新EMBO成员的评论

介绍

蛋白激酶C（PKC）信号转导家族的特征是对脂质的活性依赖。具体而言，经典的（cPKCα、β和γ）和新的（nPKCδ、Ş、η和θ）PKC同种型显示出对二酰基甘油的活性的生理要求。PKC的这种性质定义了一种现已建立的信号通路，该通路通过受体作用于磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，从而通过二酰甘油（DAG）[和肌醇（1，4，5）三磷酸Ins（1，4，5）P_三/钙²⁺]至PKC（图​（图1）。1). 这种通路的操作在许多细胞类型中都有描述，许多综述都涉及到这种信号传递范式（参见西冢，1986年;拥抱等., 1993;德克尔和帕克，1994年;Jaken，1996年).

在单独的窗口中打开

图1。PKC激活的经典途径。该方案说明了直接前体脂质PtdIns（4,5）P的生成₂来自其亲本脂质PtdIns。各种激动剂与磷脂酶（PtdIns-PLC）相连，磷脂酶可以裂解PtdIns（4,5）P₂二酰甘油（DAG）和钙动员剂Ins（1,4,5）P_三钙可以通过促进膜募集来影响cPKC类别，但对于cPKC和nPKC等体型而言，膜上的关键变构激活剂是DAG。

最近，人们注意到PKC本身的磷酸化。有趣的是，曾经被认为是纯效应器驱动的换能器竟然具有复杂的振幅控制。对cPKC同型中这种磷酸化控制的阐明为理解直系亲属的行为奠定了基础，并对其他相关的AGC激酶产生了影响（参见汉克斯和亨特，1995年; 有关更多信息，请访问蛋白激酶资源：http://www.sdsc.edu/Kinases网站). 对作用于nPKC的激酶的进一步表征提供了三种不同的输入途径汇聚于PKC的证据。因此，PKC是多个信号在细胞中集成方式的一个优雅示例。

本综述的目的是提供：（i）磷酸化的一般模型及其如何控制（a）cPKC和（b）n/aPKC的活性；（ii）对作用于各种PKC的激酶的当前理解的描述；以及（iii）讨论一般信号的更广泛含义。

cPKC磷酸化

一段时间以来，已有证据表明cPKCα活性受到磷酸化的控制，研究发现12-哦-十四烷基-13-乙酸酯（TPA）诱导的快速迁移（去磷酸化）形式是不活跃的(Borner等人，1988年)更直接地说，纯化的蛋白质在磷酸酶处理后可以被灭活(Pears等人，1992年). PKCα的后续突变在激酶结构域的激活环中定义了一个苏氨酸残基（T497），该残基对活性至关重要(Cazaubon等人，1994年). 该磷酸化位点也保存在ACG激酶超家族成员cAMP依赖性蛋白激酶（PKA；Thr197）中。根据对PKA的详细结构分析，磷酸化Thr197已被证明在该酶的催化位点排列中发挥作用(Knighton等人，1991年). PKCα和PKCβ的结构模型表明这些活化环磷酸化位点的作用相当(奥尔和牛顿，1994年;Srinivasan等人，1996年). 对于PKCα，已经确定了PKCβ激活环T500位点磷酸化的绝对需求(奥尔和牛顿，1994年). 因此，对于这些cPKC，有证据表明活化环磷酸化是活性所必需的。此外，对昆虫细胞中表达的重组蛋白的分析表明，这些位点在一定程度上被占据(Keranen等人，1995年;Tsutakawa等人，1995年). 哺乳动物细胞中的表达也揭示了cPKC同型中这些位点的磷酸化，包括cPKCγ(Hansra等人，1999年).

杆状病毒表达PKCβ的原始自磷酸化位点之一_我(=β₂)，T642型(Flint等人，1990年)也被纯化的重组蛋白和完整的细胞所占据。据报道，该位点的磷酸化对活性有各种影响。PKCβ的原始突变分析_我表明其磷酸化对活性至关重要。然而，表达的非磷酸化蛋白的溶解度可能存在问题；从重组PKCα中去除磷酸盐会导致聚集，与去磷酸化形式的中性洗涤剂不溶性平行，这些形式可能会累积体内（参见Bornancin和Parker，1996年). 随后发现PKCβ_二，如果同源T641发生突变，其他局部位点就会磷酸化以进行补偿，从而产生一种完全功能的蛋白质（参见牛顿，1997). 对于PKCα，等效的T638A突变体不是完全功能性的，表现出高比活性，但热不稳定性、对氧化的敏感性以及对蛋白磷酸酶的敏感性(Bornancin和Parker，1996年). 这种表型表明，即使在PKCα中发生补偿磷酸化，T638位点本身的磷酸化也起着独特的作用。

PKCα的合成观察表明，T638占据有利于催化结构域的闭合构象。活化环上的磷酸化也有助于形成闭合构象。因此，C末端区域和核心催化域之间似乎存在相互作用。部分蛋白水解分析进一步支持了对闭合构象的预测。这表明，当T638位点未被占据时，C末端对解理敏感(Bornancin和Parker，1996年). 正如PKA所观察到的，这种行为在分子水平上的基础很可能涉及V5结构域与激酶结构域核心的上下叶的相互作用。通过推断，T497和T638磷酸化的协同作用反映了核心结构域的适当折叠和/或其上/下叶的相对旋转。

PKCα和PKCβ中的第三个“启动”位点是通过直接磷酸盐分析和基于预测的PKC和p70中位点模式之间的相似性的诱变鉴定的^S6激酶(克雷南等., 1995;茑川等., 1995;Bornancin和Parker，1997年). 它位于PKC的C末端V5亚结构域的疏水区域，19个氨基酸位于自磷酸化位点之后。PKCα疏水位点的突变提供了证据，证明磷酸化在控制PKCα中这些“启动”位点（即497/638/657）的占据率中起作用(Bornancin和Parker，1997年). PKCβ的研究_二已经表明，在等效位点（S660）的磷酸化影响钙²⁺PKCβ亲和力(爱德华兹和牛顿，1997年). 当催化结构域整体处于封闭状态（即磷酸化状态）时，后一种性质可能通过C2结构域与该C末端V5结构域的接触而受到影响。虽然对于所有这些磷酸化事件的顺序及其确切后果仍存在一些争议，但图中总结了一个主要基于PKCα研究的通用模型​图22.

在单独的窗口中打开

图2。PKC磷酸化模型。PKC由调控结构域表示，包括C1结构域、C2结构域和假底物位点（黑圈）以及具有C末端V5延伸的催化结构域（C3/4）。预计未磷酸化的初级翻译产物几乎没有活性。在膜上的配体结合上，PKC成为作用于活化环位点（对于PKCα为T497位点）和疏水性C末端位点（对于PKCα为S657位点）的激酶的底物。在随后的自磷酸化（对于PKCαT638位点）之后，激酶结构域处于闭合构象中，具有稳定性和磷酸酶抗性。配体分离使激酶从膜上扩散，但保持磷酸化状态。然后，潜伏的激酶可以被重新募集到膜上，并由DAG单独激活。

这里将参照上述三个催化域“启动”磷酸化位点，即活化环位点、自磷酸化位点和疏水性C末端位点，讨论PKC磷酸化。虽然不是本综述的中心主题，但应该指出，从这些位点去除磷酸盐对cPKC脱敏至关重要(汉斯拉等., 1996). 磷酸化位点特异性抗血清清楚地证明了这一点。在慢性激活时，这些抗血清的免疫反应丧失先于PKC蛋白的特征性下调，即这些位点的去磷酸化先于降解(汉斯拉等., 1999). 直接[³²P] 正磷酸盐标记也提供了类似的证据，尽管PKCα中没有明确的位点(李等., 1996). 导致去磷酸化和降解的途径现在才刚刚出现，这里不再进一步考虑。

n/aPKC磷酸化

确实与启动磷酸化有一定的相关性，这在一定程度上源于n/aPKC异构体中的等效“启动”位点被纯化的重组真核表达蛋白和完整细胞所占据的发现(汉斯拉等., 1999;帕雷克等., 1999;齐格勒等., 1999). 然而，这与图中的总体方案是否​图22对于n/aPKC等型是有用的。到目前为止，对n/aPKC同种型中的“启动”磷酸化位点只进行了有限的研究，但已经有信息表明存在相似性和差异性。

当PKCδ在细菌中表达时，激活环（T505）和C-末端疏水性（S660）位点被非磷酸化；然而，它保留了催化活性。对T505A突变体的研究提供了活性不需要活化环位点磷酸化的证据(斯坦普卡等., 1997). 这种行为与PKCα相反，PKCα在细菌中的表达不活跃。然而，已经观察到，这种细菌表达的T505/S662非磷酸化PKCδ蛋白的活性低于真核表达PKCδ的十分之一(勒古德等., 1998). 有趣的是，这种低活性形式的PKCδ在自磷酸化位点进行自磷酸化（S643）(勒古德等., 1998). 这与已通过突变直接验证的自身磷酸化位点的分配一致(锂等., 1997). PKCδ的细菌表达物种的活性降低与等价磷酸化PKCβ的全部活性形成对比_二物种（参见牛顿，1997). 这可能反映了新型和经典同型之间的一些细微差别。PKCδ和PKCα之间的这种区别反映在发现PKCδS643A突变体与等效的S638A PKCα突变体不同，不显示热不稳定性，但活性降低(锂等., 1997). PKCβ是否如所述仍有待观察_二，局部补偿性磷酸化有助于PKCδS643A突变体的稳定性；两个近端丝氨酸残基可能是候选的。虽然PKCδ似乎能够在S643位点上自动磷酸化，但S662疏水位点并未被细菌PKCδ占据，这表明这不是一个自动磷酸化位点（见下文）。总的来说，PKCδ的这种行为模式与可以从PKCα模型中推断出的相似，只是在“基础状态”下，去磷酸PKCδ似乎折叠正确、可溶且部分（尽管为10%）活性。

对于非典型PKC异构体，C末端疏水位点在保留特征芳香残基的同时具有谷氨酸残基（FXXFE类F） 取代其他PKC同型中发现的丝氨酸或苏氨酸残基。PKCα的这种突变部分替代了磷酸化；T657E PKCα突变体对磷酸酶、氧化剂和热变性表现出中等敏感性(Bornancin和Parker，1997年). 可以推测，对于aPKC异构体，在这个保守的疏水区域中没有磷酸化，但这些异构体可能比c/nPKC异构体能更有效地去磷酸化（见下文）。

这些启动位点在cPKC、nPKC和aPKC等型中的占据以及激酶结构域的相似性表明，归因于这些位点的一般性质可能是保守的。这一点的正式证明将来自于进一步的定点突变、重组和结构分析。如上所述，PKC家族中这些磷酸化位点/基序的保护延伸到AGC类的其他激酶。这包括PKC相关激酶（PRK1/PKN，PRK2和PKNβ/PRK4），p90^rsk公司，第70页^S6激酶和PKB（也称为Akt）（其中一些激酶结构域在图中对齐​图3）。三). 其中最容易理解，也可能最简单的是PKB。有直接证据表明PKBα活化环位点（T308）和C末端疏水位点（T473）被磷酸化，是活化所必需的体内(Alessi等人，1996年). 这种激动剂诱导的反应依赖于磷脂酰肌醇（PtdIns）3-激酶。突变表明T308和T473位点都以协同方式促进激活。然而，观察到了不成比例的影响(Stokoe等人，1997年)T473仍有可能部分促进PKCα的稳定性(Bornancin和Parker，1997年). 对于PKB，已经鉴定出对PtdIn（3，4，5）P有需求的激活环激酶（PDK1和相关活性）_三与完整细胞中激活环磷酸化的PtdIns 3-激酶抑制剂敏感性一致(Alessi等人，1997年;Stephens等人，1998年)【PDK1被鉴定为PKB激活环（T308）激酶导致了对T473激酶使用PDK2命名法。然而，由于可能存在多种PDK1相关的T308激酶活性，该命名法最好用于任何哺乳动物PDK1亲属和正式鉴定时命名的T473酶。】PKB控制的简化视图是PtdIns（3,4,5）P_三-PDK1和第二个PKB激酶/组分（见下文）的依赖性膜募集导致完全磷酸化和活化。

在单独的窗口中打开

图3。AGC激酶结构域比对。PKCα/δ/ζ、PKC相关激酶PRK1、PKBα和p70的激酶结构域^S6激酶α（p70α）从其第一个保守激酶亚结构域（I）通过X亚结构域排列到覆盖C末端延伸的区域。激酶亚结构域由阴影区域表示，区域I–X以越来越深的色调显示。文中讨论的三个磷酸化位点（或酸性残基）用红色条表示。激活环由深紫色块表示，疏水性C末端磷酸化位点也用深紫色框起来。

p70的激酶结构域^S6激酶除了扩展的C末端结构域上的其他位点外，对同一类磷酸化位点的激活也有类似的依赖性（参见普伦和托马斯，1997年). 在这种情况下，疏水部位（T389）对免疫抑制剂雷帕霉素特别敏感；激活环位置的灵敏度要低得多(法拉利等., 1993). 而其他站点对p70有贡献^S6激酶对照组，很明显，关键的激动剂诱导的活化磷酸化也是PKC中保守的。

激酶级联到PKC激活环磷酸化

这类激酶中的各种保守性因素导致了PDK1或其近亲负责PKC激活环磷酸化的发现。PDK1将磷酸化nPKCδ和aPKCζ在体外(周等人，1998年;Le Good等人，1998年). 哺乳动物细胞中PDK1与PKCδ/ζ的共表达也可以诱导激活环部位的PKC磷酸化。在完整的细胞中，PDK1的作用被PtdIns 3-激酶抑制剂LY294002阻断，并且这种作用似乎是通过PDK1而不是PKC来实现的(Le Good等人，1998年). 与此一致，PtdIns（3,4,5）P_三与PKC激活剂TPA协同刺激PKCδ的PDK1磷酸化在体外证据表明，PDK1和PKC需要通过与各自的变构激活剂相互作用而被共同招募到细胞膜上，以便磷酸化有效。

所有PKC同型亚类都可以与PDK1形成复合物，这一发现支持了PDK1或其亲属在PKC磷酸化中的广泛作用(Le Good等人，1998年). PDK1本身是否负责所有PKC激活环磷酸化体内尽管最近的观察表明PDK1在cPKC磷酸化中的作用，但仍有待确定体内(Dutil等人，1998年). 也许PDK1生理作用的最令人信服的证据，尽管是间接的，来自对PRK蛋白的研究。这些后一类激酶被Rho类小G蛋白通过N末端HR1结构域的相互作用调节(Shibata等人，1996年;Flynn等人，1998年). 据报道，Rho结合导致活性增加（高达4倍）在体外因此，有人提出，这种效应是HR1结构域结合和隔离的结果，其中存在假底物位点(Shibata等人，1996年). 研究发现，PRK也通过其PIF与PDK1相互作用(P（P）丹麦1-我相互作用（f）碎片）区域(Balendran等人，1999年)它们的激活环被这种激酶磷酸化(Flynn等人，2000年). 然而，这种影响与Rho的控制密切相关。PRK1/2和PDK1之间的相互作用表现出对活性Rho的依赖性。因此，Rho与PRK1/2的结合导致PDK1结合允许的构象变化。据推测，激活环中PRK1/2的后续磷酸化是PRK自身的关键激活事件(Flynn等人，2000年). 这种关系的更直接证据来自研究体内发现RhoB将PRK1/2招募到内胚体室(Mellor等人，1998年). 我们发现，PDK1也被RhoB招募到这个隔间，但仅当PRK1共同表达时。因此，RhoB、PRK1和PDK1之间可以形成异源三聚体络合物体内（如图所示​图4）。4). 此外，已经表明RhoB募集到内体区室的PRK处于过度磷酸化状态(Mellor等人，1998年)与相关PDK1在执行该磷酸化的一部分中的作用一致。

在单独的窗口中打开

图4。通过PDK1激活依赖Rho的PRK。在未连接状态下，PRK显示为非活性构象，HR1结构域中的假底物位点与催化结构域相互作用。当Rho与膜室中的HR1基序结合时，激酶结构域被释放，可以表达催化活性，尽管水平较低。暴露的激酶结构域可以通过其PIF基序（见正文）与PDK1相互作用，并与PtdIns（3,4,5）P结合_三，PDK1将磷酸化并激活PRK。图中总结了所示的结构域。

PKC和PRK在PDK1磷酸化方面的行为具有明显的对称性，这两类蛋白的最佳磷酸化取决于其特殊的、膜相关的变构激活剂。这种行为模式同样适用于具有PH域依赖性磷脂结合的PKB。假设PDK1需要其自身的激活剂PtdIn（3，4，5）P_三有效的催化活性；这与完整细胞中PKC活化环磷酸化对PtdIns 3-激酶的依赖性一致(周等人，1998年;Le Good等人，1998年). 对于PKC，有直接体内有证据表明需要激活靶激酶（即PKC），因为钙磷蛋白C选择性地阻止DAG对PKC的变构活化，抑制血清诱导的活化环磷酸化，PtdIns 3-激酶抑制剂LY294002也会影响PDK1的募集/活化(Parekh等人，1999年).

这些研究得出的广泛结论是，存在一系列涉及PtdIns 3-激酶、PDK1和PKC超家族各成员的激酶。功能的特异性至少部分由效应器/第二信使与靶激酶的相互作用驱动。对于PKC，磷酸化的结果是潜在催化活性的增加，而不会绕过变构活化剂的要求。

PKC C末端结构域的转磷酸化

检测到一种磷酸化PKCαV5结构域中疏水性C末端位点的膜相关活性，如果用雷帕霉素或PtdIns 3-激酶抑制剂LY294002预处理细胞，则其在膜部分中的存在/活性会受到影响(齐格勒等人，1999年). 与该活性在PKC磷酸化中的作用一致体内这些抑制剂还可以阻止完整细胞中PKCδ和PKCɛ中等效疏水位点的血清刺激磷酸化。纯化磷酸化PKC中C末端疏水基序的膜相关激酶，已将非典型PKCζ/Ⅰ鉴定为复合物的成分。与aPKC的作用一致的是，在缺乏血清的细胞中，活化形式的PKCζ的表达可诱导共同表达的PKCδ的磷酸化。这种磷酸化不受雷帕霉素的抑制，表明过表达的活性PKCζ克服了正常的血清依赖性控制层次。然而，在活化的PKCζ存在的情况下，PKCδC末端磷酸化的程度可以在血清刺激下进一步增加；这也是雷帕霉素不敏感的，表明血清依赖性步骤可能是PKCδ导向的（例如通过激动剂诱导的DAG生成）。这让人想起PDK1的情况，PKC导向的变构相互作用支持磷酸化。对雷帕霉素和LY294002的敏感性表明mTOR在控制这种磷酸化中起作用。事实上，已有研究表明，雷帕霉素耐药mTOR可减轻疏水位点PKCδ（和ɛ）磷酸化途径对雷帕霉素的敏感性(Parekh等人，1999年). mTOR和PKC磷酸化之间的元素是否涉及激酶、磷酸酶或两者都有尚待阐明。然而，基于N端截断p70的行为^S6激酶突变体(Mahalingam和Templeton，1996年)，最简单的模型是mTOR控制作用于PKC位点的磷酸酶。活化的aPKCζ突变体的过度表达必须足以促进该位点的磷酸化，尽管雷帕霉素通过mTOR抑制减轻了磷酸酶抑制（见图​图5，5，见下文）。

在单独的窗口中打开

图5。PKC控件的一般方案。该图说明了生成“成熟”磷酸化形式所需的PKC膜募集和磷酸化的上游输入。为了清晰起见，这是一个简化的过程观点，排除了可能在定位和膜靶向中发挥作用的PKC相互作用蛋白的作用。其中包括一些可以阻断输入通路中特定步骤的抑制剂（红色），以及预测在影响修饰中起关键作用的激酶和磷酸酶（未定义）。已知外部影响控制许多这些步骤，包括激活PtdIns-PLC、PtdIns-3-激酶和mTOR。aPKC复合体（？）的输入尚未定义。

研究表明，血清诱导p70磷酸化^S6激酶雷帕霉素敏感的T389位点对氨基酸饥饿敏感。对PKCδ的类似研究表明，在氨基酸剥夺条件下，等效疏水C末端位点的急性血清诱导磷酸化也受到抑制(帕雷克等., 1999). 因此，哺乳动物细胞中存在一种氨基酸感应途径，可能通过mTOR来控制多种细胞激酶的磷酸化。

PKC磷酸化及其意义

对PKC及其相关物的所有不同实验数据的综合提供了作用于PKC的控件的可测试模型（图​（图5）。5). 当然，这个模型中的元素仍然未知，而且这很可能过于简单化。然而，它确实提供了一个基础，在此基础上可以对控制因素进行精确的分子描述。

从作用于c/nPKC异构体的控制模式中得出了一些有趣的启示。关于“启动”磷酸化本身，毫无疑问，至少结合起来这些起到了振幅控制的作用，即当在这三个启动位点磷酸化时，PKC比未磷酸化时具有更高的比活性（后者的活性可能较低或检测不到）。因此，DAG（+Ca²⁺)将剧烈地打开这些传感器（c/nPKC等型），但容量控制是磷酸化的功能。虽然变构效应器和磷酸化之间存在这种区别，但PKC的证据是磷酸化有效发生体内当PKC处于活性构象，即效应器结合构象时。这与PKB的行为类似，PKB通过其调节PH域与磷脂酰肌醇相互作用，允许PDK1对PKB进行磷酸化(Alessi等人，1997年,1998;Stephens等人，1998年). 外推到p70^S6激酶，可能与（N末端）和/或（C末端）该激酶的磷酸化相互作用也是PDK1实现最佳磷酸化所必需的；在体外，PDK1对截短的蛋白质进行了有效的磷酸化(Alessi等人，1998年;Pullen等人，1998年). 当然，对于PRK1/2，PDK1结合和磷酸化需要与其选择性调节因子Rho●GTP的相互作用(Flynn等人，2000年). 由于这些要求，PDK1特异性通过其靶点对其共因子/相关蛋白的依赖性被构建到系统中，即PDK1的磷酸化最少涉及PtdIns（3,4,5）P的同时检测_三在同一个隔室中加上一个特定的效应结合激酶。

PKC磷酸化控制与其AGC激酶家族亲属之间的相似性显而易见。然而，由于PKC与其他事件之间的根本区别，这些事件对PKC的重要性尚未被认识到。这种差异是暂时的，是人员流动的结果。与PKB不同，当PKC（n/cPKC）释放其激活物（DAG）时，其“启动”磷酸化不会迅速丢失。相反，似乎PKC的非活性封闭构象实际上对磷酸酶具有相对抗性。对于PKC，它是变构活化形式，似乎是去磷酸化（和降解）的靶点(汉斯拉等., 1996,1999;李等., 1996). PKC这种行为的一个非常重要的结果是，磷酸化PKC同工酶的积累有助于随着时间的推移整合信息。要使nPKCδ和nPKCɛ在其启动位点磷酸化，显然必须满足至少四个标准：（i）必须提供DAG；（ii）足够的PtdIn（3,4,5）P_三必须存在以募集/激活PDK1；（iii）必须正确定位/激活PKCζ及其合作伙伴；和（iv）mTOR必须激活。由于磷酸化相对稳定，这些修饰所施加的振幅控制在数十分钟到数小时内保持不变。

为什么这样的系统会演变？一种可能的解释是，这些允许的幅度控制着细胞希望缓冲后果的感测事件。因此，例如，一个细胞暂时暴露在氨基酸缺失的环境中，可能会迅速停止新的蛋白质合成，但预计不会立即导致细胞凋亡。PKCα磷酸化可能起着重要的生存作用(惠兰和帕克，1998年)反映了这种保护策略。

在上述评论中，PKC磷酸化的影响主要与其固有的催化活性以及磷酸化和修饰其下游靶点作用的能力有关。这可能不是全部情况。关于PRK2–PDK1相互作用的证据是，在这种络合状态下，PDK1不仅能够作用于PKB的活化环位点，还能够作用于疏水性C末端位点(巴伦德兰等., 1999). 如前所述，这种络合物的作用可能反映在PKCζ络合物的行为中，该络合物将促进PKCδ中疏水性C末端位点的磷酸化。因此，由于所有测试的PKC同工酶都可以与PDK1形成复合物，因此任何一种此类复合物都可能负责PKB或相关AGC激酶的靶向。因此，FXXFSY基序内的c/nPKC磷酸化可能在促进这些激酶的PDK1支架特性方面发挥额外作用。如何将这种作用与固有催化功能结合起来是未来的一个关键问题。

工具书类