介绍
广泛的信号调节雷帕霉素靶标（TOR）的活性以控制细胞生长。TOR存在于两个不同的复合物中1,2、TORC1和TORC2，它们共享mTOR和mLST8，并具有各自独特的亚单位。雷帕霉素直接抑制TORC1三，而TORC2不是4–6.TORC1通过促进蛋白质合成等合成代谢过程，积极调节细胞生长和细胞大小1,7并抑制分解代谢过程，如自噬8–10S6激酶和翻译因子4EBP1在TORC1激活时磷酸化，以介导TOR诱导的翻译调节11,12它们的磷酸化被用来评估TOR在体内的激活
TORC1由有丝分裂生长因子、细胞能量水平和氨基酸调节1,2生长因子和能量水平调节TORC1的机制已被描述。例如，生长因子通过PI3K、Akt、TSC1/TSC2和Rheb部分激活TORC113–15是Ras家族的一种小GTPase，直接结合并刺激TORC1活性16–18.氨基酸是TORC1的有效激活剂19然而，氨基酸对TORC1的激活机制尚不清楚。尽管研究表明VPS34 PI3激酶参与营养反应20,21，其在TORC1激活中的确切功能尚待确定。
Gtr1和Gtr2是酵母中Ras GTPase家族的独特成员22具有长的C末端延伸，这是Gtr1/Gtr2异二聚体形成所必需的23,24在酵母中，Gtr1/Gtr2在多功能蛋白质复合体中发挥作用，参与核转运调节、细胞内蛋白质运输、微自噬和摆脱雷帕霉素诱导的生长停滞22,24–26RagA和RagB是Gtr1的哺乳动物同源物，而RagC和RagD是Gtr2的相应同源物27,28虽然Rag家族GTPase的生理功能基本上未知，但RagA和RagB可以与RagC和RagD形成异二聚体28Rag复合物可能在功能上与Ran相互作用以调节核转运22,29在这里，我们确定Rag GTPases是培养哺乳动物细胞和果蝇。我们的数据表明，Rag通过激活TORC1来响应氨基酸信号，从而促进细胞生长并抑制自噬。
结果
dRagA和dRagC是S6K磷酸化的阳性调节因子果蝇属S2电池
GTPase家族蛋白几乎参与细胞信号的各个方面。我们假设TORC1的氨基酸信号可能涉及GTPase。我们进行了132个带注释的RNA干扰（RNAi）筛选果蝇属GTP使用果蝇属S2细胞并寻找其沉默可阻止氨基酸诱导的S2细胞中dS6K磷酸化和迁移的GTPase(). CG11968和CG8707被确定为对氨基酸反应的dS6K磷酸化很重要(). 序列比较分析表明，CG11968与酵母Gtr1、哺乳动物RagA和RagB同源性最高，而CG8707与酵母Gtro2、哺乳动物Rag C和RagD同源，因此分别命名为dRag A和dRag C(). 与酵母细胞和哺乳动物细胞的结果一致，这些蛋白质以前被发现在大规模的双杂交筛选中相互作用30许多其他GTPase的敲除，如Rho家族成员，对dS6K磷酸化没有影响().
dRagA和dRagC是TORC1的新型激活剂果蝇属S2电池（a） dRagA和dRagC的敲除降低了dS6K磷酸化（T398）。
果蝇属用或不用每种表明的RNAi处理的S2细胞都是氨基酸（AA）饥饿1小时，然后AA刺激30分钟。用指示的抗体通过免疫印迹法测定dS6K的磷酸化和蛋白质水平。
（b） dAkt磷酸化不需要dRagA和dRagC。
果蝇属用或不用每种显示的RNAi处理S2细胞后，AA饥饿1小时，用AA刺激30分钟。用所示的适当抗体通过免疫印迹法测定dAkt的磷酸化和蛋白质水平。NC：阴性对照RNAi。
（c） dRagA和dRagC功能与TSC2和PTEN平行。如图所示，将dRagA或/和dRagC RNAi与dTSC2或dPTEN RNAi联合添加到S2细胞中。dTSC2或dPTEN RNAi治疗增加了pdS6K（T398），而这种增加受到dRagA或/和dRagC RNAi的影响。
Rheb也被隔离在我们的屏幕上。值得注意的是，与dRagA和dRagC相比，Rheb敲除可重复地导致更强的S6K磷酸化抑制()与Rheb是TORC1的直接激活剂的概念一致17,18敲除其他几种GTPase，如Rab5和Ran，也会降低dS6K磷酸化。然而，敲除Rab5和Ran也显著减少了细胞数量（数据未显示），表明这些GTPase对细胞增殖/凋亡的总体影响。因此，我们将工作重点放在Rag GTPases上。
已知氨基酸能刺激TORC1，但不能刺激TORC22事实上，氨基酸饥饿间接提高了TORC2的活性，因为氨基酸饥饿对S6K的失活会减轻对TORC2上的反馈抑制31,32(). 我们测试了dRag对一种TORC2底物dAkt磷酸化的影响。dRagA或dRagC的敲除导致dAkt磷酸化显著增加(). 这些数据与dRagA和dRagC在TORC1激活中发挥积极作用而不是TORC2激活的概念一致。
为了确定dRag与TOR信号通路成分之间的功能关系，我们将dTOR的两个负调控因子dTSC2和dPTEN与dRag联合进行敲除。正如预期的那样，dTSC2敲低增加了dS6K的磷酸化(). dRagA或dRagC的敲除削弱了TSC2敲除对dS6K磷酸化的影响(). 值得注意的是，当dTSC2也被敲除时，dRagA或dRagC的敲除并没有将dS6K磷酸化降低到基础水平以下。相反，即使dTSC2被敲除，dRheb敲除也消除了dS6K磷酸化（数据未显示）。在dRag和dPTEN之间观察到类似的结果(). 这些数据表明，RagA和RagC可能与PTEN和TSC2并行发挥作用，激活TORC1。
Rag GTPases调节哺乳动物TORC1
接下来我们研究了Rag GTPases在培养细胞中调节哺乳动物TORC1的功能。人类RagA与RagB具有90%以上的序列一致性，但与RagC和RagD只有25%的序列一致，而RagC与RagD具有87%的序列一致28构建了人RagA、B、C和D的野生型以及组成型活性和显性阴性突变体。体内RagA标记表明，野生型和RagA Q66L均含有较高水平的GTP，而RagA T21N结合的核苷酸较少(补充图S1). 我们发现Rag的表达，特别是组成活性的RagA Q66L和RagB Q99L，增加了共转染HA-S6K的磷酸化(). 相反，显性阴性RagA T21N和RagB T54N的表达降低了S6K磷酸化。显性负RagA和RagB表达对S6K的影响也很明显，如S6K迁移率的增加所示(). 另一方面，组成活性和显性阴性RagC或RagD的表达对S6K磷酸化的影响很小(). 令人惊讶的是，显性阴性突变体RagC S75N和RagD S76N降低了S6K迁移率()，表明磷酸化可能增加（见后面的结果）。
哺乳动物Rag GTPases调节TORC1活性（a） 组分活性RagA和RagB刺激S6K磷酸化。将200 ng的每种哺乳动物RagA、RagB、RagC或RagD构建物与HA-S6K（20 ng）共同转染到HEK293细胞中。还测试了它们相应的显性阴性突变体（RagA T21N、RagB T54N、Rag C S75N和RagD S76N）和组成活性突变体（拉格A Q66L、拉格B Q99L、拉格C Q120L和拉格D Q121L）。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。标记的分子量显示在右侧。
（b） 在调节S6K磷酸化方面，RagA比RagC起主导作用。200 ng每种显示的Rag构建物与20 ng HA-S6K共转染。转染中使用的不同Rag突变体显示在每条车道的顶部。
（c） Rag调节TORC1，但不调节TORC2活性。200 ng每种指定Rag构建物与20 ng HA-S6K、20 ng Myc-4EBP1或100 ng GST-AKT联合转染。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。
我们确认了RagA和RagC之间的物理相互作用（数据未显示）。进一步研究了S6K磷酸化中RagA和RagC之间的关系。如所示，RagA T21N主要抑制S6K磷酸化，而与共表达的RagC的核苷酸结合状态无关。此外，无论共同转染的RagC的核苷酸结合状态如何，RagA Q66L主要激活S6K磷酸化。值得注意的是，单独转染时，RagA T21N和RagC S75N的表达较差。然而，当它们与野生型或突变型RagC或RagA共同转染时，表达水平显著增加()，表明二聚体的形成稳定了不稳定的RagA和RagC的显性阴性突变体。
为了进一步研究Rag GTPases在mTORC1调控中的作用，我们测定了S6K位点T421/S424的磷酸化状态，该位点未被mTORC2直接磷酸化，以及4EBP1，mTORCl的另一直接底物。RagA T21N对S6K T421/S424磷酸化的降低程度不如T389。相反，RagAT21N完全阻断了4EBP1磷酸化（S65），也导致了联合转染的4EBP1s的迁移率发生了显著变化(). 另一方面，Rag对TORC2底物AKT（S473）磷酸化几乎没有影响33这些结果支持Rag GTPases特异性激活mTORC1而非mTORC2的观点。
Rag GTPases调节氨基酸反应
在正常培养基中，组成活性RagA对S6K磷酸化的刺激作用不显著(). 此前，我们还观察到，Rheb对S6K磷酸化的刺激在富培养基中并不显著，但在营养不良的条件下显著增强34因此，我们测试了氨基酸剥夺条件下的S6K磷酸化。组成活性RagA Q66L的共表达增加了S6K磷酸化，而野生型RagA或显性阴性RagA T21N没有(). 此外，RagA T21N和RagC Q120L的表达完全阻断了对氨基酸刺激的S6K磷酸化(). 令人惊讶的是，显性阴性RagC S75N而非组成活性RagC Q120L的表达可重复增加S6K磷酸化(). 尽管效果不那么显著，但鉴于RagC S75N的低表达，RagC S 75N引起的S6K激活实际上相当显著。在缺乏氨基酸的情况下，用20ng的RagA Q66L DNA转染可显著增加S6K磷酸化，这种作用持续了12小时以上(图S2a，数据未显示）。尽管表达水平较低，但RagA T21N的表达强烈阻断了氨基酸刺激(图S2a).
Rag GTPases参与氨基酸反应（a） 在没有AA的情况下，RagA Q66L和RagC S75N激活TORC1。将200 ng每种指定的Rag构建物与HA-S6K（20 ng）共同转染到HEK293细胞中。细胞在收获前被AA饥饿1小时。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。标记的分子量显示在右侧。
（b） RagA T21N和RagC Q120L在AA刺激下阻断S6K磷酸化。将200 ng pcDNA3或每个指示的Rag构建物与HA-S6K共同转染到HEK293细胞中。细胞被AA饥饿1小时（−AA），在收获前，要么留在AA饥饿培养基中，要么用含有AA的培养基刺激30分钟（+AA）。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。
（c） RagA T21N和RagC Q120L抑制胰岛素对S6K磷酸化的刺激。将200 ng pcDNA3或每个指示的Rag构建物与HA-S6K（20 ng）或GST-AKT（100 ng）共同转染到HeLa细胞中。如图所示，用适当的抗体通过免疫印迹法测定磷酸化和蛋白质水平。
我们测试了RagA Q66L能否克服渗透胁迫的抑制作用。如所示图S2b，渗透胁迫仍抑制RagA Q66L诱导的S6K磷酸化。我们发现RagA Q66L和RagA T21N均不影响AMPK磷酸化（数据未显示），不包括AMPK的参与。
在缺乏氨基酸的情况下，胰岛素刺激S6K的能力显著受损(图S3)8,19因此，我们研究了Rag对胰岛素信号传导的影响。RagA T21N和RagC Q120L的共同表达可有效降低胰岛素刺激S6K磷酸化的能力()，类似于在氨基酸饥饿条件下获得的结果(图S3). 相反，胰岛素诱导的AKT磷酸化不受Rag的影响(). 这些数据进一步支持了Rag GTPases可能特别参与氨基酸信号传导的概念。
Rag GTP酶调节细胞大小果蝇属
TOR信号在细胞和器官大小的调节中得到了很好的证实果蝇属35,36这使我们研究了dRagA和dRagC对细胞生长的贡献体内试验。dRagA野生型、组成性活性突变体dRagAQ61L和显性阴性突变体dLagA T16N分别在使用后驱动程序的后翼舱室中表达en-GAL4公司我们发现，与对照前房相比，组成活性dRagA Q61L而非野生型dRagB的表达显著增加了后房大小(). 相反，显性阴性dRagA T16N的表达降低了后翼室的大小。与这些结果一致，dRagA Q61L的表达增加了翅膀的单个细胞大小，而dRagA-T16N的表达减少了细胞大小(). 我们还利用背侧特异性在翅膀的背侧翼表面表达dRagAap-GAL4型如预测，dRagA Q61L或dRagA-T16N的表达分别导致机翼向下或向上弯曲(图S4a、b). 这些结果支持高活性dRagA促进细胞生长，而低活性dRag A抑制细胞生长。
dRagA和dRagC促进细胞和器官生长果蝇。（a） dRagA积极调节机翼隔间大小。野生型或突变型dRagA转基因在带有en-GAL4驱动因子的后腔室中表达。显示了具有代表性的前后室面积之比。dRagA Q61L表达导致后房室面积显著增加，dRagA-T16N表达导致后室面积减少。P值：*7.32e-04（n=7），**6.18e-04（n=12）；学生的双尾t检验，其中n代表分析的成年翅膀数量。
（b） dRagA正向调节翼细胞大小。显示了en-GAL4 UAS-dRagA成人翅膀后室细胞的平均面积。表达dRagA Q61L的细胞明显大于对照组，而表达dRag A T16N的细胞则小于对照组。P值：*1.15e-03（n=7），**0.025（n=12）；学生的双尾t检验，其中n代表分析的成年翅膀数量。
（c，d）dRag GTPases积极调节幼虫脂肪体细胞大小，（c） 克隆诱导表达dRagA细胞的细胞面积或dRagC公司显示了相对于邻近野生型控制细胞的纯合突变细胞。细胞面积是从喂食或48小时饥饿的幼虫的含卵磷脂的固定脂肪体样品中测定的。dRagA-WT或dRagA-Q61L的表达显著增加了饥饿条件下但非喂养条件下的相对细胞面积。dRagA T16N表达细胞和dRagC公司只有在营养充足的条件下，失去功能的细胞才明显小于对照细胞。结果以n个样本的平均值±标准偏差表示。P值：*2.04e0-3（n=5），**2.94e-06（n=14），**3.79e-07（n=19），****1.36e-0（n=30）5；学生双尾t检验。（d） 脂肪体细胞dRagA活性改变的典型例子。dRagA转基因表达细胞的标志是GFP在左两个面板中的表达dRagC公司纯合子突变细胞的标志是右侧面板中没有GFP。比例尺代表50μm。
这个果蝇属幼虫脂肪体参与TOR依赖的营养感应以及在发育过程中传递营养反应37因此，我们研究了dRagA在正常食物或48小时氨基酸饥饿后组织细胞大小调节中的作用。在饥饿条件下，野生型dRagA的克隆过度表达导致单个细胞大小适度增加，而组成活性dRagAQ61L的表达导致细胞大小比饥饿条件下相邻细胞显著增加3倍(). 然而，有趣的是，在正常饲养条件下，野生型和dRagA Q61L的表达对细胞大小几乎没有影响()与dRagA在营养反应中的特定作用一致。此外，dRagA T16N的表达有效地降低了细胞大小，并且这种作用仅在营养充足的情况下可见，而在营养缺乏的情况下不可见(). 总之，这些数据与在哺乳动物细胞中观察到的RagA对S6K磷酸化的影响一致（活性RagA在无氨基酸培养基中增加S6K，而显性负性RagA则在富含氨基酸的培养基中抑制S6K），并强烈支持dRagA特别参与营养反应的作用。
为了研究内源性dRag的功能，我们确定了一个P元件插入在5′非翻译区dRagC公司基因。这种插入的动物纯合子被发现在三龄幼虫早期阻止生长，类似于在托尔功能丧失突变体36，并可在P元素动员后恢复生存能力（数据未显示）。在幼虫脂肪体中，克隆的细胞与此纯合子dRagC公司突变表明，在喂食但不饥饿的条件下，细胞大小在统计学上显著减小()，强调了对内生的要求dRagC公司细胞生长调节和营养反应。
Rag和TSC1/2独立并并行工作，以促进TORC1信号
接下来，我们进一步详细研究了Rag和TORC1通路成分之间的关系。在哺乳动物细胞中，雷帕霉素处理完全阻断了RagA Q66L/RagC S75N诱导的S6K磷酸化(). 与此一致，mTOR激酶死亡突变体（mTOR-KD）的共同表达也有效抑制了RagA Q66L/RagC S75N诱导的S6K磷酸化。这些结果表明Rag在mTOR上游起作用。另一方面，TSC1/TSC2的表达部分抑制了RagA Q66L/RagC S75N的刺激作用(). 相反，RagA Q66L/RagC S75N的表达部分逆转了TSC1/TSC2的抑制作用。为了进一步研究Rag和TSC之间的关系，我们检测了内源性蛋白。RagA和RagB基因都在HeLa细胞中表达（数据未显示）。RagA和RagB的敲除降低了S6K磷酸化，也降低了TSC2敲除引起的S6K磷酸化度的增加(). 这些结果表明，Rag和TSC1/2可能在平行的途径中独立调节mTORC1活性。
Rag与TOR通路成分之间的关系（a） Rag通过TORC1调节S6K磷酸化。用所指示的构建体转染。共表达600 ng mTOR激酶死亡（mTOR KD）结构或雷帕霉素治疗（20 nM，30 min）可消除RagA Q66L和RagC S75N对S6K磷酸化的影响。用抗mTOR抗体免疫印迹法测定mTOR KD蛋白水平。标记的分子量显示在右侧。
（b） RagA/RagC和TSC1/TSC2独立调节S6K磷酸化。如图所示，用200 ng的Rag和/或TSC构建物转染HEK293细胞。氨基酸饥饿1小时（−AA）。如图所示，通过使用适当抗体的免疫印迹法测定转染蛋白的磷酸化和蛋白水平。
（c） TSC2和RagA/B独立影响S6K磷酸化。如图所示，将20ng的HA-S6K转染到具有或不具有针对人TSC2、RagA和RagB的RNAi的HeLa细胞中。
（d） RagA T21N和RagC Q120L不能阻止Rheb诱导的S6K磷酸化。将RagA T21N和RagC Q120L（各200 ng）转染到HEK293细胞中，加入或不加入Rheb构建物（20 ng）。共同转染中包括S6K。如图所示，通过使用适当抗体的免疫印迹法测定转染蛋白的磷酸化和蛋白水平。
然后我们测试了RagA T21N对Rheb诱导的S6K磷酸化的影响。RagA T21N和RagC Q120L的表达能有效阻止基础S6K磷酸化，但不能抑制Rheb诱导的S6K磷酸化合(). 氨基酸饥饿也未能阻止Rheb对S6K磷酸化的刺激作用（数据未显示）。这些数据不包括Rag在Rheb下游发挥作用但与Rag在平行或上游作用的模型。
我们还研究了Rag和Rheb之间的功能关系体内通过基因研究果蝇。测试是否dRagC公司是Rheb刺激细胞生长所必需的dRagC公司−/−电池。的突变dRagC公司没有阻断Rheb过度表达的生长刺激作用(). 事实上，Rheb过表达在dRagC−/−遗传背景中诱导了更大的相对细胞大小增加。类似地，Rheb过表达已被证明在饥饿条件下对细胞大小有更强的影响38，进一步表明营养信号在数据标签C突变体。我们还研究了Rheb公司dRagA Q61L激活条件下功能丧失，发现Rheb公司无论是在对照动物还是在脂肪体中普遍表达dRagA Q61L的动物中，突变细胞都小于相邻的野生型细胞(). 这些数据表明，Rheb刺激细胞生长不需要dRagA和dRagC。我们还发现，在两种不同的细胞中，dRagA Q61L表达引起的细胞大小增加被部分或完全抑制Rheb公司低形态突变背景（数据未显示），表明dRagA的生长效应可能需要Rheb活性。总之，这些数据表明Rag与Rheb平行或上游作用，以刺激细胞生长。
Rag GTPases与Rheb平行作用，促进脂肪体细胞生长（a，b）Rheb诱导的细胞生长不需要dRagC。（a） 对照组或dRagC公司突变体(dRagC公司−/−）背景。Rheb的过度表达导致对照组和对照组的细胞面积显著增加dRagC公司突变背景*P=3.4e-02（n=5），**P=6.1e-03（n=6）；学生的双尾t检验，其中n代表实验样本的数量。。（b） Rheb过度表达细胞的典型例子dRagC公司突变背景。Rheb转基因表达细胞以GFP的共同表达为标志。细胞边界用指骨蛋白染色标记为红色；细胞核用蓝色的DAPI标记。比例尺代表50μm。
（c，d）dRagA Q61L的表达未能挽救Rheb公司突变细胞。（c） 克隆诱导的相对面积Rheb公司26.2对照背景和动物体内的纯合突变细胞在脂肪体中表达dRagA Q61L。克隆诱导的Rheb公司26.2在野生型和dRagA Q61L表达背景中，纯合突变细胞明显小于相邻的对照细胞*P=2.91e-04（n=7），**P=2.59e-08（n=5）；学生双尾t检验；fed条件，其中n表示实验样本数。（d） 脂肪体中广泛表达UAS-dRagA Q61L的Rheb纯合突变细胞（以缺乏GFP为标志，箭头所示）的典型例子。本实验中GFP阳性对照细胞是Rheb公司+/−和Rheb公司+/+.比例尺代表50μm。
Tsc1型突变动物因TOR信号过度活跃而在幼体早期死亡，这种致死性可以通过TOR或dS6K的杂合突变来挽救39,40同样，我们观察到dRagC公司部分抑制了由Tsc1型突变(图S4c，d). 这种不完全的救援表明dRagC可能对Tsc1/Tsc2信号有一定的响应。
Rag蛋白调节饥饿反应果蝇属
自噬在果蝇属脂肪体对饥饿的反应，这取决于TOR信号的下调。自噬很容易成像体内使用诸如GFP-Atg8和Lysotracker 41的标记物。我们发现dRagA Q61L的过度表达强烈抑制了饥饿诱导的点状Lysotracker和GFP-Atg8a染色()为了应对饥饿果蝇。这一观察结果表明，活性dRagA抑制营养素饥饿反应，表明高dRag A活性可能产生虚假信号，模拟营养素充足，从而抑制自噬。
Rag对自噬的调节（a–d）dRagA Q61L抑制自噬。（a） 克隆表达dRagA Q61L的果蝇脂肪体细胞（绿色标记为GFP表达）在饥饿4小时后无法积累自体溶酶体（点状Lysotracker红染色在周围的对照细胞中明显可见）。DAPI用蓝色标记细胞核。（b–d）GFP-Atg8a在对照脂肪体细胞（b）中的点状表达模式表明，在饥饿4小时后诱导自噬体反应，但在表达dRagA Q61L（c）的细胞中没有。对照组和dRagA Q61L表达克隆中每个细胞GFP-Atg8a标记的自噬体平均数量如（d）所示（*P=2.91E-06，每个基因型33个脂肪体样本的学生双尾t检验）。比例尺表示每个面板中的25μm。
（e） RagA调节哺乳动物细胞中LC3的转化。如图所示，Myc-LC3与RagA-QL和RagC-SN或RagA-SN和Rag C-QL共同转染到HEK293细胞中。转染后一天，细胞在氨基酸充足培养基（+AA）或氨基酸耗尽培养基（−AA）中培养4小时，然后收获。对Myc-LC3和HA-Rag进行蛋白质印迹。活性RagA阻断LC3I自噬转化为脂化LC3II形式，显性负性RagA刺激LC3I转化。
哺乳动物Atg8同源物LC3经过一系列修饰，在自噬过程中从LC3I转化为LC3II42为了进一步测试Rag在自噬中的功能，我们检测了HEK293细胞中的LC3修饰。RagA-QL和RagC-SN的表达抑制LC3转化以应对氨基酸饥饿(). 此外，即使在氨基酸存在的情况下，RagA-TN和RagC-QL的表达也能增强LC3的转化。这些结果与在果蝇属并进一步证明Rag GTPases在响应营养信号的自噬调节中的作用。
因为对营养限制的适当反应对生物体在不利条件下生存也很重要43,44，我们研究了dRagA活性对成年动物饥饿反应能力的影响。在脂肪体中靶向表达组成活性dRagA Q61L对正常饮食的动物的存活率没有显著影响，但导致饥饿条件下死亡率显著加快(). 相反，表达显性阴性dRagA T16N的动物对饥饿诱导的死亡更具抵抗力。dRagA转基因的普遍表达对饥饿存活率也有类似影响（数据未显示）。综上所述，这些数据表明，dRagA的活性对于响应营养素饥饿的信号传递非常重要，对动物的生存也至关重要。
高dRagA活性致敏果蝇属饿死（a，b）dRagA激活增加了对饥饿的敏感性。与对照组相比，使用脂肪体特异性Cg-GAL4驱动因子表达dRagA Q61L显著降低了成年雌性苍蝇在饥饿（a）条件下的存活率，但没有喂食（b）条件下（仅Cg-GAL 4）。星号表示与对照组相比存在显著差异的时间点（*P<0.05；学生双尾t检验；n=150只苍蝇/基因型/治疗）。
（c） Rag GTPase调节TORC1活性的拟议模型。Rag GTPases独立于TSC-Rheb并与之平行，激活TOR信号，可能通过转换营养素依赖信号。Rag GTPases调控TOR的机制是间接的，可能涉及其他未知因素。
讨论
氨基酸是TORC1的关键激活剂，但氨基酸信号传导机制尚未解决。尽管VPS34被提议将营养信号传递给TOR20,21，我们最近发现果蝇属具有电压34空突变具有正常的TOR活性45.Vps34敲除对dS6K磷酸化没有影响（数据未显示）。在本报告中，我们已经确定Rag GTPases是TORC1通路的重要新激活物，对两种氨基酸都有反应果蝇属以及哺乳动物。敲除dRagA或dRagC可显著降低dS6K磷酸化，以响应氨基酸刺激。组成性活性dRagA Q61L的过度表达增加了脂肪体和翅膀中的细胞大小，尤其是在饥饿状态下果蝇。显性负性dRagA T16N的表达降低了细胞大小，当营养充足时，这种影响更大。此外，dRagA Q61L表达和dRagC公司突变抑制了饥饿诱导的自噬和Tsc1型变异动物。在哺乳动物细胞中，组成活性RagA的过度表达即使在缺乏氨基酸的情况下也会激活TORC1，而显性负性RagA表达则会阻止TORC1对氨基酸刺激的反应。Rag与氨基酸之间的关系非常特殊，因为组成活性的RagA不能克服渗透胁迫。
表达dRagA Q61L的苍蝇在饥饿期间比对照苍蝇死亡更早，这可能是由于错误的营养充足感导致它们的代谢活动和生长没有减弱，这一事实进一步支持了Rag在营养反应中的生理作用。此外，表达dRagA T16N的动物对饥饿更有抵抗力，在缺乏营养的情况下存活时间更长。
我们的数据表明，RagA/B和RagC/D之间二聚体的形成对TORC1的激活很重要。在二聚体中，RagA/B的功能占主导地位。换句话说，无论复合物中RagC/D的核苷酸结合状态如何，RagA Q66L主要激活，而RagA T21N主要抑制TORC1。然而，鉴于dRagC敲除在S2细胞中的作用以及细胞的表型，RagC/D可能对二聚体功能至关重要dRagC公司突变动物。有趣的是，酵母Gtr1和Gtr2需要分别处于GTP-结合和GDP-结合状态才能发挥作用26我们的结果表明，RagA和RagC之间的关系与Gtr1和Gtr2之间的关系相似。此外，RagC在稳定RagA方面可能具有GTPase无关的作用，并可能调节RagA定位或活性，或帮助TORC1激活。
在酵母中的研究表明，Gtr1/Gtr2可以控制细胞内的蛋白质运输，从而调节一般氨基酸通透酶Gap1的定位26这一观察结果表明，Gtr1/2通过促进氨基酸输入从而调节营养素可用性来激活TORC1的可能机制。然而，我们从哺乳动物细胞获得的数据与该模型不一致：完全和长期的氨基酸缺失无法抑制过度表达RagA Q66L的细胞中的TORC1活性。其次，我们发现氨基酸输入不受RagA表达的显著影响(图S5). 因此，Rag不太可能通过促进营养素的可用性来调节TORC1。相反，我们赞成Rag在氨基酸和TORC1之间以平行于TSC-Rheb轴的途径作用的模型(). 一个有趣的可能性是Rag调节TORC1通路成分的定位。
这项研究确定Rag GTPases是TORC1在氨基酸信号传导中的新的阳性调节物，这一结论得到了哺乳动物细胞的生化研究和果蝇。进一步研究Rag在氨基酸传感和TORC1激活中的分子机制将为这一重要途径提供新的见解。
方法
抗体、质粒和试剂
反-果蝇属S6激酶抗体由玛丽·斯图尔特博士（北达科他州立大学，法戈，ND）慷慨提供。抗磷果蝇属S6K、抗-S6K、抗磷酸S6K、反Akt、反磷酸Akt和反磷酸4EBP1抗体来自Cell Signaling Inc（马萨诸塞州贝弗利）。抗-mTOR和抗Myc抗体来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。分别来自Covance（宾夕法尼亚州费城）和Sigma（密苏里州圣路易斯）的抗-HA和抗Flag抗体。编码人类RagA和RagC的cDNA是从美国组织培养文库（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得的，并经PCR扩增。将RagA亚克隆到pcDNA3-HA和pcDNA3-FLAG的BamHI/XhoI限制酶位点，将RagC亚克隆到pcDNA3-HA和Myc-pRK5载体的BamH1/EcoRI限制酶位点。分别从人脑cDNA文库和HEK293细胞cDNA文库中扩增出编码RagB和RagD的cDNA。RagB和RagD分别亚克隆到pcDNA3-FLAG和pRK5-Myc载体的EcoRV/XhoI和BamHI/EcoRI位点。RagA、B、C和D的所有突变结构均通过PCR诱变创建，并通过DNA测序进行验证。中列出了用于Rag构造克隆的引物补充信息，表S1所有其他DNA构建物，包括HA-S6K、Myc-4EBP1、GST-AKT、Flag-mTOR KD、HA-TSC1、HA-TSC 2、Myc-Sheb，均为实验室库存。胰岛素和雷帕霉素分别来自Sigma和Cell Signaling。靶向人类TSC2、RagA和RagB的siRNA来自Dharmacon公司（科罗拉多州拉斐特）
细胞培养
果蝇属S2细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA）在果蝇属在27°C培养箱中添加L-谷氨酰胺（45ml 200mM L-谷氨酰胺/500ml培养基）的SFM（Invitrogen）。HEK293细胞和HeLa细胞在37°C湿化培养箱中培养，培养基为Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（Invitrogen，Cat.No.12430），添加10%胎牛血清（FBS），培养温度为5%CO2.
含有氨基酸（AA）或不含氨基酸（SDMK-AA）的培养基，用于果蝇属S2细胞是根据施耐德的果蝇属培养基（Invitrogen）配方。AA（2X）、无机盐（2.5X）和其他组分（5X）的储备分别制成，并混合在一起，最终浓度为1X SDMK或1X SDMK-AA。对于SDMK-AA，添加ddH2O而不是AA。最终pH和渗透压分别调整为6.6–6.8和345–365 mOsm/kg。SDMK和SDMK-AA分别用于AA刺激和AA饥饿果蝇属S2电池。
用于HEK293和HeLa细胞的含氨基酸（AA）或无氨基酸（DMEMK-AA）培养基是基于DMEM培养基（Invitrogen，Cat.No.12430）配方制成的。分别制作AA（10X）、无机盐和其他成分（2X）的原料。对于维生素，MEM维生素溶液（Invitrogen，100X）以1:25稀释（最终浓度=4X）使用。将原料混合在一起，使其最终浓度为1X DMEMK或1X DMAMK-AA。对于DMEMK-AA，ddH2添加O代替AA。最终pH值和渗透压分别调整为7.0–7.4和295–340 mOsm/kg。DMEMK和DMEMK-AA分别用于HEK293和HeLa细胞的AA刺激和AA饥饿。
RNA干扰
果蝇属RNA干扰（RNAi）实验按照描述进行，并进行了微小的修改46简言之，引物侧翼为5′端的T7 RNA聚合酶结合位点（GAATTAATACCATAGGAGA），其后为基因特异性序列(表S2)目的是扩增约600bp的感兴趣基因编码区。每个单独的DNA片段都用此引物通过PCR从果蝇属使用高纯度PCR纯化试剂盒（印第安纳波利斯罗氏）纯化基因组DNA和PCR产物。使用纯化的PCR产物作为模板，体外使用MEGAscript T7转录试剂盒（德克萨斯州奥斯汀Ambion）进行转录以产生dsRNA。转录的RNA被退火在体外在65°C下培养30分钟，然后缓慢冷却至室温。用1%琼脂糖凝胶电泳分析dsRNA的完整性、长度并进行定量。果蝇属S2细胞在12孔板中培养4天，起始密度为2×105每个孔的细胞数。在第1天和第3天，直接向培养孔中添加4μg靶向感兴趣基因的dsRNA。在第4天结束时，用150μl/孔温和溶解缓冲液（10 mM Tris-HCl[pH7.5]、100 mM NaCl、1%NP-40、50 mM NaF、2 mM EDTA[pH8.0]、1 mM DTT、1 mM-PMSF、10μg/ml亮氨酸肽和10μg/ml抑肽酶）溶解细胞。对细胞裂解物进行SDS-PAGE分析。
在HeLa细胞中进行RNAi实验时，细胞被稀释并以大约30%的汇合率被镀入6孔板。24小时后，按照制造商的方案，使用脂质内酰胺（Invitrogen）转染20μM siRNA（最终浓度）。
转染与Western Blot分析
在无血清条件下使用脂质体进行转染™制造商描述的试剂（Invitrogen）。细胞在轻度溶解缓冲液（10 mM Tris-HCl[pH7.5]、100 mM NaCl、1%NP-40、50 mM NaF、2 mM EDTA[pH8.0]、1 mM DTT、1 mM-PMSF、10μg/ml亮氨酸肽和10μg/ml抑肽酶）中溶解。样品通过SDS-PAGE溶解，转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后用所需抗体进行印迹。
果蝇属股票和基因操纵
分别编码dRagA/CG11968和dRagC/CG8707的EST GH04846和GH16429购自Drosophila Genomics Resource Center（Bloomington，IN）。将这些cDNA的野生型和PCR生成的突变版本亚克隆到pUAST中并注入w个1118标准程序的胚胎（杜克大学模型系统基因组学）。P[EPgy2]EY11726是dRagC/CG8707的5-UTR中的致命插入物。转座酶介导切除该细胞系可完全恢复生存能力。生成同工酶数据标签C克隆，EY11726元件与FRT42D重组。的细胞克隆dRagC公司EY11726（眼睛11726）或Rheb公司二维图1如前所述，产生突变或表达dRag转基因47.在25°C的标准玉米粉/糖蜜/琼脂培养基上培养苍蝇。
组织学和尺寸量化
幼虫的培养和饥饿、脂肪体解剖、得克萨斯红鬼笔肽处理和Lysotracker染色如所述进行48如前所述，GFP-Atg8a在自发性幼虫脂肪体克隆中表达45使用ACT1软件拍摄图像，运行DXM 1200尼康数码相机，相机连接到蔡司Axioscope 2外荧光显微镜上，带有Plan-Neoflar 5x和40X物镜。使用Adobe Photoshop 7.0的直方图功能确定突变脂肪体细胞和周围对照脂肪体细胞的平均面积。为了量化转基因对成体翅膀细胞和小室大小的影响，使用Photoshop 7.0测定了代表性前部区域（翅膀边缘和L1之间的区域）和代表性后部区域（L3和L4之间的面积）内的平均面积和细胞数量。对每个基因型至少六个样本进行统计分析，并使用Student的双尾非配对t检验确定显著性。
活性分析
50只雌性成年苍蝇使用脂肪体特异性表达指定的UAS-dRag转基因cg-GAL4公司驾驶员在羽化后24–48小时内食用常规食物，然后转移到含有普通琼脂（饥饿）或标准苍蝇培养基（喂养）的小瓶中。每24小时对活蝇进行计数并转移到新鲜的小瓶中。这些实验共进行了三次。
