A PDK1 homolog is necessary and sufficient to transduce AGE-1 PI3 kinase signals that regulate diapause in Caenorhabditis elegans

doi:10.1101/gad.13.11.1438

.1999年6月1日；13(11):1438-52.

doi:10.1101/gad.13.11.1438。

PDK1同源物对于转导AGE-1 PI3激酶信号调节秀丽隐杆线虫滞育是必要且充分的

S天堂¹, M爱玲, 托克, J H托马斯, G鲁夫坤

附属公司

PMID： 10364160
预防性维修识别码：项目经理316759
内政部： 10.1101/gad.13.11.1438

PDK1同源物对于转导AGE-1 PI3激酶信号调节秀丽隐杆线虫滞育是必要且充分的

S天堂等。基因开发. 1999.

.1999年6月1日；13(11):1438-52.

doi:10.1101/gad.13.11.1438。

作者

S天堂¹, M爱玲, 托克, J H托马斯, G鲁夫坤

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院遗传系马萨诸塞总医院分子生物学系02114。

PMID： 10364160
预防性维修识别码：项目经理316759
内政部： 10.1101/gad.13.11.1438

摘要

胰岛素受体样信号通路调节秀丽隐杆线虫的代谢、发育和寿命。胰岛素受体同源物DAF-2、AGE-1 PI3K或AKT-1和AKT-2激酶失活会导致dauer期发育停滞。daf-16叉头转录因子的零突变减轻了通过该途径进行信号传递的需要。我们在这里表明，哺乳动物Akt/PKB激酶PDK1的秀丽隐杆线虫同源物pdk-1的功能缺失突变导致dauer期的构成性阻滞和寿命延长；daf-16的功能缺失突变抑制了这些表型。pdk-1的激活突变或野生型pdk-1过度表达可缓解AGE-1 PI3K信号的需要。因此，pdk-1活性对于在DAF-2胰岛素受体样信号通路中传播AGE-1 PI3K信号是必要的，也是足够的。pdk-1的激活突变需要akt-1和akt-2基因的活性，以抑制1岁的达斡尔族阻滞表型。这表明线虫PDK1的主要功能是将信号从AGE-1传递到AKT-1和AKT-2。激活的pdk-1突变位于激酶结构域的保守区；人类PDK1中的等效氨基酸替换激活其对哺乳动物Akt/PKB的激酶活性。

PubMed免责声明

数字

图1
*pdk-1型*编码丝氨酸/苏氨酸激酶。(*A、顶部）*遗传和物理地图*pdk-1型*区域。*pdk-1型*包含在fosmids H42K12和H33H01中。PDK-1的起始蛋氨酸在H42K12上为9848bp，PDK-1终止密码子在H33H01上为3082bp；fosmid重叠1201 bp（从12897到fosmid H42K12结束）。（底部）的外显子/内含子结构*pdk-1型*.编码区域为实心框；非编码区域是开盒；内含子是线条。激酶域由阴影框表示（Hanks和Hunter 1995）；褶皱同源结构域由阴影框表示（Alessi等人，1997a）。(B类)PDK-1a（GenBank登录号AF130406）；使用PILEUP（GCG）对PDK1b（编号AF130407）、DMSTPK61（EMBL Y07908）和人PDK1（GenBank登录号AF017995）进行比对（PILEUP中使用的蛋白质的登录号用括号表示）。相同的残留物用点表示；引入的用于对齐序列的间隙用破折号表示。激酶结构域由氨基末端阴影区表示，百合同源结构域由羧基末端阴影区指示。这个*sa680标准*Gly-295–Arg替代由PDK1a序列上方的R表示。这个*镁142*Ala-303–Val替换由PDK1a序列上方的V表示。

图2
人PDK1中A277V的替代导致酶的激活。将野生型人PDK1（hPDK1）、激酶非活性hPDK1.K110N和hPDK1/A277V表达克隆中激活的A277V突变瞬时转染293T细胞，重复转染后，在体外蛋白激酶检测中检测每个突变株对Akt/PKB的蛋白激酶活性（见材料和方法）。这些数据代表了四个独立的实验。(A）hPDK1蛋白（hPDK1.K110N和hPDK1.A277V）的相对量根据hPDK1B类使用生物活性分子成像仪上的抗Myc抗体和ECL检测（Amersham），以及用于抗Myc抗原免疫沉淀的调整量的裂解物。清洗免疫沉淀，并使用His–Akt作为底物进行体外激酶分析。Akt/PKB（His–Akt）的磷酸化通过放射自显影术进行评估，并在生物放射分子成像仪上进行定量。将数据归一化为野生型hPDK1活性（1），并表示每个hPDK1-构造的两条车道的平均值。在hPDK1.A277V通道中，仅使用较低物种（与野生型hPDK1通道中的His–Akt相结合）进行定量，因为较高迁移物种的身份尚不清楚。(B）对总细胞裂解物进行总蛋白含量分析（生物活性蛋白分析），并在7.5%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上装载等量的蛋白质，将溶解的蛋白质转移到硝化纤维素中，并用抗Myc抗体进行免疫印迹。与野生型或激酶活性蛋白相比，A277V突变体观察到额外的抗Myc免疫反应带。

图3
成人寿命*pdk-1（sa680）*突变体。*pdk-1（sa680）*延长成人寿命和*daf-16型*在25°C时抑制寿命增加。野生型的平均寿命为17天(□,n个 = 50），15天*pdk-1（mg142）*(*,n个 = 50），15天*daf-16（m27）；pdk-1（sa680）*(●,n个 = 49），27天*pdk-1（sa680）*(⋄,n个 = 50），27天*sqt-1（sc13）年龄1（hx546）*( ,n个 = 25). 平均寿命显著不同(对≤2e−9；参见材料和方法）*pdk-1（sa680）*与…相比*sqt-1（sc13）年龄1（hx546）*、和*daf-16（m27）；pdk-1（sa680）*与…相比*pdk-1（mg142）*.平行测定所有菌株的寿命；数据来自于至少另一次进行的一个具有代表性的实验。

图4
PDK-1/GFP表达。(A）PDK-1/GFP在L1动物中的表达。图中显示了在咽前球和咽前球（ant.ph.）中的表达；在整个咽部也有表达。PDK-1/GFP在头部和尾部许多神经元的胞体中表达可见；神经元细胞核偶尔表达。在尾部的皮下细胞（hyp）中也观察到PDK-1/GFP的表达。(B）PDK-1/GFP在L1动物肠道（肠）和腹神经索（VNC）中的表达。前部是指左边，腹部是向下; 由于与*角色-6*标记。VNC神经元的胞体和轴突（箭头）清楚地表达PDK-1/GFP，肠细胞的胞体也是如此（箭头）；VNC和肠细胞核似乎不表达PDK-1/GFP。

图5
DAF-2胰岛素受体样信号通路调节生殖生长和代谢的模型。激活DAF-2后，AGE-1生成PDK-1和AKT-1/AKT-2激活所需的PtdIns-3,4-P2和PtdIns-3，4,5-P3。DAF-2的其他平行通路也被激活，所有信号都在DAF-16上聚合。详见正文。

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