临床癌症研究。作者手稿；PMC 2015年5月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院572396
增加KIT抑制增强胃肠道间质瘤的疗效
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特蕾莎·S·金
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迈克尔·卡夫纳尔
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诺亚·A·科恩
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埃里克·索伦森
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乔纳森·格里尔
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阿德里安·塞弗特
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梅根·H·克劳利
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本杰明·L·格林
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费迪南德·罗西
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罗纳德·德马特奥
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通讯作者：Ronald P.DeMatteo，MD，Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，1275 York Avenue，New York，NY 10065，电话：（212）639-3976，传真：（212）639-4031，gro.ccksm@重新驯化 - 补充资料
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摘要
目的
胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的人类肉瘤，也是靶向分子治疗的模型。GIST依赖致癌KIT信号传导，并对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼产生反应。然而，伊马替尼很少有疗效。我们假设抑制KIT和CSF1R的PLX3397在GIST中比伊马替尼更有效，因为它也会消耗肿瘤相关巨噬细胞，而这些巨噬细胞通常被认为支持肿瘤生长。
实验设计
我们治疗了配套元件V558del版/+发展GIST的小鼠或皮下移植人GIST与伊马替尼或PLX3397的小鼠，并分析肿瘤重量、细胞成分、组织学、分子信号和纤维化。还对人GIST细胞系进行了体外试验。
结果
PLX3397在降低肿瘤重量和细胞数方面比伊马替尼更有效配套元件V558del版/+小鼠GIST和人GIST异种移植物。PLX3397的优势并不取决于肿瘤相关巨噬细胞的耗竭，因为添加CSF1R抑制并不能改善伊马替尼的效果。相反，PLX3397在体外是一种比伊马替尼更有效的KIT抑制剂。PLX3397治疗也诱导了实质性的肿瘤内纤维化，这损害了随后小分子的递送。
结论
PLX3397治疗在临床前GIST模型中比伊马替尼更有效，并保证对GIST患者进行研究。由此产生的瘤内纤维化可能是实现肿瘤完全根除的障碍之一。
关键词：胃肠道间质瘤（GIST）、伊马替尼、KIT、CSF1R、基质
简介
GIST是人类肉瘤中最常见的亚型(1)是实体肿瘤靶向分子治疗的原型。GIST是由配套元件编码KIT受体酪氨酸激酶的癌基因(2)或者，不太频繁的PDGFRA公司编码相关血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）的癌基因(三). 局部原发性GIST通过手术切除治疗，但历史上高达50%的患者发生肿瘤复发，术后中位生存期不到2年(4). 分子治疗极大地改善了晚期GIST的治疗。甲磺酸伊马替尼（Gleevec，诺华公司）是一种酪氨酸激酶抑制剂，专门针对致癌KIT和PDGFRα(5,6)并使80%的晚期GIST患者受益(7). 然而，伊马替尼很少有疗效。最初敏感的肿瘤获得耐药性的平均时间只有18个月(8,9)，通常通过二级配套元件突变(10). 舒尼替尼（Suntent，辉瑞）(11)和雷戈拉非尼（施蒂瓦尔加，拜耳）(12)是食品和药物管理局批准的另外两种多激酶抑制剂，用于不耐受伊马替尼或肿瘤对伊马替尼耐药性的患者。这些药物为一些患者提供了暂时的益处，但肿瘤进展的总中位时间只有5-6个月(11,12).
现有治疗方法的局限性强调了GIST更有效治疗的必要性。改善肿瘤分子治疗（如GIST）的方法包括与其他靶向抑制剂或常规细胞毒性化疗相结合，改变肿瘤微环境，以及开发更有效的分子抑制剂。在GIST转基因小鼠模型中，Rossi等。观察到伊马替尼对Src家族激酶信号的上调作用，发现伊马替尼加达沙替尼（一种针对KIT和Src的多激酶抑制剂）的联合应用在组织学上有一定的益处(13). 针对肿瘤微环境，我们发现GIST肿瘤细胞抑制抗肿瘤CD8+通过表达吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）的T细胞免疫，T细胞激活剂抗CTLA-4与伊马替尼协同作用(14).
PLX3397（Plexxikon）是一种新型的双特异性酪氨酸激酶抑制剂，以KIT和相关受体酪氨酸激酶集落刺激因子-1受体（CSF1R，c-fms）为靶点，具有纳米摩尔效力(15,16). CSF1R信号对巨噬细胞的生存和功能至关重要，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是人类GIST中最常见的免疫细胞类型(17). TAM被认为通过免疫抑制、血管生成和促介导作用促进肿瘤生长(18). 最近的动物研究报告称，PLX3397介导的肿瘤巨噬细胞耗竭可导致直接肿瘤退化(19)或改善化疗反应(15,16)或放射治疗(20). 因此，我们试图评估GIST中KIT和CSF1R的联合抑制。在GIST转基因小鼠模型和人类GIST异种移植物中，我们证明PLX3397的抗肿瘤效果优于伊马替尼。然而，肿瘤反应与实质性肿瘤内纤维化相关，这似乎限制了进一步的药物输送。
材料和方法
小鼠和治疗
6至15周龄配套元件V558del版/+老鼠(21)和C57BL/6J（B6）和NOD。Cg公司-Prkdc公司科学情报部IL2rg公司tm1Wjl公司/使用SzJ（NSG）小鼠（Jackson实验室）。小鼠按年龄和性别进行配对。对于异种移植物实验，106PBS中的GIST-T1细胞与生长因子减少的Matrigel（BD Biosciences）1:1混合，并皮下注射到NSG小鼠的右侧。在平均肿瘤体积为100 mm时开始治疗三根据椭球体公式（1/2×长×宽×高）测量。伊马替尼（LC Laboratories）在饮用水中以600 mg/L的剂量服用PLX3397(15,16)是一种酪氨酸激酶抑制剂，以生化半最大抑制浓度（IC）选择性抑制KIT和CSF1R50)分别为10和20 nM。PLX5622系列(22)是一种对CSF1R（IC）具有同等效力的相关化合物50<10 nM），但对KIT的效力低60倍。这两种抑制剂均由Plexxikon提供，并作为配方饮食、290 mg/kg chow（PLX3397）、1200 mg/kg chov（PLX5622）或对照chow AIN-76A给予。动物由斯隆-凯特琳研究所饲养，程序由机构动物护理和使用委员会批准。
流式细胞术
用于肿瘤试剂盒+细胞和巨噬细胞分析，将肿瘤切碎，在12 mg/mL 2型胶原酶（沃辛顿生化）和0.5 mg/mL DNAse I（罗氏诊断）中37°C孵育30分钟，然后用含1%胎牛血清（FCS）的100然后40μm尼龙细胞过滤器（Falcon，BD Biosciences）冲洗。对于T细胞分析，肿瘤和引流淋巴结（DLN）按所述机械分离(14). 脾脏通过70μm滤网捣碎，在氯化铵裂解缓冲液（eBioscience）中培养，在1%FCS中淬火，然后通过40μm滤网冲洗。每只小鼠从一个胫骨冲洗骨髓，由治疗组收集，通过18号针反复抽吸使其均质，然后在1%FCS中清洗。所有细胞在FACSAria（BD Biosciences）上进行分析，如所述(14). 小鼠特异性抗体包括BD Biosciences的CD45（克隆30-F11）、Kit（CD117）（2B8）、CD11b（M1/70）、CD3（145-2C11）、CD4（GK1.5）、Ly6C（AL-21）和Ly6G（1A8）；来自Invitrogen的F4/80（BM8）；eBioscience的CD45（30-F11）、Kit（Ack2）、CD8（53-6.7）和FoxP3（FJK-16s）。使用FoxP3染色缓冲组（eBioscience）对FoxP3.进行细胞内染色。人类特异性KIT抗体（YB5.B8）购自BD Biosciences。
组织学
小鼠肿瘤用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，并切割成5μm的切片。手术标本的福尔马林固定石蜡包埋切片取自17名GIST患者，这些患者同意根据机构审查委员会（IRB）协议进行组织分析。使用标准方法进行苏木精-伊红（H&E）和马森三色染色。按照指示使用ApopTag红色原位凋亡试剂盒（Millipore），通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测细胞凋亡。使用Mirax Scan（蔡司）对幻灯片进行数字化。隧道+细胞计数为每个肿瘤4-5个代表性场中每个高功率场的总4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）阳性细胞的百分比（Photoshop，Adobe）。如前所述，对小鼠I型胶原（Calbiochem兔多克隆，1:60，室温过夜）和小鼠/人类KIT（柠檬酸盐抗原检索，DAKO兔多克隆（1:600，4°C过夜）进行染色(23). 在Axioplan2宽视野显微镜（蔡司）上分析载玻片。
蛋白质印迹
如前所述，对冷冻GIST组织或GIST-T1细胞中的蛋白质进行分析(23). 从细胞信号技术中获得了针对GAPDH、总和磷酸化KIT（Tyr719）、AKT（Ser473）、S6（Ser235/236）、STAT3（Ser727）和ERK1/2（Thr202/Tyr204）的抗体。
外周血分析
在Idexx Procyte Dx®血液分析仪（Idexx实验室）上对EDTA中的全血进行自动评估。在用Accustain®Wright Giemsa染色剂（Sigma-Aldrich）染色的血液涂片上对100个细胞进行手动白细胞鉴别。
体外试验
GIST-T1细胞已被描述(24). HG129细胞是根据IRB批准的方案从未经治疗的原代胃GIST中建立的，其中含有配套元件第11外显子突变（苯丙氨酸591和甘氨酸592之间插入45bp）。GIST-T1和HG129细胞保存在完全培养基中（RPMI和10%FCS）。NIH3T3细胞由Jackie Bromberg博士提供，保存在含有10%FCS的Dulbecco改良鹰培养基中。为了测量存活率，GIST-T1或HG129细胞在104每孔细胞置于96周的平底平板（Falcon）中，并在37°C的完全培养基中与伊马替尼、PLX3397或H培养72小时2O-或DMSO-溶剂控制。然后按照指示使用细胞计数试剂盒-8（Dojindo）测量存活率，并将其归一化为对照。集成电路50使用Prism 5.0（GraphPad软件）中的非线性回归计算值。为了进行蛋白质分析，GIST-T1细胞在2×106在无血清培养基中每100×20mm细胞培养皿（BD Biosciences）培养细胞过夜，然后换成含有10或40nM伊马替尼或PLX3397或DMSO纯溶剂对照的无血清培养液。
胶原蛋白定量
GIST-T1或NIH3T3细胞在2×106在6孔板（BD Biosciences）中每孔每1mL完整培养基，并用50 nM伊马替尼或PLX3397或仅DMSO溶剂对照培养48小时。然后使用可溶性胶原蛋白分析法分析培养基中的可溶性胶原蛋白含量(快酵素生物科学）。
细胞分离和RT-PCR
用小鼠CD45特异性免疫磁珠（Miltenyi Biotec）孵育大体积肿瘤细胞悬浮液，通过40μm的过滤器清洗，离心，然后每10个通过一个LS柱（Miltenxi）8细胞。CD45型+从阳性部分收集细胞。CD45型−用小鼠CD117（Kit）特异性微球（Miltenyi）培养细胞，然后通过2个连续的LS柱进行阳性选择。流式细胞术评估的纯度大于95%（CD45−配套元件+)和85%（CD45+). 来自肿瘤细胞悬浮液或CD45的总RNA−配套元件+或CD45+与之前一样，分离细胞组分并通过RT-PCR进行分析(23). 小鼠引物和TaqMan探针第1a1列,第1a2列、和GAPDH公司来自Applied Biosystems。采用ViiA 7实时PCR系统（Applied Biosystems）进行RT-PCR。将胶原mRNA表达标准化为来自对照处理小鼠的大块肿瘤细胞mRNA。
成像和药物传递分析
按照说明进行磁共振成像（MRI）并进行分析(14). 对于肿瘤摄取和生物分布研究，100μCi9900万100μL的Tc-西斯塔米比（核诊断产品）通过尾静脉注射给药配套元件V558del版/+用对照、伊马替尼或PLX3397治疗2.5周的小鼠，然后停止治疗3天。在能量校准剂量校准器（CRC-15R；Capintec）中测量给药前后注射器中的放射性，并确定每只动物接受的确切量。然后在2小时后用一氧化碳处死小鼠2窒息。在预先称重的试管中收集组织，称重，并使用伽马计数器（Perkin Elmer 1480 Wizard 3自动伽马计数器）进行放射性计数，该计数器在峰值位置140 keV附近具有自动能量窗，覆盖了90%的计数。然后使用校准因子将计数转换为活性（mCi），并通过除以衰变校正的注射活性和器官重量计算每克注射剂量的百分比（%ID/g）。对于荧光示踪剂研究，配套元件V558del版/+用对照组、伊马替尼或PLX3397治疗小鼠10周，然后在处死前50分钟静脉注射15 mg/kg Hoechst 33342染料（分子探针，Invitrogen）或PBS对照组，然后静脉注射2 mg/kg荧光素番茄红凝集素（Vector Laboratories）或生理盐水在处死前5分钟进行控制。将肿瘤和脾脏包埋在Tissue-Tek O.C.T.复合物（樱花）中，并切割成5μm厚的冰冻切片。幻灯片如上所述进行了数字化，3张代表性的0.6mm2在MetaMorph软件（Molecular Devices）中分析每个肿瘤的场。通过阈值面积测量计算平均细胞Hoechst强度，并将其归一化为对照组小鼠。每个场的凝集素染色血管总面积同样计算并归一化。从分析的每个字段中减去基线自体荧光。
统计
使用Prism 5.0分析数据。未配对双尾学生t吨如适用，进行测试或与Bonferroni测试后比较的单向方差分析。比较肿瘤KIT时+组间细胞数、细胞计数首先进行对数转换，然后进行单因素方差分析。p值<0.05被认为是显著的。
结果
PLX3397与伊马替尼相比具有更强的抗肿瘤作用配套元件V558del版/+老鼠
为了研究PLX3397在GIST中的疗效，我们利用转基因配套元件V558del版/+小鼠自发形成盲肠GIST，对伊马替尼有反应(14,21,25). 与伊马替尼相比，服用PLX3397四周后，肿瘤重量和大小减轻的程度更大(). 此外，PLX3397治疗导致试剂盒减少90%+肿瘤细胞比伊马替尼()肿瘤细胞大小和粒度进一步减小，提示细胞凋亡和坏死(). 组织学证实了PLX3397的显著作用，因为与伊马替尼相比，PLX3397治疗后细胞减少、坏死和纤维化更加明显(). 与我们的研究结果一致，PLX3397也导致了比伊马替尼更大的肿瘤凋亡(). 总的来说，PLX3397在以下方面比伊马替尼更有效配套元件V558del版/+老鼠。
PLX3397在以下方面优于伊马替尼配套元件V558del版/+老鼠（A–E）来自配套元件V558型号/+用常规饮用水和对照组（CTRL）、饮用水和控制组（IM）中的伊马替尼，或常规饮用水与PLX3397组（PLX3396）治疗4周后，对小鼠进行分析。（A） 肿瘤重量。（B） 肿瘤外观。比例尺，1 cm。（C–D）用胶原酶和Kit消化肿瘤+流式细胞术检测肿瘤细胞。（C） 代表性图展示Kit+CD45上的肿瘤细胞门控−单元格（左侧）。CD45型−配套元件+根据台盼蓝排除法和流式细胞术对每个肿瘤的细胞进行定量（右）。（D） Kit上的代表性地块+细胞表现出光的正向和侧向散射（FSC，SSC），这表明细胞大小和粒度。（E） 肿瘤H&E染色。比例尺，100（左）和20μm（右）。（F） 肿瘤的TUNEL染色配套元件V558del版/+小鼠接受24小时或1周的治疗。比例尺，40μm。隧道+电池，量化为每个高功率场中总电池的百分比（见下文）。A、C中的数据来自4个实验，D–F中的数据代表1-3个实验，每组2-6只小鼠。条形图显示平均+/-SEM。*p<0.05。
CSF1R抑制不能解释PLX3397的疗效
PLX3397和伊马替尼均以纳米摩尔效力抑制Kit(15,26). 然而，PLX3397比伊马替尼更能抑制CSF1R(15,26,27)CSF1R信号对多种类型的巨噬细胞（包括肿瘤相关巨噬细胞）的维持和功能起着重要作用(18). 在配套元件V558del版/+我们发现PLX3397比伊马替尼更能消耗肿瘤巨噬细胞()而对肿瘤、引流淋巴结（DLN）和脾脏中其他免疫细胞的频率影响较小(补充图S1A–B). 因此，我们假设，增强CSF1R抑制和更大的肿瘤巨噬细胞耗竭是PLX3397在GIST中的卓越疗效的原因。为了测试这一点，我们将伊马替尼与PLX5622联合使用(22)，一种与PLX3397同等效力的CSF1R特异性抑制剂，对Kit无明显抑制作用。尽管PLX3397治疗的肿瘤巨噬细胞耗竭水平相当()PLX5622治疗并没有增强伊马替尼对肿瘤重量、细胞数量或组织学的影响，PLX3397仍是最佳治疗方法(). 这些结果表明，肿瘤巨噬细胞耗竭与PLX3397在配套元件V558del版/+老鼠。
CSF1R抑制不能解释PLX3397效应配套元件V558del版/+除非另有说明，否则给小鼠治疗4周。（A） 肿瘤相关巨噬细胞（TAM，F4/80你好)通过流式细胞术进行测量，具有代表性的CD45流图+细胞。（B） 肿瘤相关巨噬细胞耗竭显示为CD45的百分比+流式细胞术检测细胞。（C） 肿瘤重量。（D） 肿瘤试剂盒+通过台盼蓝排斥法和流式细胞术测定细胞数。（E） 肿瘤H&E染色。比例尺，20μm。A、B、E中的数据代表2-5个实验，C–D中的数据来自2个实验，每组2-5只小鼠。条形图显示平均+/-SEM。*p<0.05。
在GIST的临床前模型中，PLX3397实现了比伊马替尼更大的KIT抑制
除CSF1R外，Kit是PLX3397具有生化IC的唯一其他激酶50小于100nM(15). 考虑到CSF1R抑制对体内肿瘤大小的非贡献作用，我们假设更强的Kit抑制可以解释PLX3397与伊马替尼相比的更大疗效。在肿瘤中配套元件V558del版/+接受1周或4周治疗的小鼠，在PLX3397治疗的肿瘤中，磷酸化KIT与总KIT的表达没有显著差异，至少在残留的肿瘤细胞中没有显著差异(). 然而，与伊马替尼相比，PLX3397在每个细胞的基础上更有效地减少了Kit的总表达(). 此外，PLX3397降低了肿瘤中磷酸化Akt和磷酸化STAT3β亚型的水平，这两种亚型都是Kit信号的下游介导物(). PLX3397没有降低下游介质磷酸化-ERK1/2的表达()，提示可能激活代偿信号通路，正如其他肿瘤模型中所证明的那样(28). PLX3397-介导的Kit抑制的其他全身表现包括头发脱色()红细胞生成减少()，两个依赖于Kit的过程不受伊马替尼类似疗程的影响。PLX3397也比伊马替尼更能减少骨髓中的其他造血谱系(补充图S1C)但在外周血中性粒细胞和单核细胞减少的程度上与伊马替尼相似(). 总之，这些数据表明PLX3397与伊马替尼在体内治疗期间对致癌和野生型Kit的抑制作用更强。
PLX3397在体内实现了比伊马替尼更强的Kit抑制（A） 肿瘤的蛋白质印迹配套元件V558del版/+按照指示处理小鼠。（B） 通过CD45的流式细胞术测量Kit的表达，以平均荧光强度（MFI）表示−配套元件+肿瘤细胞配套元件V558型号/+小鼠治疗4周。（C） 代表性照片配套元件V558del版/+用伊马替尼或PLX3397治疗小鼠17周。外周血红细胞（RBC）（D）、中性粒细胞（E）和单核细胞（F）通过自动全血计数和手动白细胞分类进行定量配套元件V558del版/+治疗4周的小鼠（“x”表示单个B6对照小鼠）。数据表示每组3-6只小鼠，显示为平均+/-SEM。*p<0.05。
为了排除PLX3397和伊马替尼之间潜在的药代动力学差异，我们比较了两种体外药物与2种携带伊马替尼敏感性激活剂的人类GIST细胞系配套元件外显子11突变与我们的相似配套元件V558del版/+鼠标模型。事实上，PLX3397降低了这两种细胞系的生存能力，其效力是伊马替尼的两倍，且具有IC508–18 nM对42 nM(，p<0.05）。浓度与IC相似50在每种药物中，即10 nM和40 nM，PLX3397也比伊马替尼更有效地降低磷酸化KIT相对于总KIT(). 因此，PLX3397在体外是一种比伊马替尼更强的KIT抑制剂。为了将这些发现转化为人类GIST的体内模型，我们给建立了GIST-T1皮下异种移植物的小鼠注射PLX3397或伊马替尼。与我们的体外研究结果类似，PLX3397降低了肿瘤大小和KIT+肿瘤细胞比伊马替尼更显著(). 尽管GIST-T1单元格包含配套元件第11外显子突变及体外对伊马替尼敏感()，伊马替尼在体内仅具有细胞抑制作用()如前所述(29). 相反，PLX3397治疗导致GIST-T1异种移植物显著退化。总之，PLX3397在小鼠和人类GIST中的抗肿瘤效果优于伊马替尼。
PLX3397对人类GIST细胞系和异种移植物的作用比伊马替尼更强（A） 可行性和IC50在用指示浓度的伊马替尼或PLX3397处理的GIST-T1和HG129细胞中。曲线表示非线性回归。（B） 伊马替尼或PLX3397处理的GIST-T1细胞的Western blot。将（C-F）NSG小鼠与已建立的皮下GIST-T1异种移植瘤治疗11天，然后对肿瘤进行分析。（C） 肿瘤体积。（D） 肿瘤重量。（E） 肿瘤外观。比例尺，1厘米（F）CD45−配套元件+通过台盼蓝排斥和流式细胞术测量的肿瘤细胞数。数据代表了1-6个实验，每组3-12个。图表显示平均值+/-SEM。*p<0.05。
GIST中的基质堆积可能限制KIT靶向治疗
虽然PLX3397明显比伊马替尼更有效，但我们的结果提出了一个问题，即为什么PLX3396不能在我们的转基因中实现肿瘤根除配套元件V558del版/+小鼠模型，其中可能存在相对的肿瘤同质性。一种可能是我们通过H&E染色观察到的基质反应()限制了对剩余肿瘤细胞的进一步药物输送。为了进一步分析PLX3397治疗的基质反应，我们用Masson三色染色法检测肿瘤，该染色法可染胶原蓝(). 到1周时，PLX3397显著增加了肿瘤胶原蛋白，到17周时，胶原蛋白积累显著。另一方面，伊马替尼治疗的肿瘤胶原积累速度较慢，程度较低，未治疗的肿瘤仅维持恒定的低水平胶原。有趣的是，对长期伊马替尼治疗（例如，6个月）有反应的人类GIST显示出与PLX3397治疗的小鼠肿瘤相似的胶原染色，而未治疗的人类肿瘤或对伊马替尼有耐药性的肿瘤则没有(). 因此，基质反应可能不是PLX3397治疗所特有的。
KIT抑制诱导肿瘤纤维化与KIT抑制程度成正比（A） 肿瘤的Masson三色染色配套元件V558del版/+老鼠。比例尺，20μm。（B） 代表9名未治疗患者中的8名、6名伊马替尼敏感患者中的5名和2名伊马替尼耐药患者中的2名患者的人类GIST标本的Masson三色染色。比例尺，100（左）和20μm（右）。（C） 肿瘤I型胶原染色配套元件V558del版/+小鼠治疗4周。比例尺，100（左）和20μm（右）。（D）第1a1列和第1a2列RT-PCR法检测大体积肿瘤中的表达，Kit+肿瘤细胞，或CD45+用磁珠分离法分离肿瘤间质细胞配套元件V558del版/+用PLX3397治疗小鼠5天。（E） 来自培养48小时的GIST-T1细胞的条件培养基中的可溶性胶原。显示了5个重复的平均值。显示培养的NIH3T3成纤维细胞中的胶原蛋白用于比较。检测下限为3.5μg/mL。数据代表了1-3个实验，每组2-8个。条形图显示平均+/-SEM。*p<0.05。
免疫组织化学显示PLX3397治疗的肿瘤基质中存在I型胶原纤维(). 令人惊讶的是，肿瘤中的成纤维细胞活化蛋白α（FAP）表达细胞（未显示）浸润程度很低，在其他肿瘤模型中，这些细胞被报道为活化的癌相关成纤维细胞，是上皮性癌胶原蛋白的主要细胞来源(30). 相反，I型胶原转录物在试剂盒中表达更高+PLX3397治疗后肿瘤细胞比其他瘤内细胞中的肿瘤细胞多(). 此外，GIST细胞系在体外产生可溶性胶原蛋白，用伊马替尼或PLX3397处理的细胞中有增加胶原蛋白的趋势(). 总之，这些发现表明GIST中KIT抑制导致肿瘤细胞介导的胶原沉积和组织重塑的最终共同途径。
接下来，我们评估残留肿瘤细胞的生存能力和药物输送的充分性。在配套元件V558del版/+伊马替尼或PLX3397治疗小鼠长达17周，残留的肿瘤细胞保持完整的细胞核和Kit表达()类似于伊马替尼反应的人类GIST(7,31)表明尽管长期接触药物，但仍有生存能力。我们在我们的配套元件V558del版/+当PLX3397在治疗4周后停用时，肿瘤在接下来的11周内重新生长的小鼠模型(). 为了模拟药物传递，我们用放射性小分子示踪剂静脉注射治疗过的小鼠9900万Tc-sestamibi或荧光DNA染料Hoechst 33342，两者的分子量（约780和620）与伊马替尼和PLX3397相似（约490和400）。事实上，肿瘤吸收明显减少9900万PLX3397治疗小鼠与对照或伊马替尼治疗小鼠中的Tc-色斯塔米比的比较(,补充图S2). 然而9900万Tc-sestamibi结果仅反映了每克肿瘤的平均示踪剂摄取量，而不是细胞内与细胞外基质结合示踪剂的相对量。为了更好地评估每个肿瘤细胞的药物传递，我们使用了Hoechst 33342。与我们的一致9900万与对照组或伊马替尼治疗组相比，Tc-sestamibi发现PLX3397治疗组显著降低了肿瘤细胞对Hoechst染料的摄取(). 另一方面，与对照组相比，伊马替尼和PLX3397在较小程度上增加了凝集素染色估计的肿瘤灌注。总的来说，KIT抑制在小鼠和人类GIST中诱导肿瘤纤维化的程度与KIT抑制的效力或持续时间成正比，由此产生的基质积聚似乎阻碍了小分子向残余肿瘤细胞的传递。
肿瘤纤维化损害药物输送配套元件V558del版/+老鼠（A） 肿瘤的试剂盒染色配套元件V558型号/+小鼠治疗17周。比例尺，20μm。（B）配套元件V558del版/+小鼠用PLX3397治疗4周，然后停止治疗。治疗后0周和11周通过MRI测量肿瘤体积，并与15周龄未治疗对照组的肿瘤体积进行比较配套元件V558del版/+老鼠。（C）配套元件V558del版/+小鼠接受2.5周的治疗，然后单次注射99百万肿瘤和外周血放射性显示为每克注射剂量的百分比（%ID/g）。（D） 肿瘤的荧光显微图像配套元件V558del版/+小鼠接受10周的治疗，然后单次注射Hoechst染料和荧光素结合凝集素。相对Hoechst强度以百分比为基础进行测量。比例尺，500μm。每个代表性区域的平均细胞Hoechst强度和总凝集素阳性面积的量化显示为标准化，以控制肿瘤。数据代表每组2-5只小鼠。条形图显示平均+/-SEM。*p<0.05。
讨论
分子疗法很少能治愈癌症，这是一个主要的临床问题，也是当前肿瘤学研究的推动力。在这里，我们展示了两个出乎意料的相关解释，解释了为什么KIT抑制不能完全消除GIST，尽管肿瘤对KIT失活具有极高的敏感性，即当前可用抑制剂的次优效力和药物传递的基质阻抗。温斯坦首先介绍了癌基因成瘾理论，以解释尽管存在许多其他基因改变，单个驱动癌基因的失活如何阻止肿瘤发生(32). 条件转基因小鼠模型的研究确实表明，单个癌基因的转录或翻译沉默可以导致淋巴瘤等多种肿瘤的完全消退(33)、骨肉瘤(34)和黑色素瘤(35)其机制包括细胞周期阻滞、凋亡、分化和衰老。不幸的是，在GIST中(9)与其他被推定为致癌药物依赖的实体人类肿瘤一样，如BRAF突变的黑色素瘤和表皮生长因子受体（EGFR）突变的非小细胞肺癌，药物抑制无法重现相同程度的肿瘤退化。对这种差异最简单的解释之一可能是现有药物对癌蛋白的抑制作用不足。在本研究中，我们表明，在GIST转基因小鼠模型和人类GIST异种移植物中，增加驱动抑制可以导致比一线药物伊马替尼更大的肿瘤退行性。PLX3397增强肿瘤细胞的清除依赖于更有效的KIT抑制，而非巧合的CSF1R介导的巨噬细胞耗竭。药物诱导细胞凋亡的快速动力学有待进一步研究。总的来说，我们的结果重申了驱动抑制在GIST中的重要性，并为开发和测试更有效的抑制剂提供了理论基础，不仅在GIST，而且在其他具有已确定驱动癌蛋白的实体肿瘤中。
值得注意的是，与伊马替尼相比，PLX3397不仅表现出更好的抗肿瘤效果，而且似乎对滤泡黑素细胞中的野生型KIT实现了更大的系统性抑制，这需要KIT信号来促进黑素生成(36)以及造血干细胞的一个子集，尤其是红系前体细胞，其正常红细胞发育需要KIT(37). 以前曾在小鼠中观察到色素沉着(19)和人类(38)使用PLX3397，但不使用伊马替尼。这种全身表现反映了PLX3397对KIT的较强抑制，但也可能是KIT抑制治疗指数上限的信号。因此，虽然从理论上讲，更有效的KIT抑制剂可以比我们在这里报道的更有效地实现肿瘤反应，但此类药物可能会受到KIT相关毒性的限制，例如骨髓抑制。值得注意的是，PLX3397治疗并未使小鼠易受感染。因此，PLX3397可能是GIST最具临床吸引力的KIT抑制剂，在可接受的全身毒性范围内实现最高水平的KIT灭活。
从更广泛的角度来看，肿瘤微环境因其在肿瘤发生中的作用和潜在的治疗靶向性而日益受到重视。与当前研究相关，对分子治疗的耐药性不仅可能来自肿瘤细胞的内在机制，也可能来自多种细胞的外在机制。在实体肿瘤中，尤其值得关注的是药物输送受损，这可能是由于肿瘤灌注异常、肿瘤间质静水压升高和细胞外基质重塑所致，所有这些都会导致药物渗透到肿瘤中的不良程度、肿瘤区域内的亚治疗药物水平、，和最终处理失败(39). 在这里，我们证明，在KIT驱动的GIST小鼠模型中，有效的KIT抑制可诱导肿瘤纤维化，组织学改变使人想起对伊马替尼有反应的GIST患者中观察到的基质堆积(31,40). 重要的是，我们发现这种纤维化反应不仅与肿瘤细胞死亡有关，而且可能是治疗反应性肿瘤中进一步小分子递送的障碍。最初令人惊讶的是，像PLX3397这样强效的KIT抑制剂，治疗时间长达1个月至1年以上，可以在我们的基因同源小鼠模型中根除大多数但不是所有的肿瘤细胞。相反，残留的肿瘤细胞持续存在，保持了治疗后恢复生长的能力，并在重新生长后保留了药物敏感性（未显示）。这些观察表明耐药的可逆机制可能包括细胞内机制，如药物诱导的静止，或细胞外机制，如亚治疗药物传递。卓别林皮下肺癌模型中注射Hoechst染料成像肿瘤细胞靠近血管等。发现Hoechst-dim细胞（离最近的血管有多层细胞）对阿霉素的全身注射反应比Hoechst明亮细胞弱。这些发现表明，Hoechst荧光与药物传递相关，并且每细胞传递影响药物疗效(41). 在当前研究中，我们预测与对照组或伊马替尼治疗的肿瘤相比，PLX3397中的Hoechst摄取均匀减少，这是由于细胞外基质积聚导致组织渗透减少所致。药物输送和肿瘤细胞反应的可疑损害可能与卓别林及其同事的结果类似。我们承认，我们的药代动力学研究受到小分子示踪剂使用的限制，这些示踪剂的分子量与我们感兴趣的药物相似，但在水和脂溶性、分子结构和电荷方面明显不同，所有这些都会影响通过细胞和组织的分子通量(39). 由于缺乏能够以足够高的分辨率成像的标记药物形式，我们无法直接测量伊马替尼或PLX3397对肿瘤的每细胞传递。然而，我们一致发现PLX3397治疗的肿瘤中的小分子摄取减少，而不考虑其独特的化学性质9900万Tc-sestamibi或Hoechst染料。将我们的结果外推到正在研究的药物，我们认为治疗反应性肿瘤的药物渗透受损可能导致GIST中酪氨酸激酶抑制剂的耐药性。为了最大限度地提高药物疗效，可能需要进一步优化药物输送，PLX3397介导的肿瘤纤维化的快速动力学可能是未来研究的有用模型。
阐明KIT抑制的纤维化反应的具体机制可能揭示GIST的新治疗靶点。然而，与大多数上皮癌不同，细胞外基质来源于浸润的成纤维细胞(30)，我们发现FAP+成纤维细胞仅占肿瘤内细胞的1%配套元件V558del版/+肿瘤（未显示）。胶原蛋白生产的功能研究正在进行中配套元件V558del版/+小鼠与FAP-DTR小鼠杂交，后者在FAP公司发起人(42). 然而，我们在此报告GIST肿瘤细胞本身似乎是KIT靶向治疗中最丰富的胶原蛋白来源。因此，消融大多数GIST肿瘤细胞的药物本身就自相矛盾地诱导基质反应，从而可能阻止肿瘤细胞完全消除。由于没有额外的细胞类型作为靶点，通过增加病理性胶原蛋白的降解或抑制其生成来调节基质可能是有益的。在胰腺癌条件转基因小鼠模型中，Provenzano等。(43)和雅各贝茨等。(44)证明促结缔组织增生性肿瘤基质富含透明质酸，透明质酸是一种蛋白多糖，过量会导致肿瘤内极高的间质流体压力，全身给药聚乙二醇化透明质酸酶对透明质酸的降解不仅减少了肿瘤间质，而且改善了化疗的递送和反应。据类似报道，瘤内注射胶原酶可以改善各种实体瘤的治疗效果(45)，但在临床上治疗腹腔内肿瘤是不切实际的，而且目前还没有一种全身施用的无毒形式的胶原酶。一项替代性抗纤维化药物的试验，例如胶原蛋白合成抑制剂，需要考虑在GIST中结合KIT抑制。
虽然我们假设PLX3397治疗的肿瘤中胶原蛋白的积累部分是由于巨噬细胞的丢失，但与伊马替尼和巨噬细胞耗竭联合治疗只会导致轻微的肿瘤纤维化。因此，尽管巨噬细胞在稳态细胞外基质降解和重塑中发挥着重要的生理作用，但在PLX3397治疗中，巨噬细胞的丢失似乎并未影响基质的积累。这种效果的缺乏表明GIST中细胞外基质周转的净状态更多地依赖于肿瘤细胞的活性，而较少依赖于传统意义上的基质细胞，如巨噬细胞和成纤维细胞。巨噬细胞耗竭并没有影响肿瘤细胞的整体存活率，这也令人惊讶，并可能突出了我们模型的局限性，即配套元件V558型号/+在慢性治疗中，小鼠GIST不会转移或显示肿瘤生长，这是两个临床问题，在这两个问题中，促进肿瘤的巨噬细胞的耗竭实际上可能会改善预后。或者，充分灭活癌蛋白可能会在一定程度上阻止肿瘤发生，从而使肿瘤免疫反应的生物学相关性降低。需要一个更积极的GIST模型来研究这些问题。
我们在此证明，在临床相关的GIST小鼠和异种移植模型中，增加KIT抑制转化为增强抗肿瘤作用，但这种治疗最终可能受到KIT相关的全身毒性以及重要的是肿瘤细胞介导的纤维化和药物传递可能受损的限制。要彻底根除非手术性GIST的肿瘤，可能需要结合有效的KIT抑制、基质调节剂，或许在减少纤维化的情况下，还需要结合免疫激活剂。一种有效的KIT抑制剂，如PLX3397，可能是治疗肿瘤的一线治疗最有效的药物，肿瘤对癌基因失活最敏感，并且可能获得较少的遗传和非遗传耐药机制。提前充分根除肿瘤细胞可能会将残留细胞持续存在和后期疾病进展的风险降至最低。因此，我们的研究结果对GIST患者和具有类似肿瘤药物依赖性癌症的患者的管理具有直接的适用性。
翻译相关性
靶向分子治疗彻底改变了肿瘤药物依赖性肿瘤（如GIST）患者的治疗，但患者几乎总是产生耐药性和疾病进展。我们证明，在GIST转基因小鼠模型和人类GIST异种移植物中，KIT和CSF1R抑制剂PLX3397比伊马替尼实现了更多的肿瘤消退。PLX3397治疗还与更大的系统性KIT抑制相关，包括骨髓抑制，并诱导严重的瘤内纤维化，这似乎损害了进一步的药物传递。我们的发现保证了对人类GIST中更有效的KIT抑制剂的研究，并确定基质反应是最大药物传递的潜在障碍。
致谢
财务支持：研究人员得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款R01 CA102613和T32 CA09501、杰弗里·比恩癌症基金会、JHL Pit先生和Pitvan Karnebeek夫人以及荷兰GIST基金会、GIST癌症研究基金会、美国游泳协会、斯蒂芬妮和弗雷德·舒曼通过风车巷基金会的支持，以及David和Monica Gorin（R.P.D.）；F32 CA162721和马萨诸塞州总医院（T.S.K.）的Claude E.Welch奖学金；和P50 CA140146（P.B.和C.R.A.）。分子细胞学核心设施由癌症中心支持拨款P30 CA008748支持。内容完全由作者负责，不一定代表NCI或NIH的官方观点。
我们感谢斯隆-凯特林研究所比较病理学实验室、分子细胞学、动物成像、单克隆抗体和病理学核心设施、菌落管理小组和研究动物资源中心的成员。我们感谢斯蒂芬·多蒂（Stephen Doty）和特殊外科医院分析显微镜实验室（Analytical Microscopy Laboratory at Hospital for Special Surgery）对胶原蛋白染色的洞察力和帮助，感谢米塔特·戈恩（Mithat Gonen）对统计分析的帮助，感谢普列克西康（Plexxikon）的吉迪恩·博拉格（Gideon Bollag）和布赖恩·韦斯特（Brian，彼得·贝斯默（Peter Besmer）、克里斯蒂娜·安东内斯库（Cristina Antonescu）、艾伦·霍顿（Alan Houghton）和杰德·沃尔乔克（Jedd Wolchok）实验室的成员提供了有益的讨论和技术支持，罗素·霍姆斯（Russell Holmes）提供了行政支持。
脚注
潜在利益冲突的披露：R.P.D.曾担任诺华公司的顾问。
作者贡献：
概念和设计：T.S.Kim、M.J.Cavnar、E.C.Sorenson、J.B.Greer、N.A.Cohen、A.M.Seifert、N.Pillarsetty、D.R.Veach、A.T.Ku、S.Zeng、R.P.DeMatteo方法开发：T.S.Kim、M.J.Cavnar、S.Zeng、R.P.DeMatteo
数据采集：T.S.Kim、M.J.Cavnar、S.Zeng、N.A.Cohen、M.H.Crawley、B.L.Green、R.Popow、N.Pillasetty、D.R.Veach、A.T.Ku
数据分析和解释：T.S.Kim、M.J.Cavnar、E.C.Sorenson、J.B.Greer、N.A.Cohen、A.M.Seifert、M.H.Crawley、B.L.Green、R.Popow、N.Pillarsetty、D.R.Veach、A.T.Ku、F.Rossi、P.Besmer、C.R.Antonescu、S.Zeng、R.P.DeMatteo
撰写、审查和/或修订手稿：T.S.Kim、M.J.Cavnar、E.C.Sorenson、J.B.Greer、N.A.Cohen、A.M.Seifert、M.H.Crawley、B.L.Green、R.Popow、N.Pillarsetty、D.R.Veach、A.T.Ku、F.Rossi、P.Besmer、C.R.Antonescu、S.Zeng、R.P.DeMatteo
行政、技术或物资支持：T.S.金
研究监督：R.P.德马特奥
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