A phosphoserine-regulated docking site in the protein kinase RSK2 that recruits and activates PDK1

doi:10.1093/emboj/19.12.2924

.2000年6月15日；19(12):2924-34.

doi:10.1093/emboj/19.12.2924。

蛋白激酶RSK2中一个磷酸丝氨酸调节的对接位点，可招募并激活PDK1

M Frödin先生¹, C J延森, K梅里恩, S Gammeloft公司

附属公司

PMID： 10856237
预防性维修识别码：项目编号：C203368
内政部： 10.1093/emboj/19.12.2924

蛋白激酶RSK2中一个磷酸丝氨酸调节的对接位点，可招募并激活PDK1

M Frödin先生等。欧洲工商管理硕士J. 2000.

.2000年6月15日；19(12):2924-34.

doi:10.1093/emboj/199.12.2924。

作者

M Frödin先生¹, C J詹森, K梅里恩, S Gammeloft公司

附属

¹丹麦Glostrup DK-2600 Glostrop医院临床生物化学部。mf@dcb-glostrup.dk

PMID： 10856237
预防性维修识别码：项目编号：C203368
内政部： 10.1093/emboj/19.12.2924

摘要

90kDa核糖体S6激酶-2（RSK2）是一种具有两个激酶结构域的生长因子刺激蛋白激酶。RSK2的C末端激酶被ERK型MAP激酶激活，导致RSK2在Ser386的疏水基序中发生自磷酸化。N-末端激酶由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）通过Ser227的磷酸化激活，并磷酸化RSK的底物。这里，我们确定RSK2疏水基序中的Ser386是PDK1的磷酸化依赖性对接位点和活化剂。用生长因子处理细胞可诱导PDK1向Ser386-磷酸化疏水基序的募集，并在Ser227诱导RSK2磷酸化。RSK2-S386K突变体与PDK1无相互作用或Ser227的磷酸化。与Ser386-磷酸化RSK2的相互作用诱导PDK1的自磷酸化。添加合成磷酸化Ser386肽（RSK2（373-396））可使PDK1活性在体外增加6倍。最后，RSK2和MSK1（一种RSK相关激酶）的突变体对PDK1的亲和力增强，在体内具有组成活性，并磷酸化组蛋白H3。我们的结果表明，一种基于磷酸丝氨酸介导的PDK1向RSK2的募集的新调节机制，导致PDK1和RSK2协同磷酸化和活化。

PubMed免责声明

数字

**图1。**RSK2的结构和调节性磷酸化位点。RSK由两个激酶结构域组成，由一个调节性连接区连接。C端子尾部包含ERK的对接位置（Gavin和Nebreda，1999；Smith等., 1999). 显示了五个磷酸化位点的位置以及磷酸化这些位点的激酶。Ser227、Ser369、Ser386和Thr577的磷酸化调节激酶活性，而Thr365磷酸化的作用尚不清楚（小鼠RSK2编号）。氨基酸序列显示PDK1共有磷酸化基序和带有保守残基的粗体疏水基序。比对表明，这两个基序存在于许多生长因子活化激酶中，包括RSK、MSK、p70 S6K、PKBα、PKCδ、SGK和PRK2。需要磷酸化才能激活激酶的丝氨酸/苏氨酸以红色显示。序列为人类，RSK1（大鼠）、RSK2和PKCδ（均为小鼠）除外。

**图2。**RSK2缺失突变体的激酶活性体内用表达HA表位标记的全长RSK2或缺失突变体的质粒转染COS7细胞。48小时和最后3小时血清饥饿期后，裂解细胞，并用Ab将RSK沉淀到HA表位标签上，并进行激酶测定（下图）。数据表示为来自未刺激细胞的全长RSK2的百分比，是重复进行的三个独立实验的平均值±SD。RSK2的活动_1–389和未刺激的RSK2是不同的(第页<0.001）与未折旧相比t吨-测试。激酶分析后，对RSK进行SDS–PAGE并用抗体免疫印迹HA表位标签（上面板）。

**图3。**疏水基序在调节RSK2 N末端激酶磷酸化位点中的作用。用表达HA表位标记的野生型RSK2或突变型RSK1的质粒转染COS7细胞。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，将细胞暴露于（或不暴露于）20 nM EGF中20分钟并溶解。此后，RSK从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA表位。(A类)测定RSK的激酶活性，并将其表示为基础RSK2的百分比_1–389活动。数据是重复进行的四个独立实验的平均值±SD。以下条形图的数据与未成对条形图相比有所不同t吨-测试：3对5(第页<0.001); 3对7(第页<0.05). 激酶分析后，将沉淀的RSK的等分样品进行SDS–PAGE和Abs免疫印迹，Abs在Ser386磷酸化时结合RSK2(B类)，序列227(C类)，Thr365(D类)或Ser369(E类)，或将Ab添加到HA标签(F类).

**图4。**RSK2中Ser227的磷酸化需要Ser386。用表达HA标记的RSK2或RSK2-S386K的质粒转染COS7细胞。在48小时和最后3小时血清饥饿期后，将细胞暴露于或不暴露于20nM EGF 20分钟并裂解。(A类)RSK从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签，测定其激酶活性，并以EGF刺激的野生型RSK2活性的百分比表示。数据是重复进行的三个独立实验的平均值±SD。激酶分析后，将沉淀的RSK的等分样品进行SDS–PAGE和Abs免疫印迹，Abs在Ser227磷酸化时结合RSK2(B类)，Thr365(C类)，369系列(D类)或将Ab标记为HA表位标签(E类).

**图5。**RSK2需要Ser386才能与PDK1交互。用表达myc-PDK1和HA-RSK2或HA-RSK2-S386K的质粒共同转染COS7细胞。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，对细胞进行裂解，并对细胞裂解产物进行HA标记抗体免疫沉淀。对沉淀物的等分试样进行SDS–PAGE和用Ab对PDK1上的myc表位标签进行免疫印迹(A类)或RSK2上的HA表位标签(B类)。通过对免疫沉淀前裂解产物进行myc标记的免疫印迹，验证PDK1在细胞中的平等表达(C类)。实验进行了三次，结果相似。

**图6。**PDK1通过Ser386-磷酸化疏水基序与RSK2相互作用。用表达myc-PDK1、HA-RSK2、HA-RSK2突变体、MEK-S217/221E的质粒或空载体（-）转染COS7细胞，如各面板所示。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，细胞被溶解。(A类)用Ab对细胞裂解物进行HA标记免疫沉淀，然后对沉淀的等分部分进行SDS–PAGE，并用Ab免疫印迹PDK1中的myc标记或RSK2中的HA标记。(B类)细胞裂解物在含有或不含磷酸酶抑制剂（原钒酸盐、花萼蛋白、氟化钠）的裂解缓冲液中用抗体对HA标签进行免疫沉淀。将等分的沉淀物进行SDS–PAGE和Ab免疫印迹，使其与PDK1中的myc标记、RSK2中的phosphosphoSer386或RSK2的HA标记结合。(C类)细胞裂解物经抗体免疫沉淀至RSK2的CTK结构域。将等分的沉淀物进行SDS–PAGE和Ab免疫印迹，使其与PDK1中的myc标记、RSK2中的phosphosphoSer386或RSK2的HA标记结合。实验进行了三次，结果相似。

**图7。**在生长因子处理的细胞中招募PDK1至RSK2。如图所示，COS7细胞与表达激酶缺陷型（KD）myc-PDK1和HA-RSK2或HA-RSK2-S386K的质粒共转染。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，将细胞暴露于或不暴露于20 nM EGF中25分钟，然后溶解。将细胞裂解物与HA标签上的Ab进行免疫沉淀。将等分的沉淀物进行SDS–PAGE并用抗体对PDK1中的myc标记进行免疫印迹(A类)或RSK2中的HA标签(B类)。通过对免疫沉淀前裂解产物进行myc标记的免疫印迹，验证PDK1在细胞中的平等表达(C类)。实验进行了三次，结果相似。

**图8。**PDK1与RSK2的Ser386-磷酸化疏水基序结合后的自磷酸化体内. (A类和B类)如图所示，COS7细胞与表达野生型或突变型myc-PDK1和HA-RSK2的质粒以及MEK-S217/221E共同转染。KD表示激酶缺陷突变体。转染后48小时，细胞被血清饥饿3小时。随后，在SDS-PAGE样品缓冲液中对细胞进行裂解，并进行SDS-PACE和抗体对PDK1中myc标记的免疫印迹。实验进行了三次，结果相似。

**图9。**含有磷酸化-Ser386的RSK2肽诱导PDK1的自磷酸化*在体外*免疫纯化的myc-PDK1单独（不添加）或与10µM S6肽或RSK2肽残基373–396预孵育20分钟，其未磷酸化（Ser386肽）或在Ser386磷酸化（pSer386肽类）。(A类)允许PDK1在存在[γ]的情况下自动磷酸化20分钟-³²P] ATP，然后对反应进行SDS-PAGE和放射自显影。(B类)允许PDK1在存在或不存在ATP的情况下自动磷酸化35分钟，然后对反应进行SDS-PAGE和抗体免疫印迹以识别PDK1中的myc标记。实验进行了两次，结果相似。

**图10。**含有磷酸化Ser386的RSK2肽激活PDK1在体外免疫纯化的myc-PDK1单独（不添加）或与10µM S6肽、Ser386肽或pSer386肽类预先孵育20分钟。(A类和C类)然后用[γ]孵育PDK1 10分钟-³²P] ATP和2微克RSK2_1–373KD或0.5µg RSK2_1–360作为底物，如每块面板所示，然后对反应进行SDS–PAGE和放射自显影。(B类)（A）中PDK1活性通过定量加入RSK2的放射性测定_1–373KD使用荧光成像仪。数据表示为pSer386肽存在时PDK1活性的百分比，是三个独立实验的平均值±SD。以下条形图的数据与未成对条形图相比没有差异t吨-测试：1对2或3(第页>0.2）。条形图1和条形图4中的数据与未成对数据相比有所不同t吨-测试(第页<0.001).

**图11。**RSK2和MSK1的组成活性突变体。用表达HA-标记野生型或突变型RSK2或MSK1和myc-标记PDK1的质粒转染COS7细胞，如每个面板所示。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，将细胞暴露于（或不暴露于）20 nM EGF中20分钟并溶解。(A类)用抗体从细胞裂解液中沉淀RSK2至HA标签，并进行激酶分析（下面板）。数据表示为EGF-刺激的全长RSK2活性的百分比，是重复进行的3-4个独立实验的平均值±SD。以下条的数据与未干燥的相比有所不同t吨-测试：3对6(第页<0.05）；3对7(第页<0.01). 激酶分析后，沉淀物用抗体对HA标签进行免疫印迹（上面板）。(B类)MSK1从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签，测定其激酶活性，并以EGF刺激的野生型MSK1活性的百分比表示（下表）。数据是重复进行的四个独立实验的平均值±SD。激酶分析后，用抗体对MSK进行HA标签免疫印迹（上面板）。(C类)MSK1突变体从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签。用抗体对PDK1中myc标记或MSK1中HA标记的沉淀进行免疫印迹。通过对免疫沉淀前裂解产物进行myc标记的免疫印迹，验证PDK1在细胞中的平等表达。实验进行了三次，结果相似。(D类)MSK1突变体从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签，并进行激酶分析（下面板）。数据以CA-MSK1活性的百分比表示，是重复进行的三个独立实验的平均值±SD。激酶分析后，沉淀物用抗体对HA标签进行免疫印迹（上面板）。

**图11。**RSK2和MSK1的组成活性突变体。用表达HA-标记野生型或突变型RSK2或MSK1和myc-标记PDK1的质粒转染COS7细胞，如每个面板所示。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，将细胞暴露于（或不暴露于）20 nM EGF中20分钟并溶解。(A类)用Ab将RSK2从细胞裂解物中沉淀到HA标签上，并进行激酶测定（下图）。数据表示为EGF-刺激的全长RSK2活性的百分比，是重复进行的3-4个独立实验的平均值±SD。以下条的数据与未干燥的相比有所不同t吨-测试：3对6(第页<0.05）；3对7(第页<0.01). 激酶分析后，沉淀物用抗体对HA标签进行免疫印迹（上面板）。(B类)MSK1从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签，测定其激酶活性，并以EGF刺激的野生型MSK1活性的百分比表示（下表）。数据是重复进行的四个独立实验的平均值±SD。激酶分析后，用抗体对MSK进行HA标签免疫印迹（上面板）。(C类)MSK1突变体从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签。沉淀用Ab对PDK1中的myc标签或MSK1中的HA标签进行免疫印迹。通过对免疫沉淀前裂解产物进行myc标记的免疫印迹，验证PDK1在细胞中的平等表达。实验进行了三次，结果相似。(D类)MSK1突变体从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签，并进行激酶分析（下面板）。数据以CA-MSK1活性的百分比表示，是重复进行的三个独立实验的平均值±标准差。激酶分析后，沉淀物用抗体对HA标签进行免疫印迹（上面板）。

**图12。** 体内RSK2和MSK1的核靶向、组成活性突变体对组蛋白H3和CREB的磷酸化。用表达HA标记野生型或突变型RSK2或MSK1的质粒转染COS7细胞。NLS，核定位序列。在24小时和最后3小时血清饥饿期后，将细胞暴露于或不暴露于20 nM EGF 25分钟。细胞在SDS–PAGE样品缓冲液中进行裂解，并用Abs对Ser10磷酸化的组蛋白H3进行免疫印迹(A类)，到HA标签(B类)或至Ser133磷酸化的CREB(C类).

**图13。**PDK1和RSK2的招募和协调激活模型。（1）静止细胞包含一个由非活性RSK和ERK预先形成的复合物。（2）刺激Ras–ERK途径导致ERK催化的连接物和CTK磷酸化，导致疏水基序（蓝框）中Ser386处RSK2的自磷酸化。（3）疏水基序中Ser386的磷酸化产生一个对接位点，允许PDK1和RSK2之间形成复合物。（4） PDK1与Ser386-磷酸化疏水基序的相互作用刺激PDK1活性和自身磷酸化。PDK1局部浓度的增加和激酶活性的结合确保了Ser227的有效磷酸化，从而导致RSK的完全激活。

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

p90核糖体S6激酶2与蛋白磷酸酶2Cdelta相关并被其去磷酸化。
Doehn U、Gammeloft S、Shen SH、Jensen CJ。 Doehn U等人。生物化学杂志2004年9月1日；382（第2部分）：425-31。doi:10.1042/BJ20040948。生物化学杂志2004。 PMID：15206906 免费PMC文章。
90-kDa核糖体S6激酶被磷酸化并被3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1激活。
Jensen CJ、Buch MB、Krag TO、Hemmings BA、Gammeloft S、Frödin M。 Jensen CJ等人。生物化学杂志。1999年9月17日；274(38):27168-76. doi:10.1074/jbc.274.38.27168。生物化学杂志。1999 PMID：10480933
AGC激酶和PDK1中的磷酸丝氨酸/苏氨酸结合囊通过疏水基序磷酸化介导活化。
Frödin M、Antal TL、Dümmler BA、Jensen CJ、Deak M、Gammeltoft S、Biondi RM。 Frödin M等人。 EMBO J.2002年10月15日；21(20):5396-407. doi:10.1093/emboj/cdf551。 EMBO J.2002。 PMID：12374740 免费PMC文章。
Ser/Thr蛋白激酶通过停靠位点介导的相互作用的信号特异性。
阿联酋内布拉达州比昂迪RM。 Biondi RM等人。《生物化学杂志》2003年5月15日；372（第1部分）:1-13。doi:10.1042/BJ20021641。生物化学杂志2003。 PMID：12600273 免费PMC文章。审查。
RSK2及其在细胞增殖、转化和癌症发展中的结合伙伴。
周YY。周YY。 Arch Pharm Res.2017年3月；40(3):291-303. doi:10.1007/s12272-016-0880-z。Epub 2016年12月24日。 2017年《Arch Pharm Res.》。 PMID：28013489 审查。

查看所有类似文章

引用人

使用文本挖掘方法提取蛋白质-蛋白质相互作用网络可以深入了解自闭症谱系障碍。
Nezamuldeen L，Jafri硕士。 Nezamuldeen L等人。生物学（巴塞尔）。2023年10月18日；12(10):1344. doi:10.3390/biology12101344。生物学（巴塞尔）。2023 PMID：37887054 免费PMC文章。
RSK磷酸化的逐步数字模式决定了胸腺选择的结果。
Funasaki S、Hatano A、Nakatsumi H、Koga D、Sugahara O、Yumimoto K、Baba M、Matsumoto M、Nakayama KI。 Funasaki S等人。 iScience。2023年8月9日；26(9):107552. doi:10.1016/j.isci.2023.107552。eCollection 2023年9月15日。 iScience。2023 PMID：37646020 免费PMC文章。
可溶性环氧化物水解酶维持与腹腔巨噬细胞自分泌信号相关的稳态脂质周转。
Liu F、Diao X、Cong H、Suzuki E、Hasumi K、Takeshima H。刘峰等。 iScience。2023年7月27日；26（8）：107465。doi:10.1016/j.isci.2023.107465。eCollection 2023年8月18日。 iScience。2023 PMID：37599831 免费PMC文章。
通过全长蛋白的不同构象调节激酶PDK1的底物特异性。
Sacerdoti M、Gross LZF、Riley AM、Zehnder K、Ghode A、Klinke S、Anand GS、Paris K、Winkel A、Herbrand AK、Godage HY、Cozier GE、SüßE、Schulze JO、Pastor-Flores D、Bollini M、Cappellari MV、Svergun D、Gräwert MA、Aramendia PF、Leroux AE、Potter BVL、Camacho CJ、Biondi RM。 Sacerdoti M等人。科学信号。2023年6月13日；16（789）：第3184页。doi:10.1126/scisignal.add3184。Epub 2023 6月13日。科学信号。2023 PMID：37311034 免费PMC文章。
利用CRISPR介导的碱基编辑器研究癌症化疗中的功能性磷蛋白组学。
李杰，林杰，黄S，李M，于伟，赵Y，郭J，张P，黄X，乔Y。李杰等。高级科学（Weinh）。2022年10月；9（30）：e2200717。doi:10.1002/advs.202200717。Epub 2022年8月31日。高级科学（Weinh）。2022 PMID：36045417 免费PMC文章。

查看所有“被引用”文章

工具书类

1. Alessi D.R.、Andjelkovic，M.、Caudwell，B.、Cron，P.、Morrice，N.、Cohen，P.和Hemmings，B.A.（1996）胰岛素和IGF-1激活蛋白激酶B的机制。EMBO J.，第15期，6541–6551页。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Alessi D.R.等人（1997年a）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）：与果蝇DSTPK61激酶的结构和功能同源性。货币。生物学，776–789。-公共医学
1. Alessi D.R.、Kozlowski，M.T.、Weng，Q.-P.、Morrice，N.和Avruch，J.（1997b）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）在体内外磷酸化并激活p70 S6激酶。货币。生物学，8，69–81。-公共医学
1. Anderson K.E.、Coadwell，J.、Stephens，L.R.和Hawkins，P.T.（1998）PDK-1在质膜上的转运对于PDK-1激活蛋白激酶B.Curr是重要的。生物学，8684–691。-公共医学
1. Andjelkovic M.等人（1997），易位在蛋白激酶B.J.Biol激活和功能中的作用。化学。，272, 31515–31524.-公共医学

出版物类型

行动

MeSH术语

行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动

物质

行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动

LinkOut-更多资源

[1] Alessi D.R.、Andjelkovic，M.、Caudwell，B.、Cron，P.、Morrice，N.、Cohen，P.和Hemmings，B.A.（1996）胰岛素和IGF-1激活蛋白激酶B的机制。EMBO J.，第15期，6541–6551页。-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Alessi D.R.、Andjelkovic，M.、Caudwell，B.、Cron，P.、Morrice，N.、Cohen，P.和Hemmings，B.A.（1996）胰岛素和IGF-1激活蛋白激酶B的机制。EMBO J.，第15期，6541–6551页。-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Alessi D.R.等人（1997年a）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）：与果蝇DSTPK61激酶的结构和功能同源性。货币。生物学，776–789。-公共医学

[4] Alessi D.R.等人（1997年a）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）：与果蝇DSTPK61激酶的结构和功能同源性。货币。生物学，776–789。-公共医学

[5] Alessi D.R.、Kozlowski，M.T.、Weng，Q.-P.、Morrice，N.和Avruch，J.（1997b）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）在体内外磷酸化并激活p70 S6激酶。货币。生物学，8，69–81。-公共医学

[6] Alessi D.R.、Kozlowski，M.T.、Weng，Q.-P.、Morrice，N.和Avruch，J.（1997b）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）在体内外磷酸化并激活p70 S6激酶。货币。生物学，8，69–81。-公共医学

[7] Anderson K.E.、Coadwell，J.、Stephens，L.R.和Hawkins，P.T.（1998）PDK-1在质膜上的转运对于PDK-1激活蛋白激酶B.Curr是重要的。生物学，8684–691。-公共医学

[8] Anderson K.E.、Coadwell，J.、Stephens，L.R.和Hawkins，P.T.（1998）PDK-1在质膜上的转运对于PDK-1激活蛋白激酶B.Curr是重要的。生物学，8684–691。-公共医学

[9] Andjelkovic M.等人（1997），易位在蛋白激酶B.J.Biol激活和功能中的作用。化学。，272, 31515–31524.-公共医学

[10] Andjelkovic M.等人（1997），易位在蛋白激酶B.J.Biol激活和功能中的作用。化学。，272, 31515–31524.-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

蛋白激酶RSK2中一个磷酸丝氨酸调节的对接位点，可招募并激活PDK1

附属

蛋白激酶RSK2中一个磷酸丝氨酸调节的对接位点，可招募并激活PDK1

作者

附属

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

分子生物学数据库

其他

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

相关信息

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

分子生物学数据库

其他