水。然后将胚胎转移到100%丙酮中，并在临界点干燥。最后，用Au/Pd涂覆它们，并在高真空模式下在FEI XL30 ESEM中成像。

器官体积、细胞大小和细胞数的测定

使用Cavalieri方法测定器官体积(冈德森和延森，1987年)。简言之，取脾、肾和胰腺，将其浸泡在10%福尔马林中性缓冲盐水溶液中固定，然后包埋在石蜡中。肾上腺在4°C下固定在含有多聚甲醛（4%）和戊二醛（1%）的PBS中至少1天，然后嵌入环氧树脂中。从随机起始位置（见下文），在系统间隔的位置采集截面。切片厚度为7µm（脾、肾和胰腺）和1µm（肾上腺）。切片用苏木精和伊红（脾、肾、胰腺）或理查森染色（肾上腺）染色，并在蔡司轴镜显微镜（40倍放大）上使用数码相机或显微镜载玻片在2000 d.p.i.下以透射模式直接扫描。然后使用Photoshop 4.0或5.5版程序和点数（网格直角）在图片上叠加一个方形网格(对)击打器官被计算在内(对PDK1的范围为250至600–/fl和PDK1+/佛罗里达州小鼠）。然后使用以下公式估算器官体积：

∑对×天2×k个

在哪儿天，正方形网格的每个点之间的距离，脾脏、肾脏和胰腺为500µm，肾上腺为134µm。对于脾、肾和胰腺，间隔，k个每个切片之间的厚度为350–450µm，肾上腺的厚度为150µm。

E7.5 PDK1的电池尺寸+/+和PDK1–/–胚胎用卡瓦列里法测量。将胚胎解剖成PBS，并将其固定在1.0%戊二醛、1%多聚甲醛和0.08 M pH 7.2的含有0.02%CaCl的二羧酸缓冲液中2在室温下培养1小时，然后在4°C下培养过夜。胚胎在PBS中清洗三次，并在室温下用脂质染料1,1′-二十六烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁高氯酸盐[DilC16（3） ]在50µg/ml的PBS中。使用蔡司LSM410显微镜在与胚胎内胚层最外周单细胞层近似正交的随机位置采集四到五个Z系列（每个系列20个切片）。通过将禁线二维计数规则应用于放置在Z系列细胞板上的采样象限，选择细胞轮廓。按上述方法确定体积对范围为30至40；天厚度为2.25µmk个为1µm。每个细胞至少分析10个切片。

使用Cavalieri方法测量MEF细胞大小。细胞生长到50%的汇合处，胰蛋白酶化，造粒并覆盖固定剂（PBS和1%戊二醛）。在嵌入环氧树脂后，切割半薄（0.2µm）切片，用Richardson染色，并在100倍放大率下拍照。如上所述，在切除器选择的细胞上测定体积对范围从45到110；天厚度为2.85µmk个为2µm。每个细胞至少分析六到七个切片。

肾上腺束状带层的细胞和细胞核的体积是用离散器原理估算的(斯特里奥，1984年；冈德森，1986年)。分离肾上腺，将其固定在含有多聚甲醛（4%）和戊二醛（1%）的PBS中，并包埋在树脂中。在整个器官的五个或六个系统间隔的位置采集一对连续的1.0-µm切片。以250倍放大率拍摄这些切片，并在Photoshop 4.0或5.5中依次将取样样方应用于穿过束状体层厚度的切片。根据禁止线二维无偏计数规则选择属于束状细胞的细胞核轮廓（忽略内皮细胞核），并计算为Q——如果他们在相邻的查找区消失了。在两个方向上使用检测器可以提高效率。对于每个PDK1–/fl肾上腺——范围在90到115之间，PDK1+/佛罗里达州肾上腺，40–55Ω——被计算在内。使用带有方形网格（间距10µm）的点计数来估计从每个计数帧投射到分隔器中的细胞空间的总体积。细胞体积的计算公式如下：

(∑对/∑Q——) ×天2×t吨

在哪儿对是撞击束状体细胞细胞质和细胞核的点数，天是方形网格上两点之间的距离（10µm），以及t吨是截面厚度。核的体积也使用分离原理测量，但有一个差异：对是仅撞击束状带细胞核的点数。束状带细胞的总体积（使用Cavalieri的估计器如上所述确定）除以该器官的单个细胞的体积，即可计算束状带中的细胞数。

组织细胞培养

从E13.5胚胎中分离出原代MEF细胞，并按照标准程序进行培养。在第五代以后，细胞没有被使用。通过以1.25×10的密度电镀每个基因型的MEF细胞来测量细胞增殖5在直径3.5厘米的6孔板上。每隔24小时对细胞进行胰蛋白酶处理，并用血细胞仪计数细胞数量。如前所述培养并裂解ES细胞(威廉姆斯等2000年).

组织提取物的制备、免疫印迹和蛋白激酶测定

在隔夜禁食后，通过最终麻醉小鼠的下腔静脉注射一团胰岛素或生理盐水。在刺激10分钟（PKB）或20分钟（S6K1和p90 RSK）后采集脂肪、腓肠肌和股四头肌（集合）骨骼肌和肝组织，并立即在液氮中快速冷冻。将组织储存在-80°C下，并在液氮中均质成粉末。向粉末状组织中添加5倍质量过剩的冰镇50 mM Tris–HCl pH 7.5、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、1%（w/v）Triton X-100、0.1%（v/v）β-巯基乙醇、1 mM.原钒酸钠、50 mM氟化钠、5 mM焦磷酸钠、1µM微囊藻毒素-LR和每50 ml缓冲液一片“完整”蛋白酶抑制剂，在冰上培养30分钟，然后在4°C下在13000下离心5分钟克去除不溶性物质。将上清液在液氮中快速冷冻成等分试样，并在-80°C下储存。PKB、S6K和RSK亚型的激活状态通过免疫印迹提取物（20µg）和所示的磷酸特异性抗体进行评估，并按照前面所述从细胞提取物中进行免疫沉淀(Williams等人，2000年).

致谢

我们要感谢谢丽尔·蒂克尔教授进行了大量有益的讨论，并对手稿进行了批判性阅读。我们感谢信号转导治疗部（DSTT）的操作团队制备抗体，感谢Agnieszka Kieloch在组织培养方面的帮助，感谢Calum Thomson在细胞大小研究方面的技术帮助，感谢Birgit Lane和Angus Lamond使用显微镜。J.M.L.得到了威康信托基金会的研究休假奖学金（059767/Z/99/Z）的支持，D.R.a.感谢国际癌症研究协会、英国糖尿病协会、英国医学研究委员会，以及支持邓迪DSTT部门的制药公司（阿斯利康、勃林格殷格翰、葛兰素史克、诺和诺德和辉瑞）。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团