激酶活性和自噬诱导都需要Atg1激活环内的自磷酸化酿酒酵母

质粒结构：

使用Clontech Transformer试剂盒对自动液位计1-包含质粒pPHY1115和pPHY2376，以生成本文使用的变体（K54A、D211A、T226A和T226E）。质粒pPHY1115最初命名为pRS316-3xmycATG1，由Ohsumi博士慷慨提供。质粒pPHY2376是一种基于pRS423的结构，其中Atg1在其N末端有三个HA表位拷贝；该质粒最初由Daniel Klionsky博士提供。YFP–Atg1融合背景中的变体类似地以野生型质粒pPHY2297作为起始载体产生(B类乌多夫斯卡娅 等. 2005). 对于rAtg1变体，从适当的酵母质粒中PCR扩增编码残基1-420的片段，并克隆到pET21a表达载体中。质粒pPHY2427在铜诱导的启动子的控制下编码了一个HA表位标记的Atg13版本CUP1大学基因。这个ATG13公司该位点是从野田武史博士善意提供的质粒pRS316-ATG13中克隆的。进行定点突变以插入圣诞节我紧跟着的起始密码子ATG13公司. TheATG13公司编码序列和转录终止子被克隆为3.1kb圣诞节我–不是我分裂成pPHY2203形成pPHY2427。pPHY2203质粒如前所述，包含CUP1大学启动子和HA表位(D类埃米诺夫 等. 2006).

蛋白质印迹和免疫沉淀：

按说明制备蛋白质样品进行蛋白质印迹(B类乌多夫斯卡娅 等. 2005). 蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到硝化纤维素膜上，并用适当的一级和二级抗体对膜进行探测。随后使用超信号化学发光底物（皮尔斯化学公司，伊利诺伊州罗克福德）或奥德赛红外成像系统（LI-COR生物科学公司）检测反应带或荧光强度。按照说明进行免疫沉淀(B类乌多夫斯卡娅 等. 2005;D类埃米诺夫 等2009年). HA标记的蛋白质通常沉淀在抗HA基质珠（Roche）上，而myc标记的蛋白质用单克隆抗myc抗体进行免疫沉淀，然后收集在蛋白a–Sepharose（GE Healthcare）上(B类乌多夫斯卡娅 等. 2005;D类埃米诺夫 等. 2006). 免疫沉淀蛋白和免疫共沉淀蛋白的数量随后用适当的抗体通过Western免疫印迹法进行评估。为了评估Atg1内T226位的磷酸化，在兔子体内产生了一种针对磷酸化肽FLPNTSLAE（pT）LCGSPLY的多克隆抗血清，该磷酸化肽对应于Atg1激活环的序列（参见图1A). 肽合成、抗体生成和纯化由Lampire生物实验室完成。用这种抗体进行的蛋白质印迹通常用来自2μ质粒的过表达Atg1的细胞进行。

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F类鬣蜥1.—

激活环内的T226是Atg1自动磷酸化的位点。（A） 显示了所示生物体Atg1同源基因的激活环序列。所有正交曲线中相同的残留物显示在黑色背景上，化学相似的残留品显示在灰色背景上。T226残基由星号表示，顶部的条表示用于生成磷酸特异性抗体的肽。Hs、，智人（B）雷帕霉素处理后，Atg1激活环T226位置的磷酸化增加。请注意，Atg1^T226A型和附件1^T226E型抗T226P磷酸特异性抗体不能识别变异。在B–E中，用针对所示表位的抗体从细胞提取物中免疫沉淀所示Atg1蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离，然后用所示抗体进行蛋白质印迹分析。细胞提取物由对数期（L）或雷帕霉素处理（R）培养物制备。蛋白质信号通过化学发光照射后的放射自显影进行评估。（C和D）T226-P磷酸特异性抗体对Atg1的识别在磷酸酶处理后丢失，并且在含有激酶缺陷型Atg1变体的细胞中缺失。如有指示，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之前，用λ磷酸酶（PPase）处理沉淀的Atg1蛋白。K54A和D211A是指Atg1的激酶缺陷变体。（E） T226磷酸化信号在在体外激酶分析。从用雷帕霉素处理过的酵母细胞中沉淀出所示的Atg1蛋白，并用磷酸特异性抗体通过Western blotting评估T226磷酸化的相对水平。如有指示，用λ磷酸酶（PPase）处理沉淀的Atg1蛋白，然后用在体外激酶自动磷酸化试验（IVKA）。

体外激酶分析（IVKA）：

免疫沉淀的Atg1蛋白或纯化的重组Atg1片段在30°和10μCi[γ-³²P] 40μl反应中的ATP（50 m米磷酸钾，5 m米氟化钠，10米米氯化镁_2,4.5米米DTT、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），含或不含10μg髓磷脂碱性蛋白（MBP）（西格玛，圣路易斯）。反应产物在SDS–聚丙烯酰胺凝胶上分离，凝胶固定、干燥，并通过放射自显影或使用Typhoon Trio（GE Healthcare）的磷光成像进行分析。

重组蛋白纯化：

大肠杆菌细胞生长到OD₆₀₀约0.5/ml，IPTG添加至最终浓度1m米诱导rAtg1蛋白的表达。进行诱导4小时。通过离心收集细胞，并在裂解缓冲液（50 m米磷酸钠，500米米NaCl和蛋白酶抑制剂）。然后将澄清的细胞裂解液与1 ml Ni–NTA琼脂糖珠（Qiagen）在4°下培养过夜。通过离心收集珠子，并用含有20 m的PBS洗涤三次米咪唑，用含有250 m的PBS洗脱重组蛋白米咪唑。

自噬分析：

自噬活性通过之前描述的几种不同的分析进行评估。一般来说，用200 ng/ml雷帕霉素处理中期对数期细胞，达到指定的时间，即可诱导自噬。基于碱性磷酸酶（ALP）的分析测量了改变形式的Pho8碱性磷酸酶，即Pho8Δ60在液泡中的传递和随后的激活(N个oda公司 等. 1995;N个oda公司和K莱昂斯基2008). 自噬的相对水平由对数期细胞提取物和雷帕霉素处理细胞提取物之间检测到的碱性磷酸酶活性的差异表示。所提供的数据代表了至少三个独立实验的平均值，其中自噬水平在不同实验重复之间的变化通常小于15%。在GFP–Atg8分析中，液泡中蛋白质水解产生的游离GFP的相对水平被用作自噬活性的指标(秒辛塔尼语和K莱昂斯基2004). 用抗GFP抗体免疫印迹法检测GFP–Atg8融合蛋白和游离GFP。最后的分析评估了通过自噬途径发生的过表达氨肽酶I或Ape1的处理(B类乌多夫斯卡娅 等. 2004). 在这个实验中，细胞表达Ape1的水平达到了胞质-空泡或Cvt转运系统的饱和水平。先前的研究表明，这些细胞中的前体Ape1蛋白在雷帕霉素治疗或氮饥饿后通过自噬途径进行处理(B类乌多夫斯卡娅 等. 2004). 用Daniel Klonsky博士提供的抗Ape1抗体通过Western blotting检测Ape1蛋白。

Atg1蛋白激酶活性需要活化环内T226位置的磷酸化：

为了评估活化环磷酸化对Atg1功能的重要性，我们将T226替换为不可磷酸化的丙氨酸残基，并评估了Atg1激酶的活性体内和在体外. The在体外检测了Atg1自身磷酸化和非生理底物MBP的磷酸化(M（M）atsuura公司 等. 1997;K（K）阿玛达 等. 2000). 在每种情况下，检测的Atg1蛋白都是从雷帕霉素处理的细胞中沉淀出来的。我们发现这个Atg1^T226A型在这两种检测中，与野生型酶相比，变异体的活性显著降低(图2，A–D). Atg1和Atg1的两种激酶缺陷型^K54A公司和附件1^D211A型，在这些实验中用作阴性对照，与Atg1相关的激酶活性水平^T226A型与用这些对照蛋白观察到的相似。我们还发现，沉淀的Atg1与ATP的预孵育导致MBP激酶活性升高(图2C). 这种刺激需要激酶结构域的存在，并表明Atg1自身磷酸化可能会增加这种酶的比活性(支持信息,图S1、A和B）。这种自磷酸化可能发生在Atg1蛋白的T226和/或其他位置。

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F类鬣蜥2.—

蛋白激酶活性需要在Atg1激活环中存在T226。Wt，野生型。（A） 用不可磷酸化的残留物替换T226导致Atg1自动磷酸化缺失。从雷帕霉素处理的细胞中免疫沉淀出具有所示改变的Atg1蛋白，并将其置于在体外如材料 和 方法.附件1^K54A公司和附件1^D211A型变异为激酶缺陷对照。在A和B中，Atg1蛋白在N末端用myc表位的三个拷贝进行标记。（B） A.（C）An中所示磷光体成像仪数据的量化在体外用MBP作为底物，用从雷帕霉素处理的细胞中分离出的指示Atg1蛋白进行激酶分析。在两条右侧通道中，免疫沉淀野生型Atg1蛋白，并在30°C（+）下模拟处理（−）或用3 mM ATP预孵育60分钟。随后对样品进行清洗，以去除多余的ATP和在体外用[γ]进行激酶测定-³²P] ATP和MBP。（D） C中磷光成像仪分析数据的量化。

评估Atg1激酶活性体内，我们利用了先前的观察结果，表明Atg1自身磷酸化导致在SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Atg1-P图3A) (K（K）阿玛达 等. 2000;B类乌多夫斯卡娅 等. 2005;秒铁山 等2009年). 我们的数据表明，导致这种转变的自磷酸化位点不同于T226（见下文和我们未发表的观察结果）。第二个上带的相对水平可以用来测量细胞中存在的Atg1激酶活性(秒铁山 等. 2009). 与在体外上述数据表明，我们发现Atg1^T226A型与野生型相比，雷帕霉素治疗或氮饥饿后迁移速度较慢的变异，这两种情况都会诱导自噬反应(图3，A和B). Atg1的相对活性^t226年变体再次类似于激酶缺陷对照，Atg1^K54A公司和附件1^D211A型有趣的是，我们发现α-T226P抗体在Western blot上特异性识别这种缓慢迁移的Atg1形式(图3、B和C). 总之，这些数据表明激活环内的T226磷酸化是Atg1激酶活性所必需的，并且与在经历自噬的细胞中特异性发现的Atg1的自磷酸化形式有关。

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F类鬣蜥3.—

Atg1^T226A型变异体在Atg1自动磷酸化中有缺陷体内（A）T226A改变的存在导致Atg1自身磷酸化缺失体内用对数期（L）或雷帕霉素处理（R）细胞制备的提取物进行蛋白质印迹。在底部，免疫沉淀野生型Atg1要么接受模拟治疗（IVKA−），要么接受在体外3 mM ATP（IVKA+）的自磷酸化反应。然后将后一份样品分成两份，进行模拟处理（PPase−）或与λ磷酸酶（PPase+）孵育。PPase，λ磷酸酶；IVKA、，在体外激酶分析；Atg1-P，Atg1的自磷酸化形式，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上表现出改变的流动性。（B） Atg1活化环磷酸化在氮饥饿时升高，需要存在功能性Atg1激酶结构域。在B和C中，用针对所示表位的抗体从细胞提取物中免疫沉淀所示Atg1蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离，然后用所示抗体进行蛋白质印迹分析。细胞提取物由对数期（L）、雷帕霉素处理（R）或缺氮（N）培养物制备。用LI-COR Odessey红外检测系统检测蛋白质信号。对于氮饥饿，将对数期细胞转移到SD-N培养基中6小时。D211A是Atg1的激酶缺陷型变体。（C） 抗T226P磷酸化特异性抗体（α-T226P）识别出雷帕霉素治疗后出现的缓慢迁移的自身磷酸化形式的Atg1。用LI-COR Odessey红外检测系统检测蛋白质信号，右侧显示α-myc和α-T226P信号的合并图像。

诱导自噬需要活化环磷酸化：

我们使用了三种不同的实验来测试Atg1激活环内的磷酸化是否是诱导自噬所必需的。第一次评估了一种被称为Pho8Δ60的改变形式的Pho8碱性磷酸酶的液泡递送和加工(N个oda公司 等. 1995). 这种截短的蛋白质缺乏跨膜结构域和通过分泌途径正常传递所需的靶向信息(K（K）莱昂斯基和E先生1989;N个oda公司 等. 1995). 因此，这种蛋白质只能通过自噬途径传递到液泡并在液泡中被激活。通过该试验，我们发现在仅携带Atg1的细胞中没有检测到明显的自噬活性^t226年变体(图4A). 检测到的自噬水平与atg1处Δ控制应变。

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F类鬣蜥4.—

Atg1^T226A型变异体有自噬缺陷。（A） 自噬活性通过基于ALP Pho8Δ60的分析进行评估atg1处表达所示Atg1蛋白的Δ菌株。这个atg1处Δ对照菌株含有载体质粒。从用200 ng/ml雷帕霉素处理0（Log）或4小时（Rap）的细胞中制备提取物。所示数据是两个独立实验的平均值，其中获得的值在重复之间的变化小于15%。（B） 使用GFP–Atg8处理分析评估自噬活性，如材料 和 方法游离GFP水平是存在相对自噬活性的指标。（C） 自噬活性通过测量过表达Ape1的空泡处理的分析进行评估，如材料 和 方法成熟加工的Ape1蛋白（mApe1）的存在是自噬活性的指示物。前Ape1，前体Ape1。底部显示了不同myc标记的Atg1蛋白的相对水平。对于B和C，在指定的时间内用200 ng/ml雷帕霉素处理细胞。

第二次实验测量了GFP–Atg8融合蛋白的处理(秒辛塔尼语和K莱昂斯基2004). Atg8通常并入自噬体并输送至空泡腔(K（K）感应电动机 等. 2001;秒乌兹基语 等. 2001;秒乌兹基语和Ohsumi公司2007). 然后Atg8被液泡水解酶降解，从而释放出更稳定的GFP蛋白(秒辛塔尼语和K莱昂斯基2004). 游离GFP的相对水平可以用来衡量存在的自噬活性。与基于ALP的分析一样，在含有Atg1的细胞中未检测到GFP–Atg8融合的显著处理^T226A型变体(图4B). GFP荧光亚细胞定位检测证实了这种自噬缺陷。在野生型细胞中，GFP–Atg8融合物被输送到液泡中，游离的GFP在该细胞器的管腔内积累(图5). 相反，在自噬缺陷突变体的液泡中检测到的GFP荧光非常少（如果有的话）（见atg1处Δ英寸图4) (秒乌兹基语 等. 2001). 与上述加工缺陷相一致，我们在细胞液泡中未发现明显的GFP荧光atg1处Δ携带Atg1的细胞^T226A型变体(图5). 值得注意的是，GFP–Atg8融合通常局限于这些细胞中的PAS(图5).

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F类鬣蜥5.—

在含有Atg1的细胞中，GFP-Atg8融合蛋白没有传递到液泡^T226A型变体。携带所示Atg1蛋白的酵母菌株用200 ng/ml雷帕霉素处理2小时，然后通过荧光显微镜评估GFP–Atg8融合蛋白的亚细胞定位。Atg8通常并入自噬体并运输到液泡室。这种转运导致具有功能性自噬途径的细胞液泡中出现GFP荧光。底部一行中显示的代表性细胞的液泡由白色箭头表示。请注意，在含有Atg1的细胞中，在PAS处仍发现GFP–Atg8融合^T226A型变体。

最后，我们评估了Ape1蛋白的自噬依赖性成熟。Ape1是细胞质到液泡（Cvt）转运途径的正常载体，在对数期生长期间负责向液泡输送一组蛋白质(K（K）莱昂斯基 等. 1992;K（K）半人和K莱昂斯基2002). Ape1的过度表达使Cvt系统饱和，导致该蛋白未经处理的前体形式的细胞质积累（参见图4C) (K（K）狮子座 等. 1992). 在诱导自噬后，这种蛋白质被有效地传递到液泡并加工成成熟的活性形式(秒棉花 等. 1996;B类乌多夫斯卡娅 等. 2004). 我们发现Atg1^T226A型变体在这种自噬介导的过程中是有缺陷的，并且Ape1蛋白仅以其前体形式存在于这些细胞中(图4C). 总之，这些数据表明，T226的Atg1自磷酸化对于诱导小鼠的自噬途径是必要的酿酒酵母.

Atg1^T226E型变异体表现出结构性的自磷酸化活性：

为了测试T226磷酸化的存在是否足以实现Atg1的自动磷酸化，我们用潜在的拟磷酸残基、谷氨酸和天冬氨酸取代了这个位置。两种替换都获得了类似的结果，我们在这里主要关注Atg1^T226E型变体。有趣的是，我们发现这个Atg1^T226E型变异体能够进行自身磷酸化在体外当从雷帕霉素处理的细胞中分离出来时(图S2，A）。然而，与野生型蛋白不同，Atg1^T226E型在通常不进行自噬的对数期细胞中，也表现出较高的自噬水平。在这两种细胞中都观察到这种构成性的或不受调控的自磷酸化活性在体外和体内化验(图6，A–C). 例如，在在体外检测结果显示，相对于野生型蛋白质，放射性水平升高，被纳入Atg1^T226E型从对数期细胞中分离出的变体(图6A). 此外，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上发现的缓慢迁移形式的这种变体的比例在对数期细胞提取物中升高(图6、B和C). 在这两种检测中，Atg1的自磷酸化总水平略有升高^T226E型变体。这些体内Atg1的结果^t226电子该蛋白支持上述论点，即Atg1慢迁移形式的存在是由于在一个不同于T226的位点上的自磷酸化。特别是，我们发现与Atg1相关的上带^T226E型蛋白质在磷酸酶处理后丢失，并在随后与ATP孵育中再生(图6D和图S2，B）。

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F类鬣蜥6-

Atg1^t226电子变异体是一种组成活性蛋白激酶。（A） Atg1^T226E型该变异体在对数期细胞提取物中表现出较高的蛋白激酶活性。从对数期（log）或雷帕霉素处理（Rap）细胞中免疫沉淀Atg1，并用在体外[γ]自磷酸化测定-³²P] ATP。T、 野生型Atg1；E、 附件1^T226E型变体。顶部是放射自显影图像，底部是用抗myc抗体进行的Western blot控制。对于A–D，用myc表位的三个拷贝标记Atg1蛋白。（B） 附件1^T226E型表现出结构性的自动磷酸化体内用从对数期（L）或雷帕霉素处理（R）培养物中制备的提取物进行蛋白质印迹atg1处Δ带有指示Atg1蛋白的菌株。（C） Atg1缓慢迁移形式的相对级别^T226E型对数期细胞中变异性升高。用制备自atg1处携带所示Atg1蛋白的Δ细胞。（D） Atg1的缓慢迁移形式是在不同于T226的位置发生自磷酸化的结果。野生型Atg1和Atg1^T226E型从雷帕霉素处理的细胞中免疫沉淀蛋白质，并与λ磷酸酶孵育。然后将样品分成两份，用反应缓冲液模拟处理或用3mM ATP孵育。PPase，λ磷酸酶；IVKA、，在体外激酶分析。

最后，我们发现Atg1的重组片段在大肠杆菌（rAtg1）也能催化自磷酸化反应(图7). 该片段包含野生型蛋白的残基1-420，并包含位于Atg1 N末端的整个蛋白激酶结构域。这种自磷酸化也依赖于T226的存在，因为用丙氨酸残基取代这个位置会导致活性显著降低(图7). 此rAtg1^t226年变体在以MBP为底物的测定中也表现出活性降低(图S3). 相反，用谷氨酸取代T226的重组蛋白能够进行显著的自身磷酸化(图7). 该结果与上述野生型蛋白的结果相似，这些观察结果共同表明，T226位的磷酸化对Atg1的自动磷酸化很重要。此外，在226位存在磷酸类似物似乎扰乱了Atg1的正常控制，并导致构成性的自动磷酸化。

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F类鬣蜥7.—

重组Atg1蛋白的自磷酸化需要T226位的存在，即活化环磷酸化的位点。（A） 含有残基1–420的Atg1重组片段从大肠杆菌细胞提取物并与[γ]孵育-³²P] ATP评估自身磷酸化在体外。然后用荧光成像仪评估标签掺入的相对水平，该分析的图像显示在顶部。底部显示用His特异性抗体进行的Western blot控制₆-标签存在于这些重组蛋白上。（B） 磷光成像仪分析的量化如A所示。

Atg1^T226E型变异体没有自噬功能：

我们还测试了Atg1^T226E型和附件1^T226D型变异体具有自噬功能。使用上述三种加工分析，我们发现在atg1处携带这些变体的Δ细胞(图8，A–C). 此外，我们发现GFP–Atg8融合蛋白不能有效地运输到空泡腔中atg1–T226E单元格(图8D). 后者的缺陷与正常自噬过程的失败一致。因此，尽管这些变体表现出组成型自磷酸化活性，但它们都不能在自噬过程中取代野生型蛋白。这些变体在对数期细胞中也不能诱导自噬，当在野生型细胞中过度表达时，对自噬几乎没有不利影响(图8A和图S4). 自噬缺陷似乎不仅仅是由于Atg1的严重折叠错误所致^T226E型该蛋白在酵母细胞中以正常稳定水平存在，正常定位于PAS，并与Atg13和Atg17这两个Atg1激酶活性的关键调节因子相互作用(图9，A–C) (K（K）阿玛达 等. 2000;K（K）阿贝亚 等2005年). 然而，我们确实发现Atg1^T226E型在磷酸化非生理底物MBP方面，变异体的效果不如野生型蛋白在体外化验，化验(图9D). 因此，用这种变体观察到的自噬缺陷可能是由于未能磷酸化一种重要但尚不清楚的底物所致体内.

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F类鬣蜥8.—

Atg1^T226E型变异体有自噬缺陷。（A） 基于ALP的分析用于评估自噬活性atg1处表达所示Atg1蛋白的Δ菌株。从用200 ng/ml雷帕霉素处理0（Log）或4小时（Rap）的细胞中制备提取物。所示数据是两个独立实验的平均值，其中获得的值在重复之间的变化小于15%。这个atg1处Δ对照菌株含有载体质粒。（B和C）自噬活性通过GFP–Atg8（B）或Ape1（C）处理分析进行评估，如材料 和 方法在每种情况下，用200 ng/ml雷帕霉素处理菌株指定的时间（小时）。B、 底部显示了所检测的不同Atg1蛋白的相对水平。（D） 在只表达Atg1的细胞中，GFP–Atg8融合蛋白没有被传递到液泡^T226E型。通过荧光显微镜对GFP–Atg8融合蛋白的亚细胞定位进行了评估atg1处携带所示Atg1蛋白的Δ细胞。检查前用200 ng/ml雷帕霉素处理细胞2小时。注意，GFP–Atg8融合定位于含有Atg1的细胞中的PAS^T226E型变体。

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F类鬣蜥9.—

Atg1^t226电子变体定位于PAS并与Atg13和Atg17相互作用。（A） Atg1^T226A型和附件1^T226E型蛋白正常定位于PAS。YFP融合到所示Atg1蛋白的亚细胞定位在atg1处荧光显微镜下的Δ应变。Atg11–CFP融合蛋白被用作PAS的标记物。在检查之前，所有细胞都用200ng/ml雷帕霉素处理2小时。白色箭头表示PAS在各个单元格中的位置。（B） Atg1^T226E型变体与Atg17相互作用。从细胞提取物中沉淀出所示的HA标记的Atg1蛋白，并用抗myc抗体通过Western blotting评估相关Atg17蛋白的相对量。（C） Atg1^T226E型变体与Atg13相互作用。从细胞提取物中沉淀出HA标记的Atg13，并用抗myc抗体通过Western blotting评估相关Atg1蛋白的相对量+13，含有HA标记的Atg13蛋白的细胞+Vec，含有载体控制的细胞，因此缺乏标记的Atg13蛋白。（D） 安在体外以MBP为底物，用野生型Atg1和Atg1进行激酶分析^T226E型变体。显示的Atg1蛋白被免疫沉淀并与[γ]孵育-³²P] ATP和非生理底物MBP；每个样品重复进行。底部显示了Atg1蛋白在在体外反应。

我们感谢Daniel Klonsky、Yoshiaki Kamada、Takeshi Noda和Yoshinori Ohsumi在本研究中使用的试剂，感谢Yoshiki Kamada的有益讨论，感谢Venkat Gopalan、Mark Parthun和Herman实验室成员对手稿的评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（GM65227）对P.K.H.的资助。