PDK1中的PIF-binding口袋对于激活S6K和SGK至关重要，但对于PKB来说则不然

摘要

介绍

蛋白激酶是多种细胞信号通路的关键介质。因此，刺激后特定蛋白激酶对底物的磷酸化必须高效、特异且严格调控，以避免不同信号通路之间的串扰，并确保磷酸化的准确时间。然而，直到最近，调节蛋白激酶效率和保真度的分子基础还不太清楚。现在有越来越多的证据表明，使蛋白激酶磷酸化特定底物的一种机制涉及位于活性中心之外的蛋白激酶残基，该活性中心可以与底物特异性相互作用（称为对接位点）(荷兰和库珀，1999年;田上等., 2001). 人们对描述激酶及其底物之间的特定相互作用越来越感兴趣，因为它们可能在控制信号转导通路的特异性和功能方面发挥重要作用。

在胰岛素和生长因子信号通路中，磷酸肌醇3-激酶（PI3-激酶）家族成员被激活，导致脂质第二信使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸[Ptd-Ins（3，4，5）P的产生₃]和PtdIns（3,4）P₂(Vanhaesebroeck和Alessi，2000年). 这些3-磷酸肌醇调节细胞过程的机制之一是通过其诱导蛋白激酶AGC亚家族成员磷酸化从而激活的能力(贝勒姆等., 1999). 其中包括蛋白激酶B（PKB）的亚型(Vanhaesebroeck和Alessi，2000年)，p70核糖体S6激酶（S6K）(Dufner和Thomas，1999年)血清和糖皮质激素诱导激酶（SGK）(小林和科恩，1999年;小林寺等., 1999;公园等., 1999).

PKB通常在细胞被胰岛素和生长因子刺激后2分钟内被激活。它具有一个与PtdIns（3,4,5）P相互作用的N末端pleckstrin同源（PH）结构域₃/铂族锡（3,4）P₂导致PKB募集到质膜上，在质膜上PKB被两个残基的磷酸化激活。一个位于激酶结构域（PKBα中的Thr308）的T环（也称为激活环），另一个位于催化结构域的C末端，位于一个称为“疏水基序”的区域（PKBβ中的Ser473；综述于Vanhaesebroeck和Alessi，2000年). S6K和SGK还具有相当于Thr308（S6K1中的Thr252和SGK1中Thr256）和Ser473（S6K1中的Thr 412和SGK1中的Ser422）的残基，这些残基的磷酸化是激活这些激酶所必需的体内S6K和SGK的T环和疏水基序的磷酸化，如PKB的磷酸化一样，依赖于PI 3-激酶的激活。然而，与PKB相比，S6K和SGK不具有PH结构域，也不与PtdIns（3,4,5）P相互作用₃/铂族锡（3,4）P₂S6K和SGK亚型在细胞刺激后的激活速度也比PKBα慢，最大激活通常在10–40分钟后发生。

PKB、S6K1和SGK在其T环被3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）磷酸化(Belham等人，1999年;托克和牛顿，2000年). PDK1也是AGC家族成员，拥有PtdIns（3,4,5）P₃/铂族锡（3,4）P₂-将PH结构域C末端与催化结构域结合。在PI 3-激酶激活后，PDK1和PKB被认为通过与PtdIns（3,4,5）P的相互作用共同定位在质膜上₃/铂族锡（3,4）P₂除了将PKB募集到细胞膜外，PtdIn（3，4，5）P的结合₃/铂族锡（3,4）P₂PKB的PH结构域可能引起构象变化，使PDK1磷酸化Thr308（在Vanhaesebroeck和Alessi，2000年). 由于S6K和SGK不与PtdIns（3,4,5）P相互作用₃/PtdIn（3，4）P蛋白₂也不是PDK1磷酸化的速率在体外PtdIns（3,4,5）P存在时增强₃/铂族锡（3,4）P₂PI3-激酶激活诱导S6K和SGK激活的机制可能与PKB不同。

在酵母双杂交筛选中发现PDK1的激酶结构域与蛋白激酶C相关激酶-2（PRK2）的一个区域相互作用，称为PDK1相互作用片段（PIF）(巴伦德兰等.，1999年a). PRK2是一种AGC激酶，与PKB、SGK和S6K亚型不同，在用激活PI3-激酶的激动剂刺激细胞后，它不会被激活，并且可能受GTPase蛋白Rho家族的调节(弗林等2000年). PRK2中的PIF区域位于PRK2激酶结构域的C末端，包含一个疏水基序（Phe-Xaa-Xaa-Phe-Asp-Tyr），与PKBα（Phe-Xaa-Xaa-Pher-Ser-Tyr。PIF疏水基序中保守芳香残基的突变或Asp残基突变为Ala或Ser抑制PIF与PDK1的相互作用(巴伦德兰等.，1999年a). 随后的工作表明，PIF的24个氨基酸片段（称为PIFtide）包含PRK2的疏水基序，与PDK1激酶结构域小叶上的疏水囊结合，称为“PIF-结合囊”(比昂迪等., 2000). 此外，获得了一些证据表明，PDK1上的该站点可以作为“对接站点”，从而使PRK2能够招募PDK1(巴伦德兰等., 2000). PKCζ样PRK2在其疏水基序（Glu579）中也有一个酸性残基，但与PRK2相反，该残基突变为Ala并不影响其与PDK1的相互作用(巴伦德兰等., 2000).

另一种称为p90RSK的AGC激酶，在PI3-激酶途径下游不被激活，而是被经典的MAP激酶途径激活(Frodin和Gammeloft，1999年)也是PDK1基板(延森等., 1999;理查兹等., 1999). ERK1/ERK2 MAP激酶成员对p90RSK的磷酸化使p90RSK磷酸化其自身的疏水基序。弗罗丁和同事(弗罗丁等., 2000)最近证明，PDK1能够与p90RSK的磷酸化疏水基序直接相互作用，从而使PDK1磷酸化p90RSK的T环。

在这里，我们研究了PDK1上的PIF结合袋在使PDK1磷酸化和激活其三种AGC激酶底物中的作用，这三种底物被PI3-激酶依赖性机制激活，即S6K1、SGK1和PKBα。我们的数据表明，PDK1的PIF-结合囊在使PDK1磷酸化并激活S6K1和SGK1，而非野生型PKBα方面起着关键作用。数据表明，S6K1和SGK1在其疏水基序上的优先磷酸化促进了PDK1与这些酶的相互作用和磷酸化。据我们所知，PDK1上的PIF-结合囊是蛋白激酶上底物识别位点的第一个例子，该位点只需要对其生理底物的子集进行磷酸化。

结果

本研究中使用的所有野生型和突变型AGC激酶底物如图所示1缺乏包含自身抑制结构域的C末端104残基的S6K的形式被称为S6K1-T2，并且优选使用全长S6K1，因为它是PDK1的有效底物体外与全长的S6K1相比，全长的S6K1被PDK1磷酸化程度很低(Alessi等人，1998年;普伦等人，1998年). 本研究中使用的SGK1形式缺乏N末端60氨基酸，因为全长SGK1蛋白不能以足够的水平表达，无法用作PDK1的底物(小林和科恩，1999年).

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图1。本研究中使用的野生型和突变型AGC激酶。圆圈表示T环磷酸化位点的位置，三角形表示疏水基序磷酸化位点。wt表示野生型。S6K1的C末端104残基包含一个自身抑制结构域，该结构域在S6K1-T2构造中被删除。本研究中表达的SGK1蛋白缺乏60个N端氨基酸。ΔPH-PKBα是缺乏PH结构域的PKBα突变体。ΔPH-PKBα[HM-SGK1 wt]包含PKBα的118–439残基，与人类SGK1的288–431残基融合。PKBα[HM-SGK1 S422D]包含PKBα的118–439个残基，与人类SGK1的288–431个残基融合，其中疏水基序磷酸化位点Ser422变为Asp。PKBα[HM-PRK2]和SGK1[HM-PK2]分别包含PKBα的118-425残基和SGK1的60-372残基，融合到人类PRK2的934-984残基。

PDK1“PIF-结合囊”在PDK1磷酸化和激活S6K1、SGK1和PKB中的作用

我们首先研究了PDK1上疏水性PIF-结合囊在使PDK1磷酸化并激活S6K1、SGK1和PKB中的作用。我们最初测试了疏水性PIF-结合囊的PDK1突变体（PDK1[L155E]）是否被破坏(比昂迪等., 2000)可以磷酸化并激活这些AGC激酶底物。引人注目的是，与野生型PDK1相比，PDK1[L155E]对S6K1-T2和SGK1的磷酸化显著降低（图2A、B和表我). 我们还使用了S6K1（S6K1-T2[T412E]）和SGK1（SGK1[S422D]）的突变体，在突变体中，它们的疏水基序磷酸化位点被改变为酸性残基，这显著提高了它们被PDK1磷酸化和激活的速率（表我). 虽然PDK1磷酸化S6K1-T2，但这并没有显著激活该酶，因为它还需要磷酸化Thr412（或将该残基突变为Glu）才能激活（图2A和​和3A）。3A） ●●●●。我们发现，与野生型PDK1相比，S6K1-T2[T412E]和SGK1[S422D]均被PDK1[L155E]磷酸化，并且活化程度很低（图2). 相反，PKBα及其酸性疏水基序突变体PKBα[S473D]是野生型PDK1和PDK1[L155E]的良好底物（图2C） ●●●●。有趣的是，PKBα和PKBα[S473D]的突变形式缺乏PH结构域（ΔPH-PKBα和ΔPH-PKBα[S473 D]），因此在结构上与S6K1-T2和SGK1更相似（图1)与野生型PDK1相比，PDK1[L155E]的底物非常差（图2D） ●●●●。PDK1以50-100倍于全长PKBα的速率磷酸化了ΔPH-PKBα（表我)与S6K1-T2和SGK1一样，PDK1对其磷酸化不受PtdIns（3,4,5）P的影响₃(阿莱西等., 1998;小林和科恩，1999年). 然而，需要注意的是，PDK1以比S6K1-T2和SGK1低10倍的初始速率磷酸化了ΔPH-PKBα，而ΔPH-PKBα[S473D]的磷酸化速率是S6K1-T2[T412E]和SGK1[S422D]的约70倍（表我).

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图2。PDK1的PIF结合口袋在S6K1、SGK1和PKBα磷酸化中的作用。将指示的AGC底物与野生型GST–PDK1或突变型GST-PDK1[L155E]在镁和[γ-³²P] 材料和方法中所述的ATP。通过磷酸化肽底物交叉肽（GRPRTSSFAEG）的能力评估每个AGC激酶的激活。AGC激酶底物的磷酸化在4–12%梯度聚丙烯酰胺凝胶上电泳后测定，并在磷酸成像仪上分析对应于每个底物的考马斯蓝染色带。还通过对AGC激酶进行免疫印迹来分析磷酸化，免疫印迹抗体可特异检测T环磷酸化形式的S6K1（Thr252）、SGK1（Thr256）和PKBα（Thr308）。在所用条件下，PDK1对每个底物的磷酸化与时间和添加到分析中的酶的量呈线性关系。使用至少两个单独的时间点重复进行实验。一个实验中的重复次数变化不超过10%，通常小于5%。

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图3。PIF肽对PDK1磷酸化S6K1、SGK1和PKBα能力的影响。在镁和[γ-³²P] ATP如图图例所示2.

表一。

野生型（wt）PDK1、PDK1[L155E]和PDK1[A277V]磷酸化指定形式的S6K1、SGK1和PKB的相对初始速率

	PDK1-wt型		PDK1-L155E系列		PDK1-A277V型
PIF潮汐	–	+	–	+	–	+
S6K1-T2系列	10.4	0.58	0.6	0.27	6.9	0.6
S6K1-T2[T412E]系列	54	7.4	0.5	0.108	51	5.6
SGK1重量	8	3.8	3.3	2.4	7	2
SGK1[S422D]	71	9.6	3.5	3.4	67	10
PKBα重量	28	19.3	35	35	30	29
PKBα[S473D]	100	85.4	178	162	105	100
ΔPH-PKBαwt	0.4	0.25	0.23	0.25	1.2	0.5
ΔPH-PKBα[S473D]	0.9	0.2	0.18	0.15	2.1	0.4

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在没有（–）和存在（+）2µM PIFtide的情况下进行磷酸化，并按照材料和方法部分所述进行分析。所示数据来自三个独立实验中的一个代表性实验，每个测定都进行了两次。每个点±SEM的误差小于测定平均值的10%。PDK1磷酸化PKBα[S473D]的速率的值为100。

在图中3，我们证明PDK1磷酸化和激活S6K1-T2、SGK1和ΔPH-PKBα的能力，以及疏水基序突变体S6K1-T2[T412E]、SGK1[S422D]和ΔPH-PKBα[S473D]的能力，在与PDK1的PIF结合囊相互作用的肽PIF肽过量的情况下显著受到抑制（见引言）。相反，相同浓度的PIF肽对PDK1催化的PKBα和PKBα磷酸化[S473D]没有影响。这些结果证实，PDK1利用其疏水性PIF结合口袋与S6K1-T2、SGK1和ΔPH-PKBα相互作用、磷酸化和激活，但PDK1磷酸化PKBα不需要这个口袋。

PDK1“PIF-binding pocket”中Lys115、Ile119、Gln150和Ala277在S6K1和SGK1激活中的作用

除Leu155外，其他残基预计会形成PDK1上PIF-结合囊的一部分。其中包括Lys115、Ile119和Gln150，这些残基对Ala的突变表明PDK1对PIFtide的亲和力降低了约10倍(比昂迪等., 2000). 这些PDK1突变体对不与PIF-结合囊相互作用的肽底物仍保持正常活性[例如T308肽(比昂迪等., 2000)]，表明它们没有受到催化损伤。虽然PDK1上的Leu155突变为Glu消除了其与PIFtide的相互作用(比昂迪等., 2000)我们还发现，其中Leu155变为Ala的PDK1突变体对PIFtide的亲和力降低了10倍，类似于PDK1的PDK1[K115A]、PDK1[I119A]和PDK1[Q150A]突变体（R.M.Biondi，未发表的数据）。因此，我们决定比较PDK1的所有这些PIF-结合口袋突变体磷酸化S6K1-T2[T412E]的速率（图4A） 和SGK1[S422D]（图4B） PIFtide浓度低（2µM）或高（35µM。我们发现，PDK1[K115A]、PDK1[I119A]、PDK1[Q150A]和PDK1[L155A]激活S6K1-T2[T412E]的速率仅略低于野生型PDK1（图4A） ●●●●。相比之下，PDK1激活SGK1[S422D]的这些突变体的比率显著降低（图4B） 表明Lys115、Ile119和Gln150在允许PDK1磷酸化SGK1[S422D]方面可能比S6K1-T2[T412E]更为关键。PIFtide（2µM）抑制野生型PDK1对S6K1-T2[T412E]和SGK1[S422D]的活化，抑制幅度超过约20倍，但仅比PDK1[K115A]、PDK1[I119A]、PDK1[Q150A]和PDK1[L155A]磷酸化S6K1-T2[T412]和SGK1[C422D]的速率降低约2至3倍。这与这些PDK1突变体对PIFtide的亲和力降低一致。相反，需要35µM PIFtide才能通过PDK1[K115A]、PDK1[I119A]、PDK1[Q150A]和PDK1[L155A]对S6K1-T2[T412E]和SGK1[S422D]的磷酸化实现约20倍的抑制。这些发现进一步证明了PDK1[L155E]不能磷酸化S6K1和SGK1（图2)以及PIFtide对PDK1催化的S6K1和SGK1磷酸化的抑制（图3)分别与PDK1的PIF结合囊的破坏和封锁直接相关。

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图4。进一步证明，PDK1激活S6K1和SGK1需要PDK1的PIF绑定袋。S6K1-T2[T412E]系列(A类)和SGK1[S422D](B类)在缺乏或存在2µM PIF肽（阴影条）或35µM PI肽（填充条）的情况下，在镁和[γ-³²P] 材料和方法中所述的ATP。通过磷酸化肽-底物交叉肽（GRPRTSSFAEG）的能力评估每种底物的活化。两个单独实验的结果为±SEM；每次测定重复进行。

据报道，激酶催化结构域中的一个点突变将Ala277转化为Val，以提高PDK1激活PKB的速率体内(Paradis等人，1999年;Wick等人，2000年). 为了研究该突变体是否与PIF结合口袋有任何相关性，我们将突变体PDK1[A277V]表达并纯化为谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合蛋白。该突变体对PDK1肽底物[T308tide的特异性(Biondi等人，2000年)]PIFtide对PDK1的激活与野生型PDK1相同（数据未显示）。如前所述，突变型PDK1[A277V]对ΔPH-PKBα的活性是野生型PDK1的2.3倍（表​（表一我和Paradis等人，1999年). 相反，PDK1[A277V]在PtdIns（3,4,5）P存在下磷酸化全长PKBα₃以及在不存在PtdIn（3，4，5）P的情况下的S6K1或SGK1₃与野生型PDK1的速率相同（表我). 磷酸化（表我)和激活（图4)PDK1[A277V]对S6K1和SGK1的抑制作用与野生型PDK1相似。因此，Ala277到Val突变可能激活PKB的机制体内看起来与PIF装订袋无关。

S6K1和SGK1与PDK1的相互作用

全长S6K1是PDK1的一种非常差的底物，而S6K1在其调控域中缺乏C末端104氨基酸（称为S6K1-T2）(阿莱西等., 1998;拉伦等., 1998). 因此，我们测试了与S6K1-T2相比，全长S6K1是否无法与PDK1相互作用。我们在293个细胞中共同表达GST–PDK1以及HA-epitope标记的全长S6K1、全长S6K1[T412E]、S6K1-T2和S6K1-T2[T412]。然后对从这些转染制备的细胞裂解液中提取的GST-PDK1的谷胱甘肽-Sepharose“下拉”进行免疫印迹，以检测是否存在HA-epitope标记的S6K1。虽然GST-PDK1和野生型和突变型S6K1表达水平相似，但全长S6K1和全长S6K1[T412E]未能与GST-PDK1相互作用，而S6K1-T2和S6K1-T2[T412]容易与GST-PDK1相互作用。正如预期的那样，我们无法检测到GST–PDK1之间的相互作用

野生型SGK1被PDK1磷酸化的速率比SGK1[S422D]低10倍（表我). 因此，我们测试了野生型SGK1和SGK1[S422D]对PDK1亲和力的差异是否可以解释这一点。为了研究这一点，我们在293细胞中与Myc-PDK1共表达GST-SGK1和GST-SGK1[S422D]。对GST-SGK1的谷胱甘肽-Sepharose“下拉”进行免疫印迹，以检测Myc-PDK1的存在。如图所示5B、 Myc-PDK1仅与SGK1[S422D]相互作用，但不与野生型SGK1相互作用。在SGK1[S422D]和Myc-PDK1[L155E]之间仍然观察到弱的相互作用，表明SGK1可能与PDK1上除PIF结合口袋之外的额外位点显著相互作用（数据未显示）。

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图5。S6K1和SGK1与PDK1的相互作用。(A类)用表达GST、野生型（wt）GST-PDK1或突变型GST-PDK1[L155E]的DNA构建物以及指示的野生型和突变型HA靶向S6K1瞬时转染293细胞。转染后36小时，细胞被裂解，GST融合蛋白通过谷胱甘肽-Sepharose珠亲和层析纯化。将纯化蛋白的等分试样在10%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并使用抗HA抗体进行免疫印迹以检测HA-S6K1或考马斯，以确保GST融合蛋白的类似表达。为了确定野生型和突变型S6K1的表达水平相似，在10%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上电泳每种条件下的总293细胞裂解物（称为粗提物）10µg，并用抗HA抗体进行免疫印迹。(B类)如上所述，除了用表达Myc-PDK1和GST-SGK1或GST-SGK1[S422D]的DNA构建物瞬时转染293个细胞外。用抗Myc抗体免疫印迹法检测PDK1。显示了每个条件的副本。在两个不同的实验中获得了类似的结果。

AGC激酶疏水基序在调节PDK1相互作用和磷酸化中的作用

为了进一步研究AGC激酶疏水基序的作用，我们合成了包含PKBα、SGK1和S6K1磷酸化疏水基序肽。我们利用表面等离子体共振分析（图6). 对应于在Ser473磷酸化的PKBα疏水基序的肽与PDK1相互作用，其相对亲和力分别比衍生自SGK1和S6K1的等效肽低4倍和8倍。正如预期的那样，对应于Ser473未磷酸化的PKBα疏水基序的肽与PDK1没有显著的相互作用。值得注意的是，来自PRK2疏水基序的肽（PIFtide）与PDK1的PIF-结合囊相互作用，亲和力是S6K1、SGK1和PKB疏水基序肽的1000倍以上。

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图6。来自S6K1、SGK1、PKBα和PRK2疏水基序的肽的相对亲和力。如材料和方法中所述，在BIAcore仪器上进行表面等离子体共振测量。生物素化PIF肽固定在链霉亲和素涂层传感器芯片上，在不存在或存在包含PRK2、S6K1、SGK1和PKBα疏水基序（HM）的指定浓度肽的情况下，记录与GST–PDK1的特异性相互作用。肽PIFtide（开放三角形）对应于PRK2的残基957-980；肽HM-S6K1-P（开方块）对应于S6K1的残基401–418，其中Thr412被磷酸化；肽HM-SGK1-P（倒三角形）对应于SGK1的411-428残基，其中Ser422被磷酸化；肽HM-PKBα-P（开环）对应于PKBα的461-480个残基，其中Ser473被磷酸化；肽HM-PKBα（闭合圈）对应于包含PKBα残基461-480的非磷酸化肽。PRK2衍生肽PIF肽先前被鉴定为与PDK1上的PIF结合囊特异性相互作用(比昂迪等., 2000). 数据是从一个具有代表性的实验中进行的单次测定，该实验至少重复了两次，结果相似。

观察到ΔPH-PKBα[S473D]是PDK1比SGK1[S422D]差得多的底物（表我)这可能是因为这些酶的疏水基序对PDK1的亲和力不同。为了研究这一点，我们将ΔPH-PKBα的疏水基序与SGK1（ΔPH-PKBα[HM-SGK1]）和PRK2（ΔPH-PKBα[HM-PRK2]）的疏水基元交换（这些融合蛋白的结构如图所示1). 这些突变体在缺乏血清的293细胞中表达为GST融合蛋白，并用磷酸特异性Thr308抗体免疫印迹谷胱甘肽–Sepharose下拉，以测量这些融合蛋白T环的磷酸化程度。还评估了这些蛋白质对肽交叉肽的活性（图7A） ●●●●。ΔPH-PKBα和ΔPH-PKBα[HM-SGK1 wt]在其T环处未磷酸化，与此一致，基本上处于非活性状态。然而，可检测到ΔPH-PKBα[S473D]和ΔPH-PKBα[HM-SGK1 S422D]的磷酸化程度相似，对克罗斯肽的比活性较低，为～3 U/mg。相反，ΔPH-PKBα[HM-PRK2]在其T环残基处高度磷酸化，并且具有～60 U/mg的比活性（图7A） ，相当于在T环残基上完全磷酸化的PKBα(Balendran等人，1999年a). 发现ΔPH-PKBα[HM-SGK1 S422D]的T环磷酸化与ΔPH-PKBα[S473D]相似，以及图中所示的数据6，表明仅包含SGK1疏水基序的残基不能解释PDK1磷酸化SGK1[S422D]的显著速率体外与ΔPH-PKBα[S473D]相比（表我). 这些结果可能表明SGK1[S422D]（和S6K1-T2[T412E]）可能具有不同于疏水基序的额外PDK1结合决定簇，这可能是协同结合机制的一部分。

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图7。AGC激酶疏水基序互换的效果。编码指示野生型和突变型PKBα的GST融合蛋白(A类和B类)和SGK1(C)，其结构如图所示1，在293个细胞中表达。隔夜剥夺细胞的血清，不刺激或用100 ng/ml IGF1刺激细胞10分钟（B）或15分钟（C）。对细胞进行裂解，并在谷胱甘肽-Sepharose上纯化GST融合蛋白亲和力。将每种蛋白质的0.5µg样品在4-12%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并使用磷酸特异性抗体进行免疫印迹，该抗体分别识别T环残基磷酸化的PKBα（A和B）或SGK1（C），即Thr308和Thr256。凝胶也用考马斯染色，以确保GST-ΔPH-PKBα融合蛋白的负载量相似。每种GST融合蛋白激酶（50 ng）的比活性通过其磷酸化肽底物交叉肽（GRPRTSSFAEG）的能力进行评估，如材料和方法中所述。显示了单个实验的结果，在（a）的三个单独实验和（B和C）的两个实验中获得了类似的结果。

此外，我们研究了PKBα和SGK1疏水基序与PRK2疏水基序在血清缺乏和IGF1刺激的293细胞中的交换作用（图7B和C）。在未刺激的细胞中，如预期的那样，ΔPH-PKBα和全长PKBα在其T环处未磷酸化，基本上处于非活性状态。在未刺激的细胞中，ΔPH-PKBα[S473D]和PKBα[S473 D]在其T环处中度磷酸化，并且对Crosstide具有较低的比活性。正如预期的那样，IGF1刺激促进了T环磷酸化和PKBα、PKBα[S473D]和ΔPHPKBα的活化，但没有进一步刺激ΔPHPKBα[S673D]的磷酸化/活化。IGF1也显著增加了全长PKBα[HM-PRK2]的活性/磷酸化，而ΔPH-PKBα[HM_PRK2]的活性和T环磷酸化在未刺激细胞中最大。

在图中7我们比较了SGK1、SGK1[S422D]和SGK1[HM-PRK2]的T环磷酸化和活性。在未刺激的细胞中，SGK1在其T环部位磷酸化程度较低，活性较低。正如预期的那样，IGF1刺激了野生型SGK1的活性和T环磷酸化。相反，SGK1[S422D]和SGK1[HM-PRK2]在非刺激细胞中具有高活性，并且在其T环磷酸化程度与来自IGF1刺激细胞的SGK1相同。IGF1没有进一步增加SGK1[S422D]和SGK1[HM-PRK2]的活性和T环磷酸化。

讨论

本文的结果强调了PDK1的PIF-结合囊在直接介导与S6K1和SGK1疏水基序相互作用中的重要性。此功能将PDK1招募到S6K1和SGK1，使PDK1能够在其T环位点磷酸化这些酶。这一结论得到以下发现的支持：PIF-结合囊被破坏的PDK1突变体（PDK1[L155E]）不能磷酸化并激活S6K1或SGK1（图2). 此外，PIFtide抑制S6K1和SGK1的磷酸化（图3)，因为它与PDK1的PIF绑定口袋相互作用，从而阻止它绑定到S6K1和SGK1。我们进一步证明，当这些底物被设计为对PDK1的PIF-结合囊具有更高的亲和力时，它们被PDK1更有效地磷酸化。因此，我们提供了一个模型，通过该模型，一些PDK1底物的磷酸化通过其与PDK1相互作用的能力进行调节。有趣的是，我们发现PKB通过不同的机制被PDK1激活，这不需要PKB与PDK1的PIF-结合囊相互作用。

S6K1需要T-loop和疏水基序的磷酸化才能被激活，因此仅PDK1在其T-loop位点磷酸化S6K1不会诱导显著激活。与缺乏C末端104个残基的S6K1突变体（S6K1-T2）相比，全长S6K1是PDK1的一种非常差的底物，包括四个被磷酸化的Ser-Pro/Thr-Pro序列体内(Alessi等人，1998年;普伦等人，1998年)并且被认为包含自抑制结构域。自身抑制结构域中Ser-Pro/Thr-Pro序列的磷酸化不会激活S6K1，但在使S6K1激活中起作用(Weng等人，1995年;Dennis等人，1998年). 去除S6K1的自身抑制结构域可以绕过S6K1在Ser-Pro/Thr-Pro位点被磷酸化以激活的需要。这里，我们证明了S6K1-T2和S6K1-T2[T412E]可以与PDK1交互，但不能与PDK1[L155E]交互（图5). S6K1-T2[T412E]被PDK1以高于S6K1-T2的初始速率磷酸化(Alessi等人，1998年;普伦等人，1998年)这可以通过观察S6K1-T2[T412E]与PDK1的相互作用比S6K1-T2增加来解释。我们的结果还表明，S6K的磷酸化和活化需要PDK1的PIF-结合囊的完整性和可用性（图​（图2A，2A、，​A、 3A级3A和​和4A）。4A） ●●●●。这些发现为S6K1的激活提供了一个模型，其中第一步涉及脯氨酸导向激酶对C末端Ser-Pro/Thr-Pro序列的磷酸化，该激酶尚待鉴定。这不会直接激活S6K1，但会引起构象变化，暴露疏水基序，与PDK1的PIF-结合囊相互作用，使PDK1磷酸化S6K1的T环残基。这与S6K1的C末端Ser-Pro/Thr-Pro残基在T环和疏水基序磷酸化之前磷酸化的结果一致(翁等人，1998年). 如果S6K1的疏水基序被磷酸化，PDK1与S6K1之间的相互作用将进一步增强。然而，这可能不是T环磷酸化的绝对先决条件，因为在S6K1突变中，Thr412突变为Ala的S6K1仍然在其T环残基处磷酸化，尽管磷酸化程度远低于野生型S6K1(翁等人，1998年).

与S6K1一样，SGK1需要在细胞中激活其T环和疏水基序的磷酸化，但在疏水基序之后不具有C末端尾部。未在其疏水基序（Ser422）处磷酸化的野生型SGK1是PDK1的不良底物，Ser422突变为酸性残基的速率增加了约5倍于PDK1磷酸化的速率（表我和小林和科恩，1999年). 相关激酶SGK2和SGK3也获得了类似的结果(小林寺等., 1999). 此外，当SGK1[S422D]在未刺激的293细胞中表达时，其T环残基（Thr256）显著磷酸化，而野生型SGK1则不磷酸化(小林和科恩，1999年;公园等., 1999)用IGF1刺激细胞不会进一步增加SGK1[S422D]的T环磷酸化或活性（图7C） ●●●●。研究发现，野生型SGK1与PDK1没有相互作用，而SGK1[S422D]与之相互作用（图5)也表明SGK1疏水基序的磷酸化在调节SGK1 T环残基的磷酸化中起着主要作用。我们的观察还表明，SGK1的磷酸化和激活需要与PDK1 PIF-结合囊相互作用。

虽然S6K1和SGK1的激活依赖于PI3-激酶体内，尚不清楚PtdIns（3,4,5）P₃/PtdIn（3，4）P蛋白₂调节这个过程。首先，激活PI3-激酶的激动剂不会刺激PDK1的内在活性(Alessi等人，1997年b;普伦等人，1998年). 其次，S6K1和SGK1在体外PtdIns（3,4,5）P的存在不会增强PDK1的活性₃/铂族锡（3,4）P₂与PDK1的PH域相互作用。这表明PDK1与PtdIns（3,4,5）P的结合₃/铂族锡（3,4）P₂可能不会直接激活这些酶。相反，PtdIns（3,4,5）P₃/铂族锡（3,4）P₂可诱导磷酸化S6K1和SGK1的疏水基序的激酶和/或磷酸化S6K1 C末端尾部的脯氨酸导向激酶的激活。如果该机构工作体内，PDK1不会磷酸化S6K1或SGK1，直到这些酶在其疏水基序/C末端尾部磷酸化。这类似于PDK1磷酸化p90RSK的机制(Frodin等人，2000年). 另一种被称为糖原合成酶激酶-3的蛋白激酶最近也被证明与一些底物具有磷酸化依赖性相互作用(Frame等人，2001年).

本研究发现PDK1的PIF-结合囊不需要PDK1来激活PKB，这可能是意料之外的，因为PKB，如S6K和SGK，具有疏水基序，可被激活PI3-激酶的激动剂磷酸化。这些观察解释了我们之前的发现，细胞中GST–PIF的过度表达并不影响PKBα的活化，但抑制了S6K1、PRK2和PKCζ的活化/T环磷酸化(巴伦德兰等.，1999年a,b条,2000). 这表明PDK1和PKB与PtdIns（3,4,5）P的结合₃/铂族锡（3,4）P₂可能是PDK1磷酸化PKB的主要决定因素，而不是PKB与PDK1的PIF-结合囊相互作用。这也得到了如下发现的支持：PKB的激活与PI3-激酶的激活一样，在细胞中发生得非常迅速，表明PKB的活化发生在PtdIns（3,4,5）P形成后不久₃/铂族锡（3,4）P₂此外，之前有人认为PtdIns（3,4,5）P₃也可以在PKB中产生构象变化，使其被PDK1磷酸化(阿莱西等.，1997年a;斯托科等., 1997). 我们的发现支持了这一模型，即拥有PRK2疏水基序的全长PKB仍然需要IGF1刺激才能在T环位点实现完全磷酸化（图7B） ●●●●。S6K1（和SGK1）的激活速度比PKB慢。这种延迟可以通过PtdIn（3，4，5）P所花费的时间来解释₃/铂族锡（3,4）P₂激活S6K1-自动抑制末端激酶和或S6K1/SGK1疏水基序激酶，这可能是细胞中S6K1/SG1激活的速率限制。

当ΔPH-PKBα在293细胞中表达时，它在Thr308和Ser473处被磷酸化以响应胰岛素，而这是由PI 3-激酶抑制剂阻止的(Kohn等人，1996年;Andjelkovic等人，1997年)（另请参见图7B） ●●●●。该观察结果最初被解释为PDK1被激活的证据体内由PtdIns（3,4,5）P₃/铂族锡（3,4）P₂然而，在本研究中，我们证明了ΔPH-PKBα没有被PDK1以与野生型PKBα相同的机制磷酸化，因为ΔPH-PKBα没有由PDK1[L155E]磷酸化，并且PDK1对ΔPH_PKBα的磷酸化没有被PIFtide抑制（图​（图22和​和3）。3). 因此，PDK1磷酸化ΔPH-PKBα的机制类似于S6K1和SGK1的激活，而不是PKBα。ΔPH-PKBα中Ser473突变为Asp增加了其被PDK1磷酸化的速率在体外（表我). 与此一致，当在未刺激的293细胞中表达时，ΔPH-PKBα[S473D]在其T环部位部分磷酸化，并且这种磷酸化在IGF1刺激细胞后没有增加（图7B） ●●●●。这些数据支持以下观点：当ΔPH-PKBα在细胞中表达时，PtdIns（3,4,5）P₃/铂族锡（3,4）P₂不激活PDK1，而是通过磷酸化S6K1和SGK1的疏水基序激酶诱导Ser473磷酸化，从而将ΔPH-PKBα转化为有效的PDK1底物。

当PRK2在未刺激的293细胞中过度表达时，与S6K1、SGK1和PKB不同，它在T环残基处磷酸化，达到较高的化学计量比(巴伦德兰等., 2000). 在图中6我们证明，与S6K1、SGK1和PKBα疏水基序相比，PRK2（PIF）的疏水基序与PDK1的相对亲和力高出1000倍以上。此外，当ΔPH-PKBα、全长PKBα或SGK1的疏水基序被PIF取代时，它在未刺激细胞的T环处被磷酸化。这些观察结果表明，与PKB和SGK1的疏水基序相反，PRK2的疏水基模能够与PDK1相互作用，导致PRK2、ΔPH-PKBα[HM-PRK2]和SGK1[HM-PK2]在没有刺激的情况下在其T环残基处磷酸化。人工促进AGC-激酶与PDK1相互作用的发现刺激了其在T环的磷酸化，这支持了我们的模型，即PDK1底物的磷酸化可以通过PDK1的PIF-结合囊与这些酶的疏水基序的相互作用来调节。与来自PKB、S6K1和SGK的等效基序相比，PIF对PDK1的这种高亲和力表明，含有PRK2疏水基序的残基并不存在于PKB、S6K和SGK中，这有助于PIF对PDK1的高亲和力。

我们在图中提出的模型8强调了我们的结论，即PDK1底物S6K和SGK的磷酸化是由其疏水基序与PDK1的PIF-结合囊直接相互作用调节的。相反，PKB并不依赖PDK1的PIF-结合囊进行T环磷酸化。我们模型的另一个重要特征是PDK1活性不需要调节，并且被认为具有组成活性。相反，正是PDK1的底物受到调控，并转化为可以与PDK1相互作用的形式，从而使其在T环残基处磷酸化。尽管PRK2和PKCζ在293细胞中过度表达时可以与PDK1直接相互作用(巴伦德兰等., 2000)，S6K1和SGK1的相互作用由这些酶在其C末端残基的磷酸化调节。相反，我们的结果支持PKB激活首先需要PKB与PtdIn（3，4，5）P相互作用的模型₃导致PDK1介导的磷酸化所需的构象变化，其次，PKB和PDK1通过与PtdIns（3,4,5）P相互作用而共同定位₃该模型可以解释胰岛素/生长因子刺激细胞中S6K1、SGK1和PKB激活的时间进程的差异。PRK2疏水基序的相互作用(比昂迪等2000年)和p90RSK(弗罗丁等., 2000)PDK1不仅可以使这些酶接近，而且可以显著提高PDK1的活性。当S6K1和SGK1与PDK1交互时也可能发生这种情况。

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图8。PDK1专用于识别S6K、SGK和PKB的模型。(A类)PDK1的结构域结构表明PIF-结合囊位于激酶结构域的小叶上。(B类)PDK1可以识别、相互作用然后磷酸化S6K和SGK的模型概述。在此模型中，PtdIns（3,4,5）P₃调节磷酸化S6K1和SGK1的未知疏水基序（HM）激酶的活性，从而触发与PDK1的PIF-结合囊的对接。(C)相反，PDK1的PIF-结合囊不参与PDK1与PKB的结合。相反，这是PKB和PDK1的PH结构域与PtdIns（3,4,5）P的相互作用₃将PKB和PDK1结合在一起。

最近的工作，特别是关于MAP激酶信号通路的工作，强调了MAP激酶上的单一对接区域的重要性，该对接区域允许MAP激酶与MAP激酶激活物和底物以及使其失活的双重特异性MAP激酶磷酸酶的特异性相互作用(田上等., 2000,2001). MAP激酶家族成员上的对接位点似乎是与迄今为止测试的所有底物相互作用所必需的。这与PDK1的PIF-结合囊形成对比，PDK1不需要PKB磷酸化。此外，还不清楚MAP激酶与MAP激酶激酶和MAP激酶磷酸酶的特异性相互作用是如何调节的。在PDK1与S6K、SGK和p90RSK相互作用的情况下，这些酶在疏水基序上的磷酸化是调节这种相互作用的关键决定因素。目前尚不清楚有多少蛋白激酶会拥有只与特定底物子集相互作用的对接位点。如果这是一种普遍现象，它将提高开发针对此类位点的化合物的可能性，这些化合物将抑制一组底物的磷酸化，而不会影响其他底物的磷酸化。与靶向ATP结合位点的化合物相比，此类药物应具有更高的特异性，因此用于治疗疾病时产生的副作用更少。

材料和方法

材料、抗体、缓冲液、cDNA构建、GST融合蛋白的纯化和免疫印迹协议的描述见补充数据，网址为欧洲分子生物学组织在线。

致谢

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