Identification of a pocket in the PDK1 kinase domain that interacts with PIF and the C-terminal residues of PKA

doi:10.1093/emboj/19.5.979

.2000年3月1日；19(5):979-88.

doi:10.1093/emboj/19.5.979。

PDK1激酶结构域中与PIF和PKA C末端残基相互作用的口袋的鉴定

R M Biondi公司¹, P C Cheung先生, 卡萨马约尔, M Deak先生, R A咖喱, D R阿莱西

附属公司

PMID： 10698939
预防性维修识别码：项目经理305637
内政部： 10.1093/emboj/19.5.979

PDK1激酶结构域中与PIF和PKA C末端残基相互作用的口袋的鉴定

R M Biondi公司等。欧洲工商管理硕士J. 2000.

.2000年3月1日；19(5):979-88.

doi:10.1093/emboj/19.5.979。

作者

R M Biondi公司¹, P C Cheung先生, 卡萨马约尔, M Deak先生, R A咖喱, D R阿莱西

附属

¹英国邓迪DD1 5EH道街邓迪大学MSI/WTB复合体信号转导治疗部。rbindi@bad.dundee.ac.uk

PMID： 10698939
预防性维修识别码：项目经理305637
内政部： 10.1093/emboj/19.5.979

摘要

3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）磷酸化并激活AGC亚家族的许多蛋白激酶。PDK1的激酶域通过疏水基序与蛋白激酶C相关激酶-2（PRK2）的一个区域相互作用，称为PDK1相互作用片段（PIF）。在这里，我们在PDK1激酶结构域的小叶中发现了一个疏水口袋，与ATP和底物结合位点分离，与PIF相互作用。据预测，构成该疏水囊的残基突变会破坏或显著降低PDK1对PIF的亲和力。PIF增加了PDK1磷酸化合成十二肽（T308tide）的速率，与PKB的PDK1磷酸化酶位点周围的序列相对应。该肽是PDK1的不良底物，但包含与PIF的PDK1-结合基序融合的T308肽的肽是PDK1的极为优越的底物。我们的结果表明，PDK1激酶结构域上的PIF-结合囊作为一个“对接位点”，使其能够与底物相互作用并增强其磷酸化。

PubMed免责声明

数字

**图1。**PDK1与PKA野生型和突变型C末端片段的双杂交相互作用。(A类)用融合到Gal4 DNA-结合域（GBD）的表达PDK1的载体，以及编码PIF或野生型的C-末端26残基或PKA（PKA）C-末端片段的指示突变体的载体，转化Y190酵母菌株_{计算机断层扫描}残基129-350）融合到Gal4激活域（GAD）。作为对照，酵母也与单独的GBD结构域和单独的GAD结构域共同转化。酵母在30℃下培养过夜，并在30℃进行4小时的β-半乳糖苷酶过滤提升试验。GBD–PDK1和GAD–PKA之间的相互作用_{计算机断层扫描}诱导β-半乳糖苷酶的表达，该酶在过滤提升分析中被检测为蓝色。(B类)PKA的C端77个氨基酸的氨基酸序列与AGC亚家族激酶的等效区域对齐。相同的残留物用黑色背景上的白色字母表示，类似的残留品用灰色方框表示。疏水基序中的芳香残基以红色表示。

**图2。**C端Phe-Xaa-Xaa-PKA残基与PKA激酶结构域上的疏水囊相互作用，预计在PDK1中保守。(A类)PKA–PKI–ATP三元配合物（Zheng）的带状结构等.，1993年）；PKI以黄色显示，ATP分子突出显示。C端Phe347和Phe350以红色显示。T环中磷酸化-Thr197（PDK1磷酸化位点）的位置显示。(B类)与PKA的C末端Phe-Xaa-Xaa-Phe残基相互作用的PKA激酶结构域上疏水口袋的详细结构。Lys76（相当于PDK1中的Lys115）显示为绿色，Leu116（相当于PDF中的Leu155）显示为黄色，Phe347和Phe350显示为红色，某些胺残基显示为蓝色。(C类)PDK1激酶结构域的结构按照材料和方法中的描述进行建模。PDK1的区域相当于PKA的疏水囊，称为PIF-结合囊。强调了预测与PIF结合有关的残基，包括Q150的酰胺残基。(D类)PDK1的氨基酸残基在PIF-结合囊和PKA的等效区域周围的排列。相同的残留物用黑色背景上的白色字母表示，类似的残留品用灰色方框表示。PKA上与C末端Phe-Xaa-Xaa-Phe基序相互作用的残基用星号标记。

**图3。**PDK1的PIF-结合囊中保守残基突变对PDK1与PIF相互作用能力的影响。用表达GST–PIF和野生型Myc-PDK1或PDK1指定突变体的DNA构建物瞬时转染293细胞。在转染后36小时，通过谷胱甘肽-Sepharose珠亲和层析对细胞进行裂解并纯化GST-PIF。在10%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上电泳每种蛋白质的2μg小份，并用考马斯蓝染色(A类和E类)或使用抗Myc抗体进行免疫印迹检测Myc-PDK1(B类和F类)。为了确定野生型PDK1和突变蛋白的表达水平相似，在10%SDS–聚丙烯酰胺凝胶上电泳10μg总细胞裂解液，并使用抗Myc抗体进行免疫印迹(C类和**G公司**)。显示了每个条件的副本。在三到五个单独的实验中也得到了类似的结果。(D类和**H（H）**)如材料和方法中所述，在BiaCore仪器上进行表面等离子共振测量，以测量野生型和突变型GST–PDK1制剂与24残基合成肽的相互作用，24残基的合成肽序列包含PIF上PDK1结合位点，称为PIF肽（Balendran等.，1999年a）。PIFtide固定在SA传感器芯片上，并以40 nM的浓度注入野生型（wt）或PDK1的指示突变体。所有数据均为代表性实验的单次测定，该实验重复至少三次，结果相似。为了清楚起见，与第一次和最后10秒注入相关的体折射率变化已被去除。

**图4。**PDK1的Leu155突变体在双杂交系统中不与PIF或PKA的C端片段相互作用。将表达野生型PDK1或PDK1指示突变体的载体与编码PRK2（PIF）26个C末端残基或PKA（PKA）C末端片段表达的载体融合到Gal4 DNA-结合域（GBD），转化Y190酵母菌株_{计算机断层扫描}残基129-350）融合到Gal4激活域（GAD）。作为对照，酵母也与仅表达GAD和GBD域的载体共转化。酵母在30℃下培养过夜，并在30℃进行4小时的β-半乳糖苷酶过滤提升试验。GBD–PDK1与GAD–PIF或GAD–PKA之间的相互作用_{计算机断层扫描}诱导β-半乳糖苷酶的表达，在过滤提升试验中检测为蓝色（图中显示为黑色）。

**图5。**PDK1野生型和PIF-结合口袋突变体对PKB Thr308的磷酸化作用。GST-PDK1的野生型或突变型在293细胞中表达，并通过谷胱甘肽-Sepharose珠亲和层析纯化。在存在或不存在含有100μM磷脂酰胆碱、100μM磷脂酰丝氨酸和10μM磷脂囊泡的情况下，将每个GST融合蛋白（0.2 ng）与GST–S473D-PKBα和MgATP在30°C下孵育30分钟锡-1-硬脂酰-2-花生四烯醇-天-铂族锡（3,4,5）P_三GST–S473D-PKBα比活性的增加是相对于省略PDK1的对照培养基测定的（六次测定的平均值，三次独立实验）。GST–S473D-PKBα的基本活性为1.5 U/mg。在所用条件下，已验证GST–473D-PKBβ的激活与添加到分析中的PDK1量成正比（数据未显示）表示省略了PDK1。

**图6。**PDK1通过与PIFtide的相互作用被激活和稳定。(A类)在野生型（wt）PIF肽（•）或突变型D978A-PIF肽浓度增加的情况下测量GST-PDK1活性(○), 如材料和方法中所述，使用名为T308肽的合成肽底物。使用Kaleidrograph软件将数据拟合成双曲线。PDK1 50%活化所需的浓度为0.14μM（wt-PIFtide）和1.1μM（D978A-PIFtied）。所示试验一式三份，每次试验之间的差异<5%。在两个进一步的实验中也得到了类似的结果。(B类)野生型GST-PDK1（圆圈）或GST-PDK1的L155D突变体（正方形）在存在（封闭符号）或不存在（开放符号）100μM PIF潮汐的情况下培养，然后在指定温度下加热2分钟，快速加热至0°C（见材料和方法），2分钟后，以T308tide为底物，在30°C下检测10分钟。在30°C下培养获得的PDK1活性为100%。所示分析重复进行，在两个单独的实验中获得类似结果。

**图7。**PIF肽对PDK1 PIF口袋突变体的影响。在不存在（虚线条）或存在2 mM PIFtide（虚线条状）或35μM PIFtade（填充条状）的情况下，使用T308肽对GST–PDK1的野生型和指示突变体进行分析。在所用条件下，PDK1对T308肽的磷酸化与时间呈线性关系（数据未显示）。(A类)PDK1突变体在缺乏PIFtide和(B类)被高浓度PIFtide激活的突变体。试验一式三份进行，三份样品之间的差异＜10%。在三个单独的实验中也得到了类似的结果。

**图8。**PDKtide作为PDK1的底物远远优于T308tide，因为它与PDK1中的PIF-结合囊相互作用。(A类)以PDK肽的指示浓度作为底物，检测His-PDK1的活性(▵）或T308潮汐(○). (B类)在PDK肽（25μM，▴) 或T308肽（100μM，•），前提是PIF肽的指示浓度。该试验一式三份，三份样品之间的差异小于5%。在三个单独的实验中获得了类似的结果

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

PDK1在衍生自PRK2羧基末端的合成肽存在下获得PDK2活性。
Balendran A、Casamayor A、Deak M、Paterson A、Gaffney P、Currie R、Downes CP、Alessi DR。 Balendran A等人。当前生物量。1999年4月22日；9(8):393-404. doi:10.1016/s0960-9822（99）80186-9。当前生物量。1999 PMID：10226025
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）对接位点是PDK1磷酸化蛋白激酶Czeta（PKCzeta）和PKC相关激酶2所必需的。
Balendran A、Biondi RM、Cheung PC、Casamayor A、Deak M、Alessi DR。 Balendran A等人。生物化学杂志。2000年7月7日；275(27):20806-13. doi:10.1074/jbc。M000421200。生物化学杂志。2000 PMID：10764742
PDK1对PKA多价反磷酸化的嵌合机制。
Romano RA、Kannan N、Kornev AP、Allison CJ、Taylor SS。 Romano RA等人。蛋白质科学。2009年7月；18(7):1486-97. doi:10.1002/pro.146。蛋白质科学。2009 PMID：19530248 免费PMC文章。
细胞内信号传导：PDK1——一种位于事物中心的激酶。
Belham C、Wu S、Avruch J。 Belham C等人。当前生物量。1999年2月11日；9（3）：R93-6。doi:10.1016/s0960-9822（99）80058-x。当前生物量。1999 PMID：10021376 审查。
磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1，一种蛋白质构象传感器。
Biondi RM公司。 Biondi RM公司。生物化学科学趋势。2004年3月；29(3):136-42. doi:10.1016/j.tibs.2004.01.005。生物化学科学趋势。2004 PMID：15003271 审查。

查看所有类似文章

引用人

AGC激酶家族在肺纤维化中的作用和靶向性（综述）。
梅C，陈T，黄X，熊C，陈S，李Y。梅C等人。实验治疗学，2024年3月8日；27(5):190. doi:10.3892/etm.2024.12478。eCollection 2024年5月。《实验医学》，2024年。 PMID：38533431 免费PMC文章。审查。
蛋白激酶作为治疗靶点的最新进展——第二部分：作为变构蛋白激酶C调节剂的肽靶向蛋白质-蛋白质相互作用。
Zerihun M、Rubin SJS、Silnitsky S、Qvit N。 Zerihun M等人。国际分子科学杂志。2023年12月15日；24(24):17504. doi:10.3390/ijms2242417504。国际分子科学杂志。2023 PMID：38139336 免费PMC文章。审查。
一种基本的布氏锥虫蛋白激酶：调节功能分析和抑制剂的鉴定。
Parsons M、Parsons B、Dean M、DeRocher AE、Islam Z、Maly DJ、Jensen BC。 Parsons M等人。前寄生虫。2023;2:1272378. doi:10.3389/fpara.2023.1272378。Epub 2023年11月14日。前寄生虫。2023 PMID：38099268 免费PMC文章。
打开乳腺癌治疗的新途径：激酶抑制剂与免疫治疗的协同作用。
Bravo MJ、Burgos-Molina AM、García-Aranda M、Redondo M、Téllez T。 Bravo MJ等人。癌症（巴塞尔）。2023年11月21日；15(23):5499. doi:10.3390/cancers15235499。癌症（巴塞尔）。2023 PMID：38067203 免费PMC文章。审查。
动力子是HIV-1蛋白酶构象动力学进化的最明显标志。
Rahimi M、Taghdir M、Abasi Joozdani F。 Rahimi M等人。科学报告2023年8月30日；13(1):14179. doi:10.1038/s41598-023-40818-x。科学代表2023。 PMID：37648682 免费PMC文章。

查看所有“被引用”文章

工具书类

1. Alessi D.R.和Downes，C.P.（1998）PI 3-激酶在胰岛素作用中的作用。生物化学。生物物理学。Acta，1436151-164年。-公共医学
1. Alessi D.R.、Cohen，P.、Ashworth，A.、Cowley，S.、Leevers，S.L.和Marshall，C.J.（1994）丝裂原活化蛋白激酶、MAP激酶和Raf的测定和表达。方法酶学。，255, 279–290.-公共医学
1. Alessi D.R.、Andjelkovic M.、Caudwell B.、Cron P.、Morrice N.、Cohen P.和Hemmings B.A.（1996）胰岛素和IGF-1激活蛋白激酶B的机制。EMBO J.，第15期，6541–6551页。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Alessi D.R.等（1997年a）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）：与果蝇DSTPK61激酶的结构和功能同源性。货币。生物学，776–789。-公共医学
1. Alessi D.R.、James S.R.、Downes C.P.、Holmes A.B.、Gaffney P.R.、Reese C.B.和Cohen P.（1997年B）磷酸化并激活蛋白激酶Bα的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶的表征。货币。生物学，7261–269。-公共医学

出版物类型

行动

MeSH术语

行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动

物质

行动
行动
行动
行动
行动
行动

LinkOut-更多资源

[1] Alessi D.R.和Downes，C.P.（1998）PI 3-激酶在胰岛素作用中的作用。生物化学。生物物理学。Acta，1436151-164年。-公共医学

[2] Alessi D.R.和Downes，C.P.（1998）PI 3-激酶在胰岛素作用中的作用。生物化学。生物物理学。Acta，1436151-164年。-公共医学

[3] Alessi D.R.、Cohen，P.、Ashworth，A.、Cowley，S.、Leevers，S.L.和Marshall，C.J.（1994）丝裂原活化蛋白激酶、MAP激酶和Raf的测定和表达。方法酶学。，255, 279–290.-公共医学

[4] Alessi D.R.、Cohen，P.、Ashworth，A.、Cowley，S.、Leevers，S.L.和Marshall，C.J.（1994）丝裂原活化蛋白激酶、MAP激酶和Raf的测定和表达。方法酶学。，255, 279–290.-公共医学

[5] Alessi D.R.、Andjelkovic M.、Caudwell B.、Cron P.、Morrice N.、Cohen P.和Hemmings B.A.（1996）胰岛素和IGF-1激活蛋白激酶B的机制。EMBO J.，第15期，6541–6551页。-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Alessi D.R.、Andjelkovic M.、Caudwell B.、Cron P.、Morrice N.、Cohen P.和Hemmings B.A.（1996）胰岛素和IGF-1激活蛋白激酶B的机制。EMBO J.，第15期，6541–6551页。-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Alessi D.R.等（1997年a）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）：与果蝇DSTPK61激酶的结构和功能同源性。货币。生物学，776–789。-公共医学

[8] Alessi D.R.等（1997年a）3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）：与果蝇DSTPK61激酶的结构和功能同源性。货币。生物学，776–789。-公共医学

[9] Alessi D.R.、James S.R.、Downes C.P.、Holmes A.B.、Gaffney P.R.、Reese C.B.和Cohen P.（1997年B）磷酸化并激活蛋白激酶Bα的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶的表征。货币。生物学，7261–269。-公共医学

[10] Alessi D.R.、James S.R.、Downes C.P.、Holmes A.B.、Gaffney P.R.、Reese C.B.和Cohen P.（1997年B）磷酸化并激活蛋白激酶Bα的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶的表征。货币。生物学，7261–269。-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

PDK1激酶结构域中与PIF和PKA C末端残基相互作用的口袋的鉴定

附属

PDK1激酶结构域中与PIF和PKA C末端残基相互作用的口袋的鉴定

作者

附属

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

其他

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

相关信息

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

其他