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EMBO J。2000年6月15日；19（12）：2924–2934。
数字对象标识：10.1093/emboj/19.12.2924
预防性维修识别码：项目编号：C203368
PMID：10856237

蛋白激酶RSK2中一个磷酸丝氨酸调节的对接位点，可招募并激活PDK1

莫滕·弗罗丁,1 克劳斯·杰森,卡琳·梅里恩,2和Steen Gammeloft公司
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

90kDa核糖体S6激酶-2（RSK2）是一种具有两个激酶结构域的生长因子刺激蛋白激酶。RSK2的C末端激酶被ERK型MAP激酶激活，导致RSK2在Ser386的疏水基序中发生自磷酸化。N-末端激酶由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）通过Ser227的磷酸化激活，并磷酸化RSK的底物。这里，我们确定RSK2疏水基序中的Ser386是PDK1的磷酸化依赖性对接位点和活化剂。用生长因子处理细胞可诱导PDK1向Ser386-磷酸化疏水基序的募集，并在Ser227诱导RSK2磷酸化。RSK2-S386K突变体与PDK1无相互作用或Ser227的磷酸化。与Ser386-磷酸化RSK2的相互作用诱导PDK1的自磷酸化。添加合成磷酸化Ser386肽（RSK2373–396)PDK1活性增加6倍在体外最后，RSK2和MSK1（一种RSK相关激酶）的突变体与PDK1的亲和力增强，具有组成活性体内和磷酸化组蛋白H3。我们的结果表明，一种基于磷酸丝氨酸介导的PDK1向RSK2的募集的新调节机制，导致PDK1和RSK2协同磷酸化和活化。

关键词：ERK/生长因子/MSK1/PDK1/RSK2

介绍

90 kDa核糖体S6激酶（RSK1-4）是一个广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，被细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1和ERK2）激活，以响应许多生长因子、肽激素和神经递质（综述于Frödin和Gammeloft，1999年；Nebreda和Gavin，1999年). RSK是ERK在细胞分裂和存活调节中的重要效应物。在非洲爪蟾卵母细胞，RSK调节G2–通过p34磷酸化实现减数分裂I的M期进展cdc2-抑制激酶Myt1(Palmer等人，1998年). 在第二次减数分裂期间，RSK诱导中期停滞，以防止未受精卵中的细胞分裂(巴特和费雷尔，1999年；Gross等人，1999年). 在小脑颗粒神经元中，RSK磷酸化并灭活促凋亡蛋白BAD(Bonni等人，1999年). RSK被提议磷酸化并激活转录因子，如雌激素受体-α(Joel等人，1998年)和CREB(Xing等人，1996年)结合并调节CBP和p300的功能，它们是转录共同激活物(Nakajima等人，1996年). 此外，RSK2在Ser10磷酸化组蛋白H3，这可能导致染色质重塑并促进基因转录(Sassone-Corsi等人，1999年). RSK2基因失活突变与人类Coffin–Lowry综合征有关，该综合征的特征是严重智力低下和进行性骨骼变形(Trivier等人，1996年). RSK4突变也可能导致精神发育迟滞(Yntema等人，1999年).

最近，发现了两种与RSK同源的丝裂原和应激激活蛋白激酶（MSK）(迪克等., 1998；皮埃拉等., 1998). MSK被ERK和p38 MAP激酶激活，以响应生长因子和各种细胞应激刺激。MSK似乎是一种主要的生长因子激活的CREB激酶(迪克等., 1998；皮埃拉等., 1998)与组蛋白H3和HMG-14的磷酸化有关(汤姆森等1999年)提示MSK在转录调控中的作用。

RSK由两个由～100-氨基酸连接区连接的激酶结构域组成（图1). N-末端激酶（NTK）磷酸化RSK的底物，其活性由C-末端激酶（CTK）和接头调节。RSK的激活需要四个位点的磷酸化(达尔比等., 1998). 作为一个可能的事件序列，ERK磷酸化连接子中的Ser369（使用小鼠RSK2编号）和CTK激活环中的Thr577，导致其激活(Fisher和Blenis，1996年；达尔比等., 1998). 然后CTK磷酸化连接子中的Ser386(Vik和Ryder，1997年). 最后，NTK需要激活环中Ser227的磷酸化，这是由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）催化的(延森等., 1999；理查兹等., 1999；威廉姆斯等., 2000). 而Ser227的磷酸化直接激活NTK(延森等., 1999)，尚不清楚Ser386的磷酸化如何调节NTK的活性。

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图1。RSK2的结构和调节性磷酸化位点。RSK由两个激酶结构域组成，由一个调节性连接区连接。C端子尾部包含ERK的对接位置(加文和内布拉达，1999年；史密斯等., 1999). 显示了五个磷酸化位点的位置以及磷酸化这些位点的激酶。Ser227、Ser369、Ser386和Thr577的磷酸化调节激酶活性，而Thr365磷酸化的作用尚不清楚（小鼠RSK2编号）。氨基酸序列显示PDK1共有磷酸化基序和带有保守残基的粗体疏水基序。比对表明，这两个基序存在于许多生长因子活化激酶中，包括RSK、MSK、p70 S6K、PKBα、PKCδ、SGK和PRK2。需要磷酸化才能激活激酶的丝氨酸/苏氨酸以红色显示。序列为人类，RSK1（大鼠）、RSK2和PKCδ（均为小鼠）除外。

PDK1在几种生长因子诱导的蛋白激酶的激活中起着核心作用（综述于贝勒姆等., 1999)包括蛋白激酶B（PKB）(阿莱西等.，1997年a；斯蒂芬斯等., 1998)，p70 S6激酶(阿莱西等1997年b月；拉伦等1998年)，几种PKC同型(迪蒂等., 1998；勒古德等., 1998)血清和糖皮质激素诱导激酶（SGK）(小林和科恩，1999年；公园等., 1999). 这些激酶都被PDK1在类似于RSK2中Ser227的激活环中的丝氨酸或苏氨酸磷酸化（图1). 此外，这些激酶的激活需要丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化，该残基位于RSK中类似于Ser386的激酶结构域的C末端。该磷酸化位点位于一个典型的疏水基序中（图1)，首次在p70 S6激酶中识别(皮尔逊等., 1995).

决定PDK1对其多激酶底物特异性作用的机制只是部分特征。PDK1对PKB的激活需要在质膜上共同定位，由两种激酶的pleckstring同源性（PH）结构域的3-磷酸肌醇结合介导(杰尔科维奇等., 1997；安德森等., 1998；咖喱等., 1999). 此外，3-磷酸肌醇化物可能通过构象变化将PKB转化为PDK1的良好底物(阿莱西等.，1997年a；斯托科等., 1997). PDK1对p70 S6激酶和SGK的磷酸化取决于这些激酶中其他地方发生的磷酸化事件，包括疏水基序(阿莱西等1997年b月；丹尼斯等., 1998；拉伦等., 1998；小林和科恩，1999年). PDK1的催化活性尚不明确。因此，细胞的生长因子处理或3-磷酸肌醇与PDK1的PH域的相互作用并没有增加PDK1明显的组成活性(阿莱西等.，1997年a,b条；拉伦等., 1998).

在本研究中，我们研究了RSK2和PDK1的相互作用和调节。我们报道了一种基于磷酸丝氨酸识别的PDK1激活机制和PDK1作用的特异性。因此，生长因子诱导的RSK2疏水基序中Ser386的磷酸化产生一个结合位点，该结合位点招募PDK1并刺激其对RSK2中Ser227的催化活性。

结果

RSK2疏水基序中的Ser386是Ser227磷酸化和NTK结构域激活所必需的

为了研究连接子在RSK2调节中的作用，我们产生了一系列由NTK结构域组成的突变体，其中连接子区域的部分增加。突变体在COS7细胞中表达，并测定其激酶活性，并与全长RSK2进行比较。缺失突变体RSK21–360，RSK21–373和RSK21–380在细胞中几乎没有活性（图2). 相比之下，RSK21–389显示出比来自未刺激细胞的全长RSK2高2.5倍的激酶活性，因此表现为组成活性RSK2突变体。残基381-389包括疏水基序和Ser386，后者被CTK磷酸化。最后，RSK21–417和RSK21–422具有与RSK2大致相同的活性1–389当修正其较低表达时（图2). RSK2系列1–360，RSK21–373和RSK21–380由于错误折叠，未处于非活动状态，因为它们可以激活到与RSK2相同的级别1–389与PDK1共表达（数据未显示）。总之，疏水基序能够激活RSK2的分离NTK结构域体内.

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图2。RSK2缺失突变体的激酶活性体内用表达HA表位标记的全长RSK2或缺失突变体的质粒转染COS7细胞。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，细胞被裂解，RSK用Ab沉淀到HA表位标签上，并进行激酶分析（下面板）。数据以来自未刺激细胞的全长RSK2的百分比表示，并且是重复进行的三个独立实验的平均值±SD。RSK2的活动1–389和未刺激的RSK2是不同的(第页<0.001）与未折旧相比t吨-测试。激酶分析后，对RSK进行SDS–PAGE并用抗体免疫印迹HA表位标签（上面板）。

我们研究了RSK2的磷酸化1–389使用磷酸特异性抗体（Abs）对该突变株中存在的四个磷酸化位点：Ser227、Thr365、Ser369和Ser386。令人惊讶的是，RSK21–389在Ser386处被严重磷酸化，即使该突变不包含CTK结构域（图三B、 车道3和4）。显然，RSK2的活性需要Ser386的磷酸化1–389，因为突变RSK21–389S386A显示激酶活性显著降低（图三A、 车道5和6）。细胞暴露于表皮生长因子（EGF）不会增加Ser386的磷酸化或RSK2的激酶活性1–389，与全长RSK2相比（图三A和B）。有趣的是，PDK1位点Ser227在RSK2中也被高度磷酸化1–389，但在RSK2中仅略微磷酸化1–389S386A，RSK2中未磷酸化1–380（图三C） ●●●●。EGF在全长RSK2中强烈诱导Ser227处的磷酸化，但在突变体中没有（图三C） ●●●●。最后，在基础或EGF刺激的条件下，没有RSK2突变体在连接子（Thr365和Ser369）的两个ERK磷酸化位点显示任何磷酸化。相反，全长RSK2在这些位点显示EGF诱导的磷酸化（图三D和E）。如血凝素（HA）表位标签的免疫印迹所示，所有结构体在沉淀中的水平大致相似（图三F） ●●●●。这些数据表明RSK21–389在细胞中是活跃的，因为它在Ser386和Ser227处被组成性磷酸化。此外，这两个磷酸化位点表现出层次关系，因为Ser386的磷酸化是Ser227磷酸化所必需的。

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图3。疏水基序在调节RSK2 N末端激酶磷酸化位点中的作用。用表达HA表位标记的野生型RSK2或突变体RSK2的质粒转染COS7细胞。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，将细胞暴露于（或不暴露于）20 nM EGF中20分钟并溶解。此后，RSK从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA表位。(A类)测定RSK的激酶活性，并将其表示为基础RSK2的百分比1–389活动。数据是重复进行的四个独立实验的平均值±SD。以下条形图的数据与未成对条形图相比有所不同t吨-测试：3对5(第页<0.001); 3对7(第页<0.05). 激酶分析后，将沉淀的RSK的等分样品进行SDS–PAGE和Abs免疫印迹，Abs在Ser386磷酸化时结合RSK2(B类)，序列227(C类)，Thr365(D类)或Ser369(E类)，或将Ab添加到HA标签(F类).

在全长RSK2中还观察到Ser386和Ser227的磷酸化之间的层次结构。因此，突变RSK2-S386K在未刺激或EGF处理的细胞中未显示Ser227的磷酸化（图4B） 并且处于非活动状态（图4A） ●●●●。相反，RSK2-S386K中Thr365和Ser369这两个ERK磷酸化位点的磷酸化正常发生，以响应EGF（图4C和D）。此外，两个ERK位点的突变并不影响Ser227或Ser386的磷酸化（数据未显示）。RSK2-S386K未能在Ser227处进行磷酸化，这为以下观察提供了解释：激活RSK1需要Ser386(达尔比等., 1998)和RSK2(延森等., 1999).

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图4。RSK2中Ser227的磷酸化需要Ser386。用表达HA标记的RSK2或RSK2-S386K的质粒转染COS7细胞。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，将细胞暴露于（或不暴露于）20 nM EGF中20分钟并溶解。(A类)RSK从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签，测定其激酶活性，并以EGF刺激的野生型RSK2活性的百分比表示。数据是重复进行的三个独立实验的平均值±SD。激酶分析后，将沉淀的RSK的等分样品进行SDS–PAGE和Abs免疫印迹，Abs在Ser227磷酸化时结合RSK2(B类)，Thr365(C类)，序列369(D类)或将Ab标记为HA表位标签(E类).

RSK2的疏水基序是PDK1的磷酸化依赖性对接位点

由于RSK2-S386K在PDK1位点没有磷酸化，我们研究了与野生型RSK2相比，该突变体是否不能与PDK1相互作用。Myc表位标记的PDK1与RSK2或RSK2-S386K在COS7细胞中共同表达，随后RSK2与Ab沉淀到HA标签上，并对共沉淀的PDK1.进行免疫印迹。细胞在裂解前未暴露于EGF，因为与PDK1的共同表达通过直接或间接机制诱导Ser386处RSK2的大量磷酸化(延森等., 1999). 如图所示5A、 RSK2沉淀的PDK1明显多于RSK2-S386K。对照免疫印迹显示沉淀中含有等量的RSK2和RSK2-S386K（图5B） PDK1在两种共转染条件下表达水平相似（图5C） ●●●●。还发现PDK1与RSK1和RSK3从共转染细胞的裂解液中沉淀（数据未显示）。

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图5。RSK2需要Ser386才能与PDK1交互。用表达myc-PDK1和HA-RSK2或HA-RSK2-S386K的质粒共同转染COS7细胞。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，裂解细胞，并用Ab对细胞裂解物进行HA标签的免疫沉淀。将等分的沉淀物进行SDS–PAGE并用抗体免疫印迹PDK1上的myc表位标签(A类)或RSK2上的HA表位标签(B类). 通过对免疫沉淀前裂解产物进行myc标记的免疫印迹，验证PDK1在细胞中的平等表达(C类). 实验进行了三次，结果相似。

为了确定RSK中PDK1的结合位点，我们检测了RSK2连接子缺失突变体沉淀共表达myc-PDK1。如图所示6A、 PDK1与RSK2共沉淀1–389，但RSK2的情况要少得多1–380或带有RSK21–389S386A。这表明疏水基序构成了RSK2中PDK1的主要结合位点，该基序必须在Ser386磷酸化才能有效结合PDK1。与此结论一致，沉淀缓冲液中磷酸酶抑制剂的缺失导致Ser386几乎完全去磷酸化，RSK2复合物被破坏1–389和PDK1（图6B） ●●●●。为了模拟磷酸基团的负电荷，我们在RSK2中突变了Ser3861–389天冬氨酸。RSK2系列1–389S386D显示PDK1的形成比RSK2复杂1–389，表明该位置的Asp仅部分模仿磷酸基团。然而，重要的是，RSK2的关联1–389带有PDK1的S386D在免疫沉淀过程中几乎不受磷酸酶抑制剂缺失的影响（图6B） ●●●●。这表明，破坏PDK1和RSK2复合体的去磷酸化作用1–389主要发生在磷酸化的Ser386。

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图6。PDK1通过Ser386-磷酸化疏水基序与RSK2相互作用。用表达myc-PDK1、HA-RSK2、HA-RSK2突变体、MEK-S217/221E的质粒或空载体（-）转染COS7细胞，如各面板所示。在48小时和最后3小时的血清饥饿期之后，细胞被裂解。(A类)用Ab对细胞裂解物进行HA标记免疫沉淀，然后对沉淀的等分部分进行SDS–PAGE，并用Ab免疫印迹PDK1中的myc标记或RSK2中的HA标记。(B类)细胞裂解物在含有或不含磷酸酶抑制剂（原钒酸盐、花萼蛋白、氟化钠）的裂解缓冲液中用抗体对HA标签进行免疫沉淀。将等分的沉淀物进行SDS–PAGE和Ab免疫印迹，使其与PDK1中的myc标记、RSK2中的phosphosphoSer386或RSK2的HA标记结合。(C类)细胞裂解物经抗体免疫沉淀至RSK2的CTK结构域。将等分的沉淀物进行SDS–PAGE和Ab免疫印迹，使其与PDK1中的myc标记、RSK2中的phosphosphoSer386或RSK2的HA标记结合。实验进行了三次，结果相似。

可以认为，疏水基序不是实际的PDK1结合位点，但该基序诱导RSK2的构象变化，从而允许PDK1与NTK域中的不同位点结合。因此，我们生成了RSK2的截断突变体，该突变体由分离的CTK结构域和带有（RSK2）的连接子序列组成375–740)或不带疏水基序（RSK2416–740)并检测其共沉淀PDK1的能力。如图所示6C、 PDK1仅与包含疏水基序的CTK突变体形成复合物。此外，大量PDK1与RSK2共沉淀375–740如果疏水基序在Ser386被磷酸化，则通过与组成活性MEK-S217E/S221E共表达实现（图6C） ●●●●。在本实验中，MEK-S217E/S221E可能激活内源性ERK，进而激活CTK结构域，导致Ser386的自磷酸化。

为了将这些发现与RSK的激活机制联系起来，我们研究了用EGF刺激细胞是否会导致PDK1和全长RSK2之间复合物的形成增加。在本实验中，我们使用了激酶缺失的PDK1突变体（PDK1-KD），因为与野生型PDK1的共同表达会诱导全长RSK2中Ser386的磷酸化(延森等., 1999). 如图所示7A、 EGF处理增加了RSK2沉淀中PDK1-KD的数量（伴随着Ser386磷酸化的诱导；数据未显示）。相反，EGF没有刺激RSK2-S386K和PDK1-KD之间的复合物形成。对照免疫印迹显示，来自未处理和EGF刺激的细胞的沉淀物含有等量的RSK2或RSK2-S386K（图7B） PDK1-KD在各种细胞裂解物中的水平相似（图7C） ●●●●。

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图7。在生长因子处理的细胞中招募PDK1至RSK2。如图所示，COS7细胞与表达激酶缺陷型（KD）myc-PDK1和HA-RSK2或HA-RSK2-S386K的质粒共转染。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，将细胞暴露于或不暴露于20 nM EGF中25分钟，然后溶解。将细胞裂解物与HA标记的抗体进行免疫沉淀。将等分的沉淀物进行SDS–PAGE并用抗体对PDK1中的myc标记进行免疫印迹(A类)或RSK2中的HA标签(B类). 通过对免疫沉淀前裂解产物进行myc标记的免疫印迹，验证PDK1在细胞中的平等表达(C类). 实验进行了三次，结果相似。

总之，我们的发现强烈表明RSK2的疏水基序是PDK1的磷酸化Ser386依赖性对接位点。可以提出一种模型，其中来自ERK途径的信号输入诱导RSK2的疏水基序的磷酸化，从而产生一个结合位点，该结合位点募集PDK1用于Ser227的磷酸化和NTK结构域的激活。

PDK1与Ser386磷酸化疏水基序的结合刺激其自身磷酸化和催化活性

在上述实验中，我们注意到当PDK1与RSK2或RSK2共表达时，电泳迁移率向上移动1–389表明PDK1磷酸化。共表达裂解物的延伸电泳显示，当与RSK2、RSK2共表达时，PDK1迁移为多达四条离散带1–389，激酶缺乏RSK21–389和RSK2375–740（与活性MEK共同表达），均含有磷酸化Ser386（图8A） ●●●●。相反，当与不含磷酸化Ser386的RSK2突变体（即RSK2-S386K、RSK2）共表达时，PDK1迁移为一条带375–740（没有活性MEK的共同表达），RSK2416–740和RSK21–389S386A。激酶缺陷型PDK1与RSK2或RSK2共表达时，其流动性没有改变1–389（图8A） ●●●●。这些数据表明，当PDK1与RSK2的Ser386磷酸化疏水基序相互作用时，它在几个位点发生自磷酸化。为了研究PDK1的自磷酸化是以分子内还是分子间的方式发生，COS7细胞与RSK2共转染1–389，PDK1-KD和截短的突变体PDK151–556如图所示8B、 RSK2系列1–389诱导PDK1的自磷酸化51–556，但没有推广PDK151–556磷酸化PDK1-KD。这表明PDK1在与RSK2疏水基序结合后发生分子内自磷酸化。

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图8。PDK1与RSK2的Ser386磷酸化疏水基序结合后的自身磷酸化体内(A类和B类)如图所示，COS7细胞与表达野生型或突变型myc-PDK1和HA-RSK2的质粒以及MEK-S217/221E共同转染。KD表示激酶缺陷突变体。转染后48小时，细胞被血清饥饿3小时。随后，在SDS-PAGE样品缓冲液中对细胞进行裂解，并进行SDS-PACE和抗体对PDK1中myc标记的免疫印迹。实验进行了三次，结果相似。

PDK1自磷酸化被诱导在体外通过将免疫纯化的PDK1与[γ]孵育-32P] ATP和pSer386肽，一种RSK2残基373–396的合成肽，含有磷酸化的Ser386（图9A） ●●●●。相反，PDK1单独孵育、与S6肽或与Ser386肽（非磷酸化）孵育，几乎没有显示出自身磷酸化。电泳迁移率变化分析表明，pSer386肽诱导PDK1的自磷酸化>90%在体外磷酸化反应（图9B） ●●●●。

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图9。含有磷酸化-Ser386的RSK2肽诱导PDK1的自磷酸化在体外免疫纯化的myc-PDK1单独（不添加）或与10µM S6肽或RSK2肽残基373–396预孵育20分钟，其未磷酸化（Ser386肽）或在Ser386磷酸化（pSer386肽类）。(A类)允许PDK1在存在[γ]的情况下自动磷酸化20分钟-32P] ATP，然后对反应进行SDS-PAGE和放射自显影。(B类)允许PDK1在存在或不存在ATP的情况下自动磷酸化35分钟，然后对反应进行SDS-PAGE和抗体免疫印迹以识别PDK1中的myc标记。实验进行了两次，结果相似。

接下来我们研究了PDK1自磷酸化的增加是否与PDK1的催化活化有关。免疫纯化的PDK1在体外使用细菌表达的、激酶缺乏的RSK2进行激酶测定1–373作为基底。与单独孵育、S6肽或Ser386肽相比，用pSer386肽孵育使PDK1的激酶活性增加了6倍（图10A和B）。PDK1对NTK的磷酸化作用只发生在Ser227，因为突变的RSK21–360与RSK2相比，PDK1未磷酸化S227E1–360（图10C） ●●●●。当使用S6肽作为底物时，也观察到pSer386肽激活PDK1（数据未显示），尽管S6肽对于PDK1来说是一个相当差的底物，因为它不包含PDK1共识磷酸化序列。

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图10。含有磷酸化Ser386的RSK2肽激活PDK1在体外免疫纯化的myc-PDK1单独（不添加）或与10µM S6肽、Ser386肽或pSer386肽类预先孵育20分钟。(A类和C类)然后用[γ]孵育PDK1 10分钟-32P] ATP和2微克RSK21–373KD或0.5微克RSK21–360作为底物，如每块面板所示，然后对反应进行SDS–PAGE和放射自显影。(B类)（A）中PDK1活性通过定量加入RSK2的放射性测定1–373KD使用荧光成像仪。数据表示为pSer386肽存在时PDK1活性的百分比，是三个独立实验的平均值±SD。以下条形图的数据与未成对条形图相比没有差异t吨-测试：1对2或3(第页>0.2). 条形图1和条形图4中的数据与未成对数据相比有所不同t吨-测试(第页<0.001).

这些数据表明，PDK1在与RSK2疏水基序中的磷酸化Ser386相互作用时被激活，导致PDK1的分子内自磷酸化和RSK2在Ser227的磷酸化。这代表了PDK1的一种新的调节机制，其中PDK1通过与其底物RSK2的相互作用被激活，因此可能通过ERK信号通路间接激活。

体内RSK2和MSK1磷酸化组蛋白H3的组成活性突变体

我们利用对RSK2激活机制的新见解来生成RSK2和MSK1的组成性活性激酶。RSK2系列1–389在连接子中的两个ERK磷酸化位点未被磷酸化（见图三D和E），增加了在这些位点引入带负电荷氨基酸将进一步增加其活性的可能性。的确，RSK21–389T365E和RSK21–389S369E的激酶活性比RSK2高60-80%1–389（图11A） ●●●●。RSK2活性增加1–389T365E为Thr365磷酸化在RSK激活中的作用提供了第一个证据。两个ERK位点的突变产生了一个突变体RSK21–389T365E/S369E，与EGF刺激的野生型RSK2具有相同的活性。最后，我们尝试通过增强PDK1与连接器的对接来激活RSK2。最近，蛋白激酶C相关激酶-2（PRK2）的疏水基序在酵母双杂交筛选中作为PDK1相互作用片段被分离出来(巴伦德兰等.，1999年a). PRK2的疏水基序包含三个特征芳香残基，但除此之外，它还包含两个天冬氨酸残基，其中一个位于RSK2中类似Ser386的位置（参见图1). 表面等离子体共振测量表明PRK2片段和PDK1之间存在非常紧密的相互作用(巴伦德兰等.，1999年a). 因此，我们替换了RSK2的疏水基序1–389T365E/S369E和PRK2。合成的嵌合分子称为组分活性（CA）-RSK2，与RSK2相比，其沉淀共表达PDK1的能力增加了4倍1–389T365E/S369E（数据未显示），其活性是原来的两倍（图11A） 可能是由于内源性PDK1的有效补充。

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图11。RSK2和MSK1的组成活性突变体。用表达HA-标记野生型或突变型RSK2或MSK1和myc-标记PDK1的质粒转染COS7细胞，如每个面板所示。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，将细胞暴露于（或不暴露于）20 nM EGF中20分钟并溶解。(A类)用抗体从细胞裂解液中沉淀RSK2至HA标签，并进行激酶分析（下面板）。数据表示为EGF-刺激的全长RSK2活性的百分比，是重复进行的3-4个独立实验的平均值±SD。以下条的数据与未干燥的相比有所不同t吨-测试：3对6(第页<0.05); 3对7(第页<0.01）。激酶分析后，沉淀物用抗体对HA标签进行免疫印迹（上面板）。(B类)MSK1从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签，测定其激酶活性，并以EGF刺激的野生型MSK1活性的百分比表示（下表）。数据是重复进行的四个独立实验的平均值±标准差。激酶分析后，用抗体对MSK进行HA标签免疫印迹（上面板）。(C类)MSK1突变体从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签。用抗体对PDK1中myc标记或MSK1中HA标记的沉淀进行免疫印迹。通过对免疫沉淀前裂解产物进行myc标记的免疫印迹，验证PDK1在细胞中的平等表达。实验进行了三次，结果相似。(D类)MSK1突变体从带有Ab的细胞裂解液中沉淀到HA标签，并进行激酶分析（下面板）。数据以CA-MSK1活性的百分比表示，是重复进行的三个独立实验的平均值±SD。激酶分析后，沉淀物用抗体对HA标签进行免疫印迹（上面板）。

MSK1在NTK结构域包含PDK1共有磷酸化位点，在连接子区域包含疏水基序。缺失突变体MSK11–379由NTK结构域和疏水基序后截断的连接子组成，通过与PDK1的共表达刺激14倍，相当于全长MSK1对EGF反应活性的两倍（图11B） ●●●●。然而，与RSK2相比1–389，MSK11–379显示PDK1的复杂程度相对较低（数据未显示）。MSK1疏水基序的替换1–379与PRK2一起，导致突变CA-MSK1，与共表达PDK1的亲和力显著增加（图11C） 与MSK1相比，激酶活性增加了50倍1–379（图11D） ，很可能是由于内源性PDK1的有效补充。CA-MSK1的活性是EGF刺激的全长MSK1的三倍。

我们评估了组成活性突变体磷酸化组蛋白H3的能力，这是最近提出的RSK2和MSK1的核靶点。在转染的COS7细胞中，CA-RSK2和CA-MSK1主要是细胞溶质，但通过免疫细胞化学分析，在这些突变体的N末端引入三个核定位序列（NLS）导致了完全的核定位（数据未显示）。在转染细胞中，NLS-CA-RSK2和NLS-CA-MSK1在Ser10诱导组蛋白H3的强烈磷酸化，而这些突变的激酶缺陷型未诱导磷酸化（图12A） ●●●●。比较显示野生型RSK2和MSK1对EGF诱导的组蛋白H3磷酸化。除激酶缺陷突变体外，所有结构均表现出相同的表达，突变体的数量较少（图12B） ●●●●。最后，我们分析了体内MSK1对Ser133的CREB磷酸化。如图所示12C、 在转染NLS-CA-MSK1的细胞中，CREB磷酸化被诱导，但在缺乏激酶的细胞中没有诱导。载体转染的细胞表现出响应EGF的内源性CREB激酶活性的Ser133磷酸化。

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图12。 体内RSK2和MSK1的核靶向组成型活性突变体对组蛋白H3和CREB的磷酸化。用表达HA标记野生型或突变型RSK2或MSK1的质粒转染COS7细胞。NLS，核定位序列。在24小时和最后3小时血清饥饿期后，将细胞暴露于或不暴露于20 nM EGF 25分钟。细胞在SDS–PAGE样品缓冲液中进行裂解，并用Abs对Ser10磷酸化的组蛋白H3进行免疫印迹(A类)，到HA标签(B类)或至Ser133磷酸化的CREB(C类).

讨论

最近的研究表明，PDK1在激活几种生长因子激活的蛋白激酶（包括PKB、p70 S6激酶、PKC、RSK和SGK）中起着关键作用，这些激酶调节细胞生存、增殖、蛋白质合成和基因表达。这些激酶由不同的信号通路激活，但都需要PDK1在激活环中保守的丝氨酸/苏氨酸处进行磷酸化。这就提出了PDK1作用的特异性问题，以及为什么PDK1与其底物（在贝勒姆等., 1999). 在这里，我们报告了PDK1以磷酸化依赖的方式被RSK2中的保守基序招募，导致PDK1激酶活性的刺激。这表明PDK1的催化活性受到调节，并表明PDK1作用的特异性具有底物导向的靶向机制。

我们的结果表明PDK1和RSK2协同激活的多步骤机制（图13). 第一步是激活ERK以响应细胞外信号。ERK在几个位点磷酸化RSK2，包括CTK激活环中的Thr577，导致连接子区域疏水基序中Ser386处RSK2的自动磷酸化。

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图13。PDK1和RSK2的招募和协调激活模型。（1） 静止细胞包含一个由非活性RSK和ERK预先形成的复合物。（2）刺激Ras–ERK途径导致ERK催化的连接物和CTK磷酸化，导致疏水基序（蓝框）中Ser386处RSK2的自磷酸化。（3） 疏水基序中Ser386的磷酸化产生一个对接位点，允许PDK1和RSK2之间形成复合物。（4） PDK1与Ser386-磷酸化疏水基序的相互作用刺激PDK1活性和自身磷酸化。PDK1局部浓度的增加和激酶活性的结合确保了Ser227的有效磷酸化，从而导致RSK的完全激活。

第二步是从PDK1招募到RSK2。PDK1在Ser386磷酸化后与疏水基序相互作用，去磷酸化逆转了这种相互作用。因此，RSK的疏水基序作为由ERK信号通路诱导的PDK1的磷酸化依赖性对接位点发挥作用。在未刺激细胞中，RSK21–389在Ser386显示出大量磷酸化，而全长RSK2和RSK2375–740没有，这表明CTK结构域在基本条件下掩盖了疏水基序。CTK结构域的激活和Ser386的磷酸化可能导致疏水基序的暴露，使其能够与PDK1相互作用。RSK2中磷酸化Ser386的激酶的特性1–389目前还是个谜。

第三步涉及PDK1的活化和自磷酸化，然后磷酸化NTK结构域中的Ser227。Ser227和Ser369（可能还有Thr365）的磷酸化可能导致RSK2的完全激活。然而，除了为PDK1创建一个对接位点外，Ser386的磷酸化也可能在增强NTK活性方面发挥作用。

与磷酸化疏水基序的相互作用可能诱导PDK1的构象变化，从而刺激其催化活性和自磷酸化。在HEK 293细胞中瞬时表达的PDK1中发现了五个磷酸化位点(Casamayor等人，1999年). 用胰岛素样生长因子-I处理细胞不会改变PDK1的磷酸化，并且其中四个位点可以在不丧失活性的情况下发生突变。然而，位于激活环中的Ser241的磷酸化对活性至关重要，似乎是由PDK1本身催化的。本研究中描述的PDK1活化和自磷酸化机制基于PDK1和RSK2的化学计量相互作用。绘制与RSK2共表达或与pSer386肽孵育的PDK1中的磷酸化位点很有意思在体外并确定其功能。

该模型代表了PDK1调控的一种新机制，其中PDK1与其激酶底物协同激活。对于RSK2，PDK1可能通过Ras–ERK途径间接激活。该机制还为PDK1的作用提供了特异性，因为PDK1被选择性地招募到疏水基序磷酸化的激酶中。最后，该机制可能是有效的，因为它结合了PDK1局部浓度的增加（由募集步骤介导）和PDK1激酶活性的增加（通过相互作用诱导）。

图中概述的模型13被简化了，并且不符合这里和以前的研究中获得的关于RSK激活的所有数据。例如，在未刺激的细胞中，RSK在Ser227被部分磷酸化(Dalby等人，1998年; 另请参见图三). 此外，从非刺激细胞中分离出的RSK可以通过与ERK孵育而显著激活在体外(赵等，1996)，表明（至少部分）Ser227处预先存在的磷酸化。这些观察结果与图中模型之间的差异13如果磷酸化Ser227比其他磷酸化位点对去磷酸化更具抵抗力，则可以解释这一点。这将导致休息细胞中一部分RSK在Ser227被磷酸化，从而能够被ERK激活13可能用于补充自之前接触生长因子以来在该位点已脱磷的RSK部分以及新合成的RSK中Ser227的磷酸化。

针对RSK提出的模型可能适用于PDK1的其他目标。p70 S6激酶在共转染细胞中与PDK1形成复合物(Romanelli等人，1999年). 结合位点尚未确定，但表面等离子共振分析表明，与野生型p70 S6激酶相比，PDK1与疏水基序中的Thr389（相当于RSK2的Ser386）中的谷氨酸表现出更高的亲和力(Balendran等人，1999b). 此外，p70 S6激酶的T389A突变体在激活环的PDK1位点没有磷酸化体内是个穷人在体外PDK1底物与T389E突变体的比较(Dennis等人，1998年). 同样，PDK1对SGK的磷酸化在体外疏水基序中的Ser突变为Asp后显著增强(Kobayashi和Cohen，1999年). 这些发现与p70 S6激酶和SGK中疏水基序以磷酸化依赖的方式招募和激活PDK1的可能性一致。在酵母双杂交筛选中，PRK2的疏水基序被分离为PDK1相互作用片段（PIF）(Balendran等人，1999a). 最近，研究表明，与PIF的相互作用可刺激PDK1的激酶活性4倍在体外(Biondi等人，2000年). 此外，在PDK1的催化域中发现了一个疏水口袋，该口袋与PIF的芳香残基相互作用。该口袋也可能构成PDK1中RSK2的结合位点。PKC的几个异构体与活化环中的PDK1形成复合物并被PDK1磷酸化(Le Good等人，1998年). 非典型类PKC在疏水基序中有一个酸性残基，而经典和新型PKC有一个磷酸化位点，可以作为PDK1的调节对接位点。相反，PDK1可能不会与PKB磷酸化疏水基序对接，因为该位点的突变不会影响PDK1激活环的磷酸化(Alessi等人，1996年).

我们的结果表明，MSK1的NTK被异位PDK1激活，并且对PDK1亲和力增强的MSK1突变体表现出更高的活性。这表明，MSK1可能以类似于RSK2的方式由PDK1调节。然而，小鼠胚胎干细胞中PDK1基因的靶向破坏对MSK1活性没有影响，而RSK的激活被完全消除(威廉姆斯等., 2000). 因此，PDK1对MSK1的NTK磷酸化不是速率限制，至少在胚胎干细胞中是如此。

在最近的一项研究中，报道了一种RSK2突变体，它破坏了CTK中预测的自身抑制α-螺旋，导致与EGF刺激的野生型RSK2的30%相对应的组成活性(Poteet-Smith等人，1999年). 此外爪蟾RSK1是通过删除CTK和NTK N末端尾部的前44个残基生成的(Gross等人，1999年). 未报道其活性与刺激野生型RSK1的比较，但突变体在爪蟾胚胎足以诱导中期停搏。在本研究中，我们产生了RSK2和MSK1突变体，其组成活性为野生型酶对EGF的响应活性的100-300%。我们使用这些突变体证明组蛋白H3在Ser10和CREB在Ser133被磷酸化，这是核RSK2或MSK1活性独立于上游信号通路的结果。

上游激活剂PDK1的本构对接位点的引入是激活RSK2和MSK1截断突变体的有效手段。通过这种策略，我们还生成了具有组成活性的全长MSK1和RSK1 NTK，其活性高于EGF刺激的野生型酶（C.J.Jensen和M.Frödin，未发表的观察结果）。因此，该方法可能普遍适用于生成PDK1调节激酶的组成活性突变体。

通过丝氨酸/苏氨酸磷酸化组装蛋白质复合物已成为信号转导中的一种新的调控机制。类似14-3-3的蛋白质或类似叉头相关（FHA）或色氨酸-色氨酸（WW）结构域的蛋白质模块在激酶和转录因子的特定序列上下文中结合磷丝氨酸或磷苏氨酸（综述于Yaffe和Cantley，1999年). 本研究表明，在疏水基序的背景下识别磷酸丝氨酸会导致PDK1和RSK2之间的可逆复合物，可能还有其他PDK1靶点。RSK2疏水基序的芳香残基可能通过PIF结合囊与PDK1相互作用(比昂迪等., 2000). 在这种情况下，磷酸化Ser386预计位于囊外。确定PDK1中与磷酸化Ser386相互作用的氨基酸，并确定磷酸基团如何赋予结合特异性，这一点非常重要。

材料和方法

磷酸特异性Ab来自Upstate Biotechnology，除了如所述产生的抗pSer227 RSK2 Ab（Merienne等.，已提交）。S6肽（RRLSSLRA）、CREBtide（EILSRRPSYRK）和Ser386肽（小鼠RSK2的373–396残基：KKPPSANAHQLFRGFS公司FVAITSDD，在pSer386肽中有下划线的丝氨酸磷酸化）由K.J.Ross-Petersen，AS，Denmark合成。用于免疫沉淀的抗HA-和抗myc表位Abs分别来自12CA5和9E10小鼠杂交瘤细胞系。用于免疫印迹的抗-HA或抗myc抗体以及RSK2 CTK结构域的抗体是来自Santa Cruz Biotechnologies的兔多克隆抗体。其他化学品来自Sigma。

质体构筑

pMT2中的N-末端HA-标记小鼠RSK2和RSK2-K100A(赵等，1996)由Christian Björbök（马萨诸塞州波士顿Beth Israel医院）提供。N-末端myc标记的PDK151–556在pCMV5中(普伦等人，1998年)由Brian A.Hemmings（瑞士巴塞尔Friedrich Miescher研究所）提供。描述了pCMV5中的Myc-PDK1-KD（K111Q/D205N/D223N）和Myc-PDK1-KD(Jensen等人，1999年). pEXV3-MEK-S217E/S221E由Hugh Paterson（英国伦敦癌症研究所）提供。用PCR扩增EST，产生N-末端HA标记的人MSK1AA158571型来自I.m.a.g.e.Consortium（HGMP Resource Centre，Hinxton，Cambridge，UK）的引物Xho公司I站点和萨尔I位点分别位于MSK1编码区的5′端和3′端。RSK1从pMT2-HA-RSK1（马萨诸塞州波士顿马萨诸塞总医院Joseph Avruch）中移除Xho公司I+类萨尔我消化并用MSK1代替。RSK2和MSK1的缺失突变体是通过PCR扩增所需序列，使用5′端引物引入Xho公司I位点和引入终止密码子和萨尔我的网站。RSK1通过以下方法从pMT2-HA-RSK1中去除Xho公司I+类萨尔我消化并用PCR产物代替。RSK2系列1–389S386D也同样生成，只是3′端引物在386位引入了Asp。相同的程序用于生成RSK21–389带有突变T365E、S369E或T365E/S369E，除了3′端引物包含德拉小鼠RSK2核苷酸1123的III位点及其突变。PCR产物克隆到pMT2-HA-RSK2中1–389用…消化Xho公司I+类德拉三、 RSK2的点突变1–389使用QuickChange™（Stratagene）诱变程序引入S386A和RSK2-S386K、CA-MSK1-KD（D195A）。CA-MSK1由两个PCR产物生成：A和B。A由MSK1扩增产生，5′端引物引入Xho公司MSK1编码区前面的I位点和一个3′端引物，在1094核苷酸处引入DraIII位点。B由人类PRK2（由印第安纳州印第安纳大学医学院Lawrence A.Quilliam善意提供）扩增产生，5′端引物引入德拉PRK2密码子前面的III位点对应于残基968和带有千磅我网站后打开阅读框。A和B被切割Xho公司我+德拉III和德拉三+千磅一、 分别克隆到pMT2-HA载体中Xho公司我+千磅嵌合激酶由MSK1的1–365个残基和PRK2的968–985个残基组成。pMT2-HA-CA-RSK2和pMT2-HA-CA-RSK-KD的生成与CA-MSK1类似，由RSK2的残基1–375和PRK2的968–985组成。对于激酶缺失型，在PCR生成片段A中使用RSK2-K100A作为模板。使用一个包含RSK2核苷酸1131的普通3′端引物和三个重叠的5′端引语，通过三轮PCR生成pmt2-NLS-HA-CA-RSK2，以引入三个重复核定位序列（DPKKRKV）N端至RSK2序列。最后一轮PCR引入了5′端萨尔I位点，PCR产物被切割萨尔我和德拉III，并在RSK2切除后克隆到pMT2-HA-CA-RSK2Xho公司我+德拉三、 pMT2-HA-NLS-CA-RSK2-KD、pMT2-HA-NLS-CA-MSK1和pMT2-HA-NLS-CA-MSK1-KD是通过使用Xho公司我+德拉III使用以下方法切除CA-RSK2-KD、CA-MSK1或CA-MSK1-KDXho公司我+德拉III分别来自pMT2-HA-CA-RSK2-KD、pMT2-HA-CA-MSK1和pMT2-HA-CA-MSK1-KD。所有突变均经序列分析证实。

转染和免疫沉淀

如前所述，使用脂质体试剂（Life Technologies Inc.）培养并转染COS7细胞(Jensen等人，1999年). 用磷酸盐缓冲盐水洗涤后，将细胞溶解在500µl的裂解缓冲液中15分钟（0.5%Triton X-100，150 mM NaCl，50 mM Tris–HCl pH 7.4，10%甘油，1 mM Na三沃4、5 mM EDTA、25 mM NaF、10 nM花萼蛋白A、1 mM苯甲基磺酰基氟化物、10µM亮氨酸蛋白酶、10μM胃蛋白酶抑制素和200激肽释放酶抑制剂单位/ml抑肽酶）。随后的操作在0–4°C下进行。在14000℃下离心10分钟，以澄清细胞提取物克在最后的25分钟内，将上清液与Ab培养75分钟，并添加20µl 50%蛋白A或蛋白G琼脂糖珠（Amersham Pharmacia Biotech）。琼脂糖珠-Ab复合物通过离心沉淀，用裂解缓冲液洗涤五次，排空并溶解在SDS-PAGE样品缓冲液中（2%十二烷基硫酸钠，62 mM Tris pH 6.8，10%甘油，5%2-β-巯基乙醇，0.1%溴酚蓝）。对于激酶分析，最后两次洗涤使用激酶分析缓冲液（30 mM Tris–HCl pH 7.4，10 mM MgCl2，1 mM二硫苏糖醇）。

RSK和MSK分析

用注射器排出含有免疫沉淀激酶的琼脂珠，并重悬于20µl 1.5×激酶测定缓冲液中。通过添加10µl（最终浓度）的ATP（300µM，0.2µCi的[γ-32P] ATP）和800µM S6肽或CREBtide分别用于RSK和MSK分析。在30°C下10 min后（反应与时间呈线性），用注射器除去20µl上清液（留下沉淀的激酶），并将其点在磷纤维素纸（Whatman p81）上，用150 mM正磷酸洗涤5-6次。[32P] 使用ImageQuant™软件（Molecular Dynamics）在STORM™PhosphorImager上对并入蛋白质底物的磷酸盐进行定量。从所有值中减去反应空白（对未转染细胞进行的分析）。

PDK1体外试验

Myc-tagged PDK1在COS7细胞中表达，用9E10 Ab免疫沉淀，然后用注射器吸取带有激酶的琼脂糖珠（每个分析点10-30 ng），并重新悬浮在20µl激酶分析缓冲液a中。此后，在剧烈摇晃下，将PDK1在10µM的室温下与肽（Ser386肽、S6肽）一起或不与肽一起孵育20分钟。通过添加（最终浓度）200µM ATP（用于迁移率变化分析）或20µM三磷酸腺苷（包括15µCi的[γ-32P] 10µl中的ATP（用于放射自显影分析）。在PDK1激酶分析中，通过添加2µg RSK2开始反应1–373K100A或0.5微克RSK21–360或RSK21–360S227E和20µM ATP（[γ]的15µCi-32P] ATP）。在室温下摇晃20分钟后，用SDS-PAGE样品缓冲液停止反应，并进行SDS-PACE，然后对干燥凝胶进行免疫印迹或放射自显影。RSK蛋白的合成和纯化大肠杆菌作为谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合(Jensen等人，1999年). 使用前，用凝血酶消化蛋白质以去除GST。

免疫印迹

按照说明进行免疫印迹(延森等., 1999).

鸣谢

感谢Birte Kofoed提供的专家技术援助。这项工作得到了丹麦诺和诺德基金会、丹麦癌症协会、哥本哈根县、格陵兰岛和法罗群岛医学研究基金会以及丹麦生长与再生研究中心的资助。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团