基因表达调控的一个新概念是，在mRNA内部发现了一组不同的修饰核苷酸，这些修饰构成了一个外转录密码。上转录组的最初概念是通过转录体宽映射引入的N个6-甲基腺苷（m6A） ，这表明6在所有的mRNAs中，至少有四分之一的mRNA中发现了A，通常位于终止密码子附近1,2值得注意的是，腺苷甲基化形成m6A可以是可逆的。FTO和AlkB家族成员5（ALKBH5）都对含有m6A（参考三,4). 因此，外显子-密码子可能是高度动态的，并且受到影响mRNA功能的可逆碱基修饰的影响。
除了内部碱基修饰外，mRNAs的5′端还含有被认为是组成性的甲基修饰。mRNA的生物生成包括N个7-甲基鸟苷（m7G） 在信使核糖核酸的5′端用三磷酸连接子封端。mRNA也在第一个（有时是第二个）与mRNA相邻的核糖糖的2′-羟基位置甲基化7G盖5,6这些修饰招募翻译起始因子到mRNA，并允许细胞区分宿主和病毒mRNA7.
虽然扩展的5′cap结构包含这些固定的甲基修饰，但Moss及其同事的早期研究表明，在多达30%的mRNA caps中可以检测到一个额外的甲基修饰8如果m后面的第一个核苷酸7G帽为2’-O（运行）-甲基腺苷（A米)，它可以在N个6-未知核质甲基转移酶的定位9形成N个6,2′-O（运行）-二甲基腺苷（m6A类米) ()8.自2′-O（运行）-甲基化通常在第一个核苷酸处检测到，mRNA可以有A米或m6A类米作为第一个核苷酸，但不是A或m6A（参考。10). m的函数6A类米未知。
FTO倾向于m6A类米到m6A作为基底一，修改延伸的mRNA帽。与m相邻的第一个核苷酸（此处显示为腺苷）7G和5′-到5′三磷酸（ppp）连接剂受到2′-O（运行）-核糖甲基化（橙色），形成cap1。盖子1可以再长2英尺-O（运行）-在第二个核苷酸处甲基化形成cap2（未描述）。2′-O（运行）-甲基腺苷（A米)可通过以下方式进一步转换为cap1mN个6-甲基化（蓝色），导致N个6，2′-O-二甲基腺苷（m6A类米).b条，FTO有效地转换m6A类米至A米.带有5′-m的合成寡核苷酸7百万英镑6A类米（2μM）与FTO（100 nM FTO，1 h）孵育，FTO很容易转化M6A类米至A米（代表性高效液相色谱（HPLC）跟踪n个=3个生物复制品）。mAU，毫吸光度单位。c（c），FTO优先脱甲基m6A类米与m相比6A.带有5′-m的寡核苷酸7百万英镑6A类米cap以等摩尔比与含有内部m的寡核苷酸混合6A.FTO（100 nM，1 h）几乎完全转换为m6A类米至A米.m脱甲基6A未检测到（代表性的HPLC轨迹n个＝3个生物重复）。d日m的FTO的Michaelis-Menten动力学6A类米和m6A.由于FTO与m的活性增加6A类米与m相比6A、 m的酶浓度低10倍6A类米（m为20 nM FTO6A类米m，200 nM FTO6A） ●●●●。将数据标准化为酶浓度（m7百万英镑6A类米（蓝色），m7GpppACm公司6A（橙色），内部m6A（绿色）；n个=3个生物复制品；平均值±标准误差；V（V）0=初始反应速度）。
这里我们显示，延伸的mRNA帽携带动态和可逆的上转录信息。我们发现6A类米在与m相邻的生理环境中7G盖可以很容易地转换为A米按FTO在体外和体内此外，我们证明了m6A类米，而不是m6A、 是FTO的优选细胞基质。使用m的转录宽图6A类米，我们发现m6A类米转录本明显比以A开头的mRNA更稳定米或其他核苷酸。m的操作6A类米FTO耗竭或FTO过度表达导致选择性控制m的丰度6A类米-细胞中含有mRNA。我们发现6A类米转录物的稳定性部分是由于对mRNA-decaping酶DCP2的耐药性。m的意义6A类米-通过检测细胞中依赖DCP2的mRNA降解过程，如微RNA诱导的mRNA退化模式，可以观察到介导的mRNA稳定。这些发现表明cap相关的修饰核苷酸m6A类米是一种动态可逆的外转录原子修饰，使哺乳动物细胞中的mRNA具有稳定性。
FTO去甲基化物m6A类米单位：m7G盖相关方式
确定FTO是否可以瞄准m6A类米我们测量了FTO介导的5′m长21核苷酸RNA的去甲基化7G帽后跟m6A类米FTO处理容易转换m6A类米至A米，表明在N个6-位置(,). 接下来，我们将FTO（100 nM）添加到m的等摩尔混合物中6A类米RNA和含有m的RNA6生理学共识中的A。FTO几乎使所有m脱甲基6A类米60分钟内，而m6未轻易检测到去甲基化().
m脱甲基6只有使用更高浓度的FTO（200 nM）才能容易地检测到A，这与之前的报告一致，之前的报告使用的底物和酶的比例为5:14然而，m的去甲基化6A类米FTO大大减少（20 nM）(,). 所报告的k个猫FTO的m6与相关的加氧酶相比，A相对较低(). 然而k个猫FTO朝向m6A类米至少高出20倍（k）加利福尼亚州吨/K（K）米)FTO的约100倍高，接近m6A类米比m6A类(,).
FTO对m的活动6A类米取决于延伸m的特定结构元素7G盖。FTO介导的m脱甲基6A类米在m时受损7G被替换为G，当m7G被完全移除(). 当三磷酸缩短为一磷酸时，脱甲基作用进一步减少。值得注意的是，2′-O（运行）-甲基取代物，用于区分m6A类米来自m6A、 对FTO的脱甲基活性也很重要。相比之下，FTO介导的甲基化6A在不同的序列上下文中表现不佳().
质谱证实FTO介导的m去甲基化6A类米至A米(). 然而，除了A米,N个6-羟甲基，2′-O（运行）-甲基腺苷（hm6A类米)也检测到。FTO活动对m的先前分析6A表明，FTO介导的脱甲基通过羟甲基化中间体发生13因此，FTO介导m的去甲基化6A类米可能会产生包含氧化5′端帽的额外帽多样性。
米6A类米mRNA在细胞中的半衰期增加
确定m是否6A类米对mRNA具有独特的影响，我们首先根据mRNA是否以m开头对其进行分类6A类米，A米, 2′-O（运行）-甲基胞苷（C米), 2′-O（运行）-甲基鸟苷（G米)或2′-O（运行）-甲基尿苷（U米). 以m开头的mRNA6A类米由miCLIP识别12(补充表1). miCLIP映射的m6A类米残基的验证基于它们与转录起始位点的重叠以及它们在与核心启动子基序匹配的序列上下文中的优先定位16(,补充表1). 不含m的mRNA6A类米被认为以A开头米，C米，G米或U米基于注释的起始核苷酸(补充表2).
接下来，我们询问mRNA稳定性是否与第一个核苷酸的身份有关。以A开头的信使核糖核酸米，C米，G米和U米HEK293T细胞的半衰期分布非常相似，平均约为6小时(). 然而，以m开头的mRNA6A类米明显更稳定，半衰期平均增加约2.5小时(,,补充表3). m之间的链接6A类米并且在检查m6A和m6A类米miCLIP读取长期和短期mRNA().
m的存在6A类米与mRNA半衰期增加有关一，mRNA的稳定性由HEK293T细胞中的第一个编码核苷酸决定。以m开头的mRNA半衰期累积分布图6A类米，A米，C米，G米和U米(n个=2515（米6A类米); 762（甲米); 1442（C米); 1119（G米); 1486（U米); 数据表示两个独立数据集的平均值；每个框显示第一个四分位、中间值和第三个四分位数；晶须代表1.5×四分位范围；采用Tukey事后检验的单向方差分析***对≤ 2 × 10−8与m相比6A类米;N个米=A米，C米，G米或U米).b条，mRNA表达水平受HEK293T细胞第一编码核苷酸的修饰状态影响。以m开头的mRNA表达的累积分布图6A类米，A米，C米，G米和U米(n个=2536（米6A类米); 1063（A）米); 2098（摄氏度米); 1577（G米); 2071（U米); 数据表示两个独立数据集的平均值；每个框显示第一个四分位、中间值和第三个四分位数；晶须代表1.5×四分位范围；采用Tukey事后检验的单向方差分析***对≤ 2.2 × 10−16与m相比6A类米).c（c），FTO表达导致m的整体减少6A类米HEK293T细胞mRNA半衰期。含有m的mRNA半衰期的变化6A类米或A米在转染Flag载体（Ctrl）或带有N末端核输出信号（NES-FTO）的FTO的细胞中(n个=2049（米6A类米); 951（A米); 1442（C米); 1119（G米); 1486（U米); 数据表示两个独立数据集的平均值；每个框显示第一个四分位、中间值和第三个四分位数；晶须代表1.5×四分位范围；采用Tukey事后检验的单向方差分析**对≤4.6×10−3与m相比6A类米).d日,自由贸易组织击倒导致全球m增加6A类米HEK293T细胞中的mRNA。含有m的mRNA的表达6A类米或A米在上面自由贸易组织击倒(n个=3410（米6A类米); 1355（安米); 2636（C米); 1994年（G米); 2558（U米); 数据表示两个独立的mRNA表达数据集的平均值；每个框显示第一个四分位、中间值和第三个四分位数；晶须代表1.5×四分位范围；Tukey事后检验的单因素方差分析**对≤ 7.4 ×−3米6A类米与A相比米和U米).
我们推断，如果6A类米稳定mRNA，这将导致m增加6A类米mRNA水平。的确，我6A类米mRNA的转录水平高于以A开头的mRNA米，C米，G米或U米(). 虽然增加的表达水平可能受到转录率的影响，但半衰期数据表明，mRNA稳定性的增加有助于mRNA丰度的增加6A类米信使核糖核酸。总之，这些数据表明第一个核苷酸是mRNA稳定性和丰度的重要决定因素。
此外，m6A类米mRNA可以提高翻译效率(). 这与之前的一项研究一致，该研究观察到转录起始位点含有甲基化腺嘌呤的mRNA的翻译效率提高17.
讨论
这里我们确定m6A类米作为一种动态和可逆的表转录组标记。与信使核糖核酸内部存在表转录组修饰的概念相反，我们发现5′帽含有决定信使核糖核酸命运的表转录组信息6A类米在延长的cap中增加了mRNA的稳定性，而A米与基线稳定性相关。米6A类米长期以来，人们都知道转录组中大部分mRNA帽被普遍修饰8，使其成为细胞mRNA中第二流行的修饰核苷酸6A类米因此可以影响转录组的很大一部分。
可逆碱基修饰的概念很有吸引力，因为它增加了通过打开和关闭修饰来决定mRNA命运的可能性6A类米“橡皮擦”和形状A米在单元格中。FTO存在于细胞核中，它可能在那里去甲基化核RNA和新合成的mRNA。细胞质m脱甲基6A类米mRNAs可能由诱导FTO胞质易位的刺激物诱导。
FTO对m的特异性6A类米细胞内FTO的耗竭增加了m6A类米相对于A的mRNA水平米mRNA，而m6含A的信使核糖核酸在很大程度上不受影响。尽管FTO倾向于m6A类米，高水平的FTO过度表达导致m6特定mRNA中的A水平23此外，早期的一项研究报告称，总米数略有增加6以下细胞系中的A水平自由贸易组织击倒4.米6FTO耗尽的细胞中的测量由于FTO耗尽导致m6A类米mRNA表达水平，可导致m6A级。较高的mRNA表达也会导致m6由于检测m的随机性导致的峰值调用6低丰度mRNA的修饰24.
在我们最近开发单核苷酸分辨率m之前6A和m6A类米映射技术12，米6地图无意中包含m6A类米误报为m的站点6A.这些较旧的技术应更准确地指定为6mA映射（即甲基化碱），以反映其无法区分m6A类米和m6A.类似地，m6免疫印迹和m6A-IP qRT-PCR无法区分m6A和m6A类米我们发现Fto公司-敲除转录组11在5′UTR中富集，可能反映FTO调节的m6A类米地点。据报道，5′UTR峰值在m6关于Fto公司-小鼠成纤维细胞缺陷25这些峰的5′UTR富集表明，这些残基也可能反映了m6A类米.
鉴于FTO对m的优先活动，应重新考虑以往关于FTO的研究6A类米.FTO与mRNAs剪接的改变有关，这可能表明mRNA的作用6A类米在这个过程中26.自由贸易组织击倒增加了热休克蛋白A123,25尽管定点突变支持5′UTR m的作用6A在这个mRNA的翻译中25，米6A类米由于其对FTO的敏感性，也可能促成这种效应。FTO缺乏小鼠表现出不同的表型，从生长迟缓到代谢变化和大脑奖励途径异常11,27.人类自由贸易组织功能丧失突变表现为生长迟缓和畸形28.自m起6A类米mRNA富含与RNA剪接、翻译和代谢相关的功能类别()，这些途径的改变可能导致FTO缺乏的生理效应。
DCP2是mRNA帽修饰状态的“读取器”，因此有助于mRNA帽的稳定性6A类米信使核糖核酸。米6A类米损伤mRNA去盖，呈现m6A类米mRNA对microRNA介导的mRNA降解不太敏感。因此，m6A类米可能是导致细胞中对microRNA的mRNA反应的变异性知之甚少的原因29.
m的影响6A类米与m的对比6A.当m6A类米表现出稳定作用，m6A与增强的mRNA降解有关（参考。30). 然而，两者都是m6A类米和m65′UTR中的A残基与翻译增加有关23表明5′UTR中这些不同甲基化形式的腺苷增强了翻译起始。因此，修饰核苷酸的位置和腺苷残基上甲基的特定组合对mRNA编码不同的功能后果。
方法
没有使用统计方法预先确定样本量。这些实验不是随机化的，研究人员在实验和结果评估期间也没有对分配盲视。
合成寡核苷酸的合成与表征
本研究中使用的所有寡核苷酸序列如所示补充表4.含有N个6-甲基腺苷（m6A） TriLink BioTechnologies在DRACH环境下合成。
所有其他合成的RNA寡核苷酸均在ABI 394 DNA合成器（Applied Biosystems）上进行化学组装，该合成器采用商用长链烷基胺控孔玻璃（LCAA-CPG）固体载体，孔径为1000Ω，通过5′琥珀酰连接剂衍生-O（运行）-二甲氧基三烷基-2′-O（运行）-Ac-uridine（链接技术）。所有RNA序列都是在扭曲寡核苷酸合成柱（Glen Research）中使用1μmol规模的磷酰胺化学方法从市售2′-O（运行）-新戊酰氧基甲基酰胺（5′-O（运行）-DMTr-2′-O（运行）-PivOM-[U，C交流电，A派克靴或G派克靴]-3′-O（运行）-(O（运行）-氰乙基-N、 N个-二异丙基磷酰胺）31（Chemgenes）。5′末端腺苷可以是未修饰的A，也可以在2′-OH（A）中甲基化米)，或在中N个6位置（m6A） 或在两个位置（m6A类米). 5′-O（运行）-DMTr-2′-O（运行）-甲基丙烯酸甲酯派克靴-3′-O（运行）-(O（运行）-氰乙基-N、 N个-使用二异丙基磷酰胺（Chemgenes）引入A米在RNA的5′末端。用于产生m6A-RNAs或m6A类米-RNA，m的制备6A和m6A类米磷酰胺构建块是通过商业上可获得的2′的选择性一步甲基化来实现的-O（运行）-PivOM-Pac-A-CE磷酰胺或2′-O（运行）-分别为Me-Pac-A-CE磷酰胺。所有寡核苷酸的合成均使用PivOM方法学的固相RNA合成标准协议32.
RNA组装后，5′末端腺苷（A）的5′-羟基：A，A米，米6A或m6A类米仍然固定在固体载体上的RNA序列被磷酸化H（H）-磷酸衍生物被氧化并活化为磷酰咪唑衍生物，与焦磷酸反应（用于ppp（a）-RNA合成）33或二磷酸鸟苷（用于Gppp（A）-RNA合成）34.获得m的单磷酸盐6A类米-RNA（μm6A类米-RNA），5′-H（H）-用以下物质的混合物处理膦酸盐RNAN个,O（运行）-乙腈中的双三甲基乙酰胺和三乙胺，然后用第三种-丁基过氧化氢溶液35.
在基本条件下（DBU然后在37°C下氨水处理4小时），脱保护并从固体载体中释放后，通过IEX-HPLC纯化所有RNA序列36，它们获得了高纯度（>95%），并通过MALDI-TOF光谱法进行了明确的表征(补充表4).
N个7纯化的Gppp（A）-RNA甲基化产生m7使用人信使核糖核酸鸟嘌呤定量进行Gppp（A）-RNA-N个7-甲基转移酶和S公司-如前所述的腺苷蛋氨酸34.
FTO酶性质的测定在体外
基本上如前所述进行了脱甲基测量4，但所有反应均在37°C下进行。脱甲基活性测定在20-50μl反应混合物中进行，反应混合物中含有指定数量的合成RNA寡核苷酸或mRNA、指定数量的FTO、75 mM（NH4)2Fe（硫氧化物）4)2300mMα-酮戊二酸、2mM L-抗坏血酸钠、150mM KCl和50mM HEPES缓冲液，pH 7.0。将反应在37°C下孵育指定时间，通过添加1 mM EDTA进行猝灭，然后在95°C下将酶失活5分钟。
HPLC分析样品制备
在FTO脱甲基后，在37°C下用25单位RppH（NEB）在ThermoPol缓冲液中脱去寡核苷酸2 h。随后在37°C下，用180单位S1核酸酶（Takara）将RNA消化成单核苷酸1小时。在37°C下，用5单位rSAP（NEB）去除5′磷酸盐1小时。在将样品加载到HPLC柱上之前，使用10kDa截止过滤器（VWR）通过尺寸排除色谱去除蛋白质。
去甲基化活性的HPLC分析
核苷的HPLC分析在安捷伦1100系统（安捷伦技术公司）上进行。在配备EC-C18保护筒（安捷伦技术公司）的Poroshell 120 EC-C18柱（4μm，150×4.6 mm，安捷伦科技公司）上在22°C下进行分离。流动相包括缓冲液A（25 mM NaH2警察4)和缓冲液B（100%乙腈）。使用ChemStation软件（Rev.A.10.02，build 1757，Agilent Technologies）实现了泵控制和峰值集成。样品在2ml min时进行分析−1具有以下缓冲A/B梯度的流速：7.5 min 95%/5%，0.5 min 90%/10%，2 min 10%/90%，1 min 95%+5%。用合成标准物测定单个核苷的保留时间（腺苷（A）为3.2分钟，2′为5.8分钟-O（运行）-甲基腺苷（A米)，5.9分钟N个6-甲基腺苷（m6A） ，7.9分钟N个6,2′-O（运行）-二甲基腺苷（m6A类米). 鸟苷被用作内部对照。在将每个峰面积归一化为鸟苷峰面积的面积后，基于输入寡核苷酸的序列确定每个样品中单个核苷酸的相对和绝对量。
质谱样品制备
米6A类米脱甲基中间体的生成基本上如前所述13不同的是，所有反应都是在37°C下进行的。将带帽寡核苷酸与100 nM FTO在37°C下孵育10分钟，然后用2个单位的P1核酸酶消化15分钟。值得注意的是，P1核酸酶不会裂解带帽的三磷酸连接物，因此会特异性地释放m7百万英镑6A类米二核苷酸，同时将RNA主干消化为单核苷酸。保存不稳定的脱甲基中间体13，立即将核苷酸混合物冷冻在液氮中，直到进一步分析。
质谱法检测脱甲基中间体
FTO反应产物用冷80%甲醇：H萃取2O，体积比为1:20。去除沉淀蛋白后，将4μl上清液注入LC/MS中，以准确测量脱甲基中间体的质量。LC/MS-MS系统由安捷伦1260型生物-插入无限液相色谱系统和安捷伦iFunnel 6550四极飞行时间质谱仪组成。反应产物在Cogent Diamond Hydride（ANP）色谱柱（2.1×150 mm，3.5μm粒径；Microsolv Technology Corp）上使用正水相（ANP，水梯度分离）进行色谱分析。在ANP柱前放置一个预柱过滤器（0.5μm，Microsolv），以防止柱堵塞。流动相包括：（A）50%异丙醇，含0.025%乙酸；和（B）含有5 mM醋酸铵的90%乙腈。为了消除金属离子对色谱峰完整性和电喷雾电离的干扰，在流动相中添加EDTA，最终浓度为6μM。采用以下梯度：0-1.0 min，99%B；1.0-15.0分钟，至20%B；15.0–29.0分钟，0%B；29.1-37分钟，99%B。为了最大限度地减少ESI源中的潜在盐和其他污染物，设置了一个时间段，以指示前0.5分钟的柱洗脱浪费。
在2 GHz（扩展动态范围）模式下采集剖面模式和质心模式下的负离子质谱，在20–1000道尔顿的质量/电荷范围内以每秒1个光谱的速度扫描。QTOF毛细管电压设置为3500 V，碎片设置为140 V。雾化器压力为35 p.s.i.，氮气干燥气体为200°C，以14 l min的流速输送−1.鞘气温度为350°C，鞘气流量为11 l min−1使用安捷伦MassHunter定性分析软件（B6.0版）分析原始数据。剖面数据用于提供测量质量。
细胞培养和动物
HEK 293T/17（ATCC CRL-11268；传代号3-10；未进一步验证细胞系身份）细胞保存在含有10%FBS和抗生素（100单位ml）的DMEM（11995-065，ThermoFisher Scientific）中−1青霉素和100μg ml−11链霉素）。根据制造商的说明，使用TrypLE Express（生命科技）分离细胞。Hoechst染色常规检测细胞内支原体污染。获得胚胎期（E）14天Fto公司-敲除小鼠胚胎和肝脏，Fto公司-基因敲除小鼠是按照前面描述的方式培育的27。本研究仅使用雄性动物。所有涉及小鼠的实验都得到了威尔康奈尔医学院动物护理和使用委员会的批准。
抗体
用于免疫印迹分析或免疫染色的抗体如下：兔抗DDDDK/Flag（ab1162，Abcam）、兔抗FTO（ab124892，Abcam）、兔抗GAPDH（ab9485，Abcam）、小鼠抗ALKBH5（ab69325，Abcan）、小鼠（β-actin（A2228，Sigma）和山羊抗兔IgG Alexa Fluor 546（A11035，ThermoFisher Scientific）。对于m6单个核苷酸分辨交联和免疫沉淀（miCLIP），兔抗m6使用了A（ab151230，Abcam）。使用室内产生的兔抗DCP2血清来检测DCP2。
HEK293T细胞敲除和过度表达研究
自由贸易组织和ALKBH5型在HEK293T细胞中使用肽基转染试剂（Signagen）或脂质体RNAiMAX（ThermoFisher Scientific）进行敲除实验，其中20 nM dsiRNA双链直接针对HEK293细胞自由贸易组织（HSC.RNAI.N001080432.12.1，集成DNA技术）或50 nM Silencer Select siRNA双链池靶向ALKBH5型（s29686、s29687、s29688，赛默飞世尔科技公司）。干扰siRNA用作非靶向对照。
使用LipoD293转染试剂（Signagen）在HEK293T细胞中进行FTO和ALKBH5表达实验，该转染试剂带有Flag标记的全长人类野生型FTO、在N端含有Flag标签和两个核输出信号（NES）的人类野生型FTO、缺乏66个N端氨基酸的GST标记的ALKBH1、，或相应的控制矢量。
细胞保持在70-80%的汇合状态，转染后48-72小时收获。western blot证实敲除和过度表达。根据制造商的说明，使用TRIzol（ThermoFisher Scientific）分离总RNA。如果需要，根据制造商的说明，使用寡核苷酸d（T）25磁珠（NEB）从总RNA中富集两轮poly（A）mRNA。
HEK293T细胞的免疫染色
转染有标记全长人类野生型FTO或在N端含有两个核输出信号（NES）的人类野生型FTO的HEK293T细胞生长在涂有聚-d-赖氨酸的盖玻片上，盖玻片用4%多聚甲醛固定在PEM缓冲液中（80 mM钾PIPES，5 mM EGTA，2 mM MgCl）2，pH 7.0）孵育10分钟，并在PEM缓冲液中用0.5%Triton X-100透化30分钟。用1%BSA在TBS-T中封闭1小时后，将细胞与抗DDDDDK/Flag抗体（在1%BSA TBS-T中1:1000稀释）孵育2小时，然后与山羊抗兔IgG抗体（在1%BSA TBS-T中1:1000稀释）孵育1小时。细胞核用DAPI染色。所有免疫染色步骤均在室温下进行。使用NIS-Elements AR软件（3.2版）在尼康Eclipse Ti显微镜（尼康）上进行图像采集。
的生成数据中心2CRISPR敲除细胞
数据中心2-通过CRISPR/Cas9技术，使用两个导向RNA（gRNAs；5′-UAUCAGACUAUUUUGUA-3′和5′-AACCAGUUUCAAAG ACC-3′）生成敲除细胞系，以靶向数据中心2与其催化位点相对应的基因组区域。将与gRNAs相对应的双标记DNA寡核苷酸插入pSpCas9n（BB）-2A-Puro载体（Addgene）。使用FuGENE 6（Promega）将等量的两个gRNA质粒混合并转染到HEK293T细胞。然后对转染细胞进行三天的嘌呤霉素筛选，并使用活细胞进行连续稀释，以生成单细胞克隆。通过PCR和测序筛选基因组修饰。在数据中心2-敲除系1，这两个等位基因分别在V145和I153之后被破坏以产生框外突变。第2行包含一个55 nt纯合子缺失，删除了内含子4和外显子5之间的剪接位点。3号线包含一个194nt缺失的等位基因，该等位基因删除了内含子4和外显子5之间的剪接位点，另一个等位基因在V145后被破坏，产生帧外突变。用自制抗DCP2血清进行western blot证实DCP2蛋白表达缺失37.
蛋白质表达和纯化
N末端HIS标记的人类FTO是通过基于PCR的标准克隆策略生成的，其身份通过对FTO进行测序进行确认，如前所述4，稍作修改。FTO在大肠杆菌BL21-罗塞塔（DE3），使用pET-28（+）（Novagen）。用0.5 mM异丙基（3-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在18°C下诱导表达FTO的细胞16 h。收集细胞，造粒，然后将其重新悬浮在缓冲液A（50 mM NaH）中2警察4pH 7.2，300 mM NaCl，20 mM咪唑-HCl，pH 7.2，5 mM（3-巯基乙醇）。细胞通过超声波分解，然后在10000℃下离心克用泰龙金属亲和树脂（Contech）纯化可溶性蛋白20分钟，并在缓冲液B（50 mM NaH）中洗脱2警察4pH 7.2，300 mM NaCl，250 mM咪唑-HCl，pH 7.2，5 mMβ-巯基乙醇）。使用Amicon Ultra-4自旋柱（Merck-Millipore）进行进一步浓缩和纯化。重组蛋白在-80°C下储存在酶存储缓冲液（20 mM HEPES pH 8.0，50 mM NaCl，10%甘油）中。所有蛋白质纯化步骤均在4°C下进行。
相对m的测定6A类米，A米和m6薄层色谱法测定A水平
内部m水平6如前所述，通过薄层色谱（TLC）测定mRNA中的A4简而言之，在37°C下，在存在RNasin RNase抑制剂（Promega）的情况下，用2单位RNase T1（ThermoFisher Scientific）消化聚（A）RNA（100 ng）2小时。T1在每一个鸟苷后切割，暴露出以下核苷酸的5′-羟基，这些核苷酸可以是A、C、U或m6A.因此，该方法量化了m6GA序列上下文中的。随后用10单位的T4 PNK（NEB）和0.4 mBq[γ]标记5′端-32P] ATP在37°C下培养30分钟，然后用10单位Apyrase（NEB）在30°C下孵育30分钟，去除ATP的γ-磷酸。在酚氯仿提取和乙醇沉淀后，RNA样品重新悬浮在10μl DEPC-H中2O，并在37°C下用2单位P1核酸酶（Sigma）消化成单核苷酸3小时。如前所述，在玻璃支撑的PEI-纤维素板（MerckMillipore）上通过2D TLC对该消化物中释放的1μl 5′-单磷酸盐进行分析14.
检测m的协议6A类米：A米该比率基于Fray及其同事制定的方案14，进行了一些修改。Poly（A）RNA（1μg）用于检测。根据制造商的说明，使用30单位的T4多核苷酸激酶（PNK，NEB）和1 mM ATP磷酸化游离5′-OH末端。用2个单位的终止子5′-磷酸依赖性核酸外切酶（Epicenter）消化5′磷酸化RNA片段。封顶RNA不受这种治疗的影响。在酚氯仿萃取和乙醇沉淀后，将RNA样品重新悬浮在10μl DEPC-H中2O和400ng的RNA在37°C下用25个单位的RppH（NEB）去帽3小时。通过添加5个单位的rSAP（NEB）去除暴露的帽相邻核苷酸的5′磷酸盐，并在37°C下进一步孵育30分钟。到目前为止，所有酶反应都是在超酶核糖核酸酶抑制剂（ThermoFisher Scientific）的存在下进行的。在酚氯仿萃取和乙醇沉淀后，将RNA样品重新悬浮在10μl DEPC-H中2O和5′端用30单位T4 PNK和0.8 mBq[γ-32P] ATP在37°C下保持30分钟。PNK在65°C下热失活20分钟，反应通过P-30自旋柱（Bio-Rad）去除未合并同位素。然后用4个单位的P1核酸酶（Sigma）在37°C下消化10μl标记的RNA 3小时。如前所述，在玻璃支撑的PEI-纤维素板（MerckMillipore）上通过2D TLC对该消化物中释放的4μl 5′-单磷酸盐进行分析14.
使用200μm分辨率的存储荧光屏（GE Healthcare Life Sciences）和ImageQuantTL软件（GE Healthcare Life Sciences）进行信号采集。使用ImageJ（V2.0.0-rc-24/1.49 m）进行量化。对于m6A类米实验，m6A类米：A米计算比率。此比率的使用已在前面介绍过14我们通过对样品材料进行两次斑点检测，并确认未修饰核苷酸（A、C和U）的信号强度加倍，从而确认该分析是线性的。此外，选择TLC板在荧光屏上的曝光时间，以便信号不饱和。对于m6A定量，m6如前所述，A被计算为A、C和U点总数的百分比4。每个单独样品的相对比率的使用很重要，因为它减少了因可能的负载差异而产生的误差。尽量减少培养条件对测量m的影响6A类米/A类米每个实验组的比率（例如，对照组与敲除组），所有复制品均并行处理，以最小化所比较样品之间的任何变异来源。值得注意的是，siRNA转染和质粒转染的控制条件使用不同的转染试剂，这可能会影响基线m6A类米/A类米比率。
体外去盖试验
22个核苷酸的长RNA寡核苷酸，具有A，A米，米6A或m6A类米在其5′端用带有[α-32P]（P）-N个7-三磷酸甲基鸟苷（m7GTP）如前所述38根据参考文献进行脱盖反应。38简而言之，在去盖缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mM KCl，2 mM MgCl2，2 mM DTT，0.5 mM MnCl2，40 U毫升−1重组核糖核酸酶抑制剂），并在37°C下培养30分钟。在指定的时间点用25 mM EDTA停止反应。将20 nM重组人DCP2蛋白在37°C下放置30分钟，确认所示改良cap腺苷的去盖产物的特性为7在37°C下，在0.5 mM ATP存在下，用0.5 U核苷二磷酸激酶（NDPK）处理30分钟的GDP。如前所述，以鸟苷作为第一个核苷酸的帽标记RNA38作为阳性对照。通过PEI纤维素TLC板（Sigma-Aldrich）解析去壳产物，并在0.45M（NH4)2SO公司4在室温下的TLC室中。使用分子动力学磷成像仪（Storm860）和ImageQuant-5软件对反应产物进行可视化和定量。
具有特定形式甲基化帽的mRNA的合成
生成以m开头的mRNA7GpppA公司米或m7百万英镑6A类米，我们使用了耐热TGK聚合酶39通过DNA模板中的RNA引物实现RNA合成。引物含有m7GpppA公司米或m7百万英镑6A类米作为延伸帽。TGK聚合酶和特定甲基化形式的引物的使用确保了所有合成的mRNA都以所需的延伸帽结构开始。使用pNL1.1通过PCR制备RNA合成的DNA模板[恩卢克]载体（Promega）作为模板和Phusion高纯度PCR主混合物（NEB）。由于模板需要是单链的，我们采用了选择性降解PCR产物的一条链的策略。为了实现这一目的，用5′-磷酸化正向引物和5′-OH反向引物进行PCR。将不需要的5′-磷酸化链在37°C下用lambda核酸外切酶（Lucigen）（每1–2μg双链DNA 1 U）消化2 h。通过苯酚-氯仿萃取和单链模板的乙醇沉淀停止消化。
RNA正向合成是从7GpppA公司米（20 nt）或1 m7百万英镑6A类米50μl反应中的（20 nt）引物，包括1×Thermopol缓冲液（NEB），补充3 mM MgSO4和2.5 mM NTP，每种引物/模板比为1:1，100 pmol，150 nM TGK聚合酶。在94°C下进行两个周期的引物延伸，分别为10 s、1 min和1 h。RNA合成后，使用TURBO DNase（Thermo Fisher Scientific）降解模板DNA链，并使用RNeasy柱（Qiagen）纯化带帽nLuc mRNA。使用A-Plus poly（A）聚合酶拖尾试剂盒（Cellscript）添加约250 nt的poly（A）拖尾。根据制造商的说明，用寡核苷酸d（T）25磁珠（NEB）纯化聚腺苷化mRNA。
信使核糖核酸电穿孔
交付m7GpppA公司米-nLuc和m7百万英镑6A类米-nLuc mRNA进入HEK293T细胞，我们使用电穿孔。将HEK293T细胞进行胰蛋白酶消化，并在5×10的Ingenio电穿孔溶液（Mirus）中重新悬浮6细胞ml−1将.100μl细胞悬液添加到2μg mRNA中。使用程序Q-001使用Nucleofector II（Amaxa）进行电穿孔。将细胞悬浮液立即转移到37°C预加热的生长培养基中，并添加5 mM CaCl2和200 U ml−1微球菌核酸酶（Clontech）。在37°C下培养15分钟以去除任何残留的细胞外RNA后，将细胞转移到1.25×10的24孔板上5培养直至粘附。然后立即或在孵育2小时后收集细胞，用于RNA提取并通过qRT-PCR进行定量。
转录抑制后的RNA半衰期测量
转录抑制后的RNA半衰期基本上如前所述确定40,41为了实现mRNA半衰期计算的转录抑制，Flag和NES-FTO转染的HEK293T细胞要么未经处理（即0 h时间点），要么用放线菌素D（Sigma）处理6 h，最终浓度为5μg ml−1然后使用TRIzol（Thermo Fisher Scientific）采集细胞进行RNA分离。在分离mRNA和RNA-seq之前，用ERCC RNA对照物（Ambion）对来自Flag和NES-FTO转染的HEK293T细胞的总RNA进行加标（见下文）。使用STAR校准器生成读取计数表42.设计243用于计算ERCC尖峰RNA大小因子，然后将其用于归一化每个复制中的库大小变化。如所示，转录抑制实验得出的半衰期在独立重复之间显示出高度相关性。
用5-溴尿嘧啶（BrU）脉冲相测量RNA半衰期
通过BrU脉冲相进行RNA半衰期测量基本上如前所述44简单地说，用150μM 5-溴尿苷（Santa Cruz Biotechnology）对HEK293T细胞进行24 h的脉冲处理。通过改变含有1.5 mM尿苷（Sigma）的培养基来启动Chase，并在6和16 h后收集细胞进行RNA提取。不含尿苷酶的BrU脉冲细胞用作基础（0 h）对照。根据制造商说明，使用TRIzol试剂（赛默飞世尔科技公司）提取总RNA。如前所述，从总RNA中进行BrU标记RNA的免疫沉淀44BrU标记的NanoLuc萤光素酶（nLuc）RNA通过在体外如前所述的转录44并用作免疫沉淀控制中的峰值，每1μg输入RNA 10 pgp。
定量实时PCR
根据制造商的说明，使用高容量cDNA试剂盒（Thermo Fisher Scientific）逆转录1-2μg总RNA或500 ng BrU标记RNA。在ViiA 7 Realtime PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上使用TaqMan基因表达分析（Thermo-Fisher科学），使用TaqMan基因表达主混合物（Thermo-Fisher科学）对cDNA进行实时定量PCR分析。本研究中使用了以下预先设计的Taqman基因表达分析：FUCA1公司（Hs00609173_m1），MAGOHB公司（Hs00970279_m1），PCNA公司（Hs00427214_g1），PCK1型（Hs01572978_g1），PSMD3系统（Hs00160646_m1），SCFD2型（Hs00293797_m1）。
ACTB公司用（Hs01060665_g1）作为看家基因，使转染的nLuc mRNA水平正常化。设计定制探针和引物集检测nLuc cDNA（正向5′-ATGCGATCTTCAGCCAATTT-3′；反向5′-GGA-GGTGTCCAGTTTT-3′；探针5′-/56-FAM/ATCCAAAGGATTC CTGAGCGGT/3IABkFQ/-3′）。nLuc cDNA的扩增线性超过7个数量级。第2个-ΔΔC吨该方法用于计算时间点和生物复制之间的相对基因表达变化。
米6A峰值富集分析
米6A峰是基于我们之前对Fto公司-敲除中脑组织11.用于分析m6A峰值分布，m6根据峰值在mRNA中的位置将其单独装箱，并在后基因分析中映射到虚拟转录物上，以显示其在mRNA内的集体分布。选择的装箱数使每个装箱平均为50个核苷酸长。使用样条函数平滑峰值计数。我们通过与免疫沉淀样品中MeRIP-seq读数相对应的系数对每个峰进行加权，该读数与免疫沉淀前获得的读数相对应。该峰值质量值代表甲基化mRNA在个体m6免疫沉淀后的一个位点，反映mRNA在特定m处甲基化的程度6一个网站。为了生成峰高比图，我们使用了Fto公司-敲除峰质量大于野生型峰质量。所有分析均使用相同的料仓数量和尺寸。
m的映射和验证6A类米地点
进一步增加基于miCLIP的m检测数量6A类米站点，我们使用了miCLIP管道12进行了以下修改。如前所述，对原始miCLIP读取的3′适配器进行修剪和解复用12然后，使用pyCRAC工具套件（版本1.2.2.3）的pyDuplicateRemover.py脚本删除相同序列的PCR重复读取。使用Bowtie（版本1.1.1）将唯一读取映射到hg19。对齐读取的文件使用samtools（1.2版）、bedtools（2.25.0版）和自定义bash命令进行处理，以导出每个对齐读取的5′端。然后，使用CIMS软件包的tag2cluster.pl脚本将读取的5′端坐标合并到基因组中每个单核苷酸的“堆”中45（参数：-v-s-maxgap“-1”）。然后过滤菌堆，使其在单个核苷酸处至少含有五个5′端。使用自定义的perl脚本将相邻的堆（零核苷酸分开）聚集在一起。使用自定义perl脚本和自定义bash命令，使用其转录ID和转录区域（5′UTR、CDS或3′UTR）对生成的簇进行注释。注释后，对注释mRNA的5′UTR中发现的聚类进行筛选。为了消除噪声，使用自定义bash命令删除宽度为一个核苷酸的簇。最后，使用自定义bash命令来筛选仅在5′UTR的最开头找到的集群。
为了验证这些确实是m6A类米残留物，我们利用了m6A类米仅发生在转录起始位点（TSS）。因此，我们比较了已知的TSS和转录起始序列6A类米-包含区域。从公布的CAGE-seq数据集确定TSS的全基因组位置16和一致启动子基序YYANW（Y=C或T，N个=A、 C、G或T，W=A或T）46，使用了自定义perl脚本。该数据集中的CAGE位点是由多个细胞系和组织的RLE（相对对数表达）归一化稳健CAGE-seq分析组合而成的，因此为检测转录起始位点提供了高灵敏度。
然后我们确定了TSS或YYANW序列在m左右的分布6A类米-包含区域。为此，我们使用床具套件中的“最近”工具来确定每米之间的距离6A类米-包含区域和最近的TSS或YYANW序列。使用以下命令查找最接近每个m中最长5′核苷酸的TSS或YYANW序列6A类米-包含区域。
测量与m重叠的TSS或YYANW序列的距离6A类米-包含区域：
bedtools最近-a m6A.reference.points.bed-b feature.locations.bed-s>m6A.distance.overlapp.bed
测量不与m重叠的TSS或YYANW序列的距离6A类米-包含区域：
最接近的床具-a m6A.reference.points.bed-b TSS.locations.bed-s-io>m6A.feature.distance.bed
TSS或YYANW序列到m的距离的总分布6A类米-然后将包含区域（与重叠无关）绘制为直方图。
这些结果表明，TSS和YYANW核心起始序列在m处高度聚集6A类米-包含地区。这表明所谓的m6A类米-包含区域反映真实的转录起始位点。所有新识别的m6A类米mRNA列于补充表1与CAGE和启动器重叠。值得注意的是，m6A类米场地不同于最近描述的5′UTR m6A站点23因为它们是在不同的序列环境中发现的，并且与转录起始位点重叠12此外，上述体外米1A至m6转换不太可能在m期间生成人工制品6映射。米1A至m6转换需要极端条件47miCLIP或MeRIP-seq中未使用的。此外，m6注释m处未检测到峰值128S rRNA中的一个位点12，表示没有检测到m1A至m6miCLIP期间发生转换。
目前，不可能确定m的绝对化学计量比6A类米或A米mRNA在转录水平的第一个位置。可以想象，如果m的化学计量比6A类米不是特定m上的100%6A类米-分类mRNA，m的作用6A类米可能被低估了。对于使用BrU脉冲相位标记的实验，我们试图检测具有高化学计量比m的mRNA6A类米作为化学计量的替代物，我们在围绕5′m的20 nt窗口中测量了miCLIP/RNA-seq比率6A类米使用床具覆盖的区域。对于BrU脉冲期实验中的qRT-PCR分析，检查NES-FTO表达时单个mRNA半衰期的变化，m6A类米选择miCLIP/RNA-seq比率高的mRNA(补充表5).
基于第一核苷酸的mRNA分类
在我们比较m的实验中6A类米-起始mRNA到A米-，C米-，G米-和U米-启动mRNA，我们根据注释TSS中的核苷酸对mRNA进行分类。注释TSS从Ensemb BioMart数据库中提取48。转录本的完整列表及其相应的注释转录起始点见补充表2.
使用miCLIP读取进行元基因分析
对于，我们生成了高覆盖率m6HEK293T细胞中单个核苷酸分辨率交联和免疫沉淀（miCLIP）数据集12。Metagenes是使用内部perl注释管道和自定义R脚本为miCLIP识别的独特6mA读取构建的。简而言之，6mA读数被映射到人类基因组（hg19）的不同RNA特征（5′UTR、CDS和3′UTR）。读取的位置被标准化为标签映射到的RNA的中位数特征长度。通过计数虚拟信使核糖核酸转录物上相邻仓中的读数数量来生成频率分布图，其特征长度表示每个单独样品或对照样品的分析中的信使核糖核酸的中值特征长度。绘制了核密度（高斯）估计值。
RNA-seq分析
为了避免潜在的克隆变异，106将来自三个DCP2 CRISPR系的细胞汇集在一起（称为数据中心2-敲除细胞），传代一次，立即用于RNA-seq。使用RiboMinus真核生物系统v.2（Life Technologies）对DCP2 CRISPR系RNA样品进行核糖体RNA消耗，然后使用Illumina TruSeq RNA样品制备试剂盒v.2制备cDNA文库。RUCDR Infinite Biologics（Piscataway）根据制造商的协议，使用Illumina Hiseq 2500进行测序（2×100-bp配对-end）。针对每种情况对两个独立的生物复制品进行测序。用于miCLIP标准化的RNA-seq文库（参见“6A类米使用与miCLIP中使用的克隆策略类似的克隆策略准备12,49.
对于所有其他RNA-seq分析，总RNA稀释至50 ngμl的浓度−1并提交给Weill Cornell Medicine Epigenomics Core，以使用Illumina TruSeq Straded mRNA文库准备试剂盒（RS-122-2101，Illuminia）分离mRNA和文库准备。在Illumina HiSeq 2500仪器上，以单读或配对模式对这些库进行测序，每次读取50-100个碱基。每个条件下至少有两个独立的生物复制品被测序。
使用STAR测量基因表达42使用DESeq2管道处理的读取计数（版本2.4.1；-quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts）43（版本1.8.1）或RSEM管道50（版本1.2.25）。RNA-seq数据集的分析和可视化是使用RStudio（0.99.489版）定制内部生成的R脚本进行的。分析中只包括标准化读取计数>1的转录本。
当前研究中使用的先前发布的RNA-seq数据集是从基因表达总表（GEO，NCBI）中提取的，如果没有可用的处理数据，则使用上述管道重新分析fastq文件。mRNA半衰期数据是根据我们自己的HEK293T细胞数据集得出的衰变率计算的，或者是从之前公布的HeLa细胞半衰期数据库中提取的40。根据第一个编码核苷酸的身份，我们在mRNA半衰期分析中仅使用半衰期在0小时到25小时之间的mRNA。对于短寿命和长寿命mRNA的分类，半衰期值被划分为四分位。最低四分位数（0-3小时）的信使核糖核酸被定义为短命，而最高四分位数（10-24小时）的信使核糖核酸被定义为长寿。分析DICER公司-和AGO2公司-m的击倒效应6A类米mRNA是使用先前公布的数据集进行的20.我们用了m6A类米在小鼠肝脏中映射12为了与这些数据集中的小鼠肝脏表达分析相一致。如有必要，我们将分析局限于靶向扫描靶向microRNA-binding位点的mRNAs，且上下文评分截止值≤0.1（参考文献。51). 非目标mRNA筛选出含有3′UTR大小≤300 nt的mRNA，以减少分析具有替代3′UTRs或替代多聚腺苷化位点的mRNA的可能性。单个microRNA转染对mRNA表达的影响分析6A类米利用先前公布的miR-155双转染HeLa细胞的数据集进行mRNA检测21在这些实验中，我们根据starBase v.2.0将分析局限于CLIP支持的microRNA-mRNAs相互作用52.
核糖体分析
确定m6A类米与翻译效率的变化有关，我们分析了之前发表的核糖体图谱数据集53核糖体足迹读取和相应的RNA-seq读取基本上按照所述进行处理54首先，使用Flexbar v.2.5修剪适配器。对于核糖体足迹，只保留剪掉适配器的读数。bowtie v.1.1.2删除了核糖体RNA的读数映射。然后，使用STAR v.2.5.2a以splicing软件的方式将剩余的读取数据与hg19基因组进行比对，并使用UCSC refSeq作为转录模型数据库（2014年6月2日的版本从Illumina iGenomes下载）。允许两次不匹配，只报告了唯一的比对。然后使用自定义R脚本对转录物区域进行比对读取，仅考虑具有注释的5′和3′UTR的转录物。翻译效率的计算如前所述21预过滤至少有十次计数读取的抄本。
统计和软件
对使用双尾非配对学生的吨-或者，对于两个以上组的比较，先进行单因素或双向方差分析，然后进行Bonferroni或Tukey的事后检验。通过计算重复之间的皮尔逊相关系数来评估半衰期和翻译效率测量值的再现性。协变量对m效应的影响6A类米-与非mRNA相比，含有mRNA6A类米利用SPSS统计软件（IBM，v.22）通过ANCOVA分析研究mRNA对mRNA半衰期的影响。协变量包括mRNA确定AU-rich、GU-rich和U-rich元素的数量55，基因表达（log2[FPKM]，FPKM>1），翻译效率（log2[TE]，TE>0），5′和3′UTR的GC组成和长度，5′与3′UTRs的外显子数量，保守miRNA靶点数量(对计算机断层扫描> 0)56，最小自由能与长度之比57，以及5′UTR中G-四联体的数量58,59GC组成、UTR长度和外显子数量由来自UCSC基因组浏览器的refseq mRNA注释（hg19）计算。对0.05或更低的值被认为是显著的。使用Graphpad Prism软件（5.0f版）通过非线性回归曲线拟合分析酶动力学的初始反应速度，以获得k个c（c）在,K（K）米和V（V）最大值。基因本体（GO）功能注释使用PANTHER过度表示测试（20150430版）和Bonferroni校正进行对阈值<0.01。非m6A类米-包含mRNA的基因被用作背景基因列表。
代码可用性
本研究中使用的自定义Perl和R脚本可向相应作者（S.R.J.）索取。
