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.2015年11月5日；163(4):999-1010.
doi:10.1016/j.cell.2015.10.012。 Epub 2015年10月22日。

5'UTR m（6）A促进Cap独立翻译

凯特·D·梅耶 1, Deepak P Patil公司 1, 周军（音） 2, 亚历山德拉·齐诺维耶夫 三, 马克西姆·A·斯卡布金 三, Olivier Elemento公司 4, 塔季亚纳·佩斯托瓦五世 三, 钱树兵 2, 萨米·贾弗里 5
附属公司

5'UTR m（6）A促进Cap独立翻译

凯特·D·梅耶等。 单元格. .

摘要

蛋白质翻译通常始于43S核糖体复合体被帽结合复合体募集到mRNA的5'帽。然而，一些转录物通过不太了解的机制以cap依赖的方式翻译。这里，我们证明在其5'UTR中含有N（6）-甲基腺苷（m（6）A）的mRNA可以以cap依赖的方式翻译。单个5'UTR m（6）A直接结合真核生物起始因子3（eIF3），这足以招募43S复合体，在没有帽结合因子eIF4E的情况下启动翻译。抑制腺苷甲基化选择性地减少含有5'UTR m（6）A的mRNAs的翻译。此外，热休克后Hsp70 mRNA中m6 A水平的增加调节其cap依赖性翻译。值得注意的是，我们发现不同的细胞应激诱导m（6）a在转录体范围内的重新分布，导致带有5'UTR m（6。

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数字

图1
图1。5′UTR米6A使核糖体在不存在帽结合蛋白的情况下与mRNA结合
（A） 5′UTR甲基化允许在没有第4组eIF的情况下形成48S起始复合物。体外转录的、编码MVHC四肽并含有a或m的有帽mRNA6A与纯化的哺乳动物翻译起始成分孵育。随后使用放射性标记引物进行的指纹分析显示是否形成了48S引发复合物。起始密码子、全长cDNA和48S复合体的位置显示在面板的侧面。Lanes C/T/A/G描述了相应的DNA序列。当使用非甲基化mRNA时（1-5通道），只有当存在帽结合复合物eIF4F时才形成48S复合物（通道2和3）。当eIF4F缺失时，非甲基化mRNA上48S复合物的形成受损（通道4和5）。然而，当mRNA与m6使用5′UTR中的A，即使在没有eIF4F的情况下也能观察到48S复合物的形成（泳道9和10；与存在eIF4F的泳道7和8相比）。（B） eIFs1、1A和3是有效m所必需的6A诱导帽非依赖性48S复合物的形成。如（A）所示，使用A-或m-6如图所示，含有A的mRNAs，并且存在各种翻译起始成分。米6在没有eIF4F的情况下，含A的mRNA表现出强大的48S复合物组装，而含A的m RNA则没有（比较通道1和7）。高效m6A介导的48S复合物组装也依赖于eIFs1和1A的存在，这与这些蛋白质在促进扫描和AUG识别方面的已知作用一致（将通道1与通道2、4和5进行比较）。删除eIF3还取消了m上的48S复杂程序集6含有A的mRNA（比较通道1和2），表明mRNA需要eIF36A介导的48S复合物形成。添加60S亚基、eIF5、eIF5B、eEF1H、eEF2和aa-tRNAs导致终止密码子处出现与终止前复合物相对应的趾纹，这表明在终止密码子中，mRNA与终止前复合体相对应6A级招募的48S综合体功能齐全（6号车道）。（C） 脚趾印迹分析中遗漏eIF2会导致缺少48S复合物（比较通道2和3），这表明在m6含A的mRNA。
图2
图2。米65′UTR内的A使mRNA的Cap独立翻译
（A） 5′UTR米6A允许mRNA翻译而不需要帽结合蛋白eIF4E。体外翻译是使用HeLa细胞提取物与荧光素酶编码混合进行的，有帽mRNA包含a或m6A.通过量化荧光素酶活性来测量蛋白质产量。在eIF4E存在的情况下，甲基化和非甲基化mRNA均观察到Cap依赖性翻译。然而，当eIF4E不存在时，只有m6翻译含A的mRNA（n=4；平均值±SD；***p<0.0001）。（B） 存在5′帽模拟无法消除m6A诱导的mRNA翻译。荧光素酶mRNA的翻译如（A）所示。将1 mM游离帽类似物（m7GpppG）添加到隔离帽结合蛋白中。添加m7GpppG可以消除非甲基化mRNA的cap依赖性翻译（左），但不能消除mRNA诱导的cap依存性翻译6A（右）。荧光素酶活性水平显示为相对于capped mRNA+10 pmole eIF4E（n=3；平均值±SD；*p<0.01，**p<0.001）。（C） 使用含有A或50%m的荧光素酶编码mRNA进行体外翻译6A和带有或不带有所示的5’盖。虽然非甲基化、有帽mRNA+10 pmole eIF4E被稳健翻译，但未甲基化、无帽mRNA无法翻译。然而，m6即使不存在5′cap，含A的mRNA也能有效翻译（n=3；平均值±标准差；*p<0.01）。（D） 米6编码序列中的A残基不会诱导帽非依赖性翻译。如所示，编码含有天然β-珠蛋白5′UTR或含有零、一或三个a残基的修饰β-珠蛋白5′UTR的未修饰萤光素酶的mRNA用于体外翻译测定。m的翻译65′UTR中含有零A残基的A的mRNA显著减少，表明编码序列m6A残基不能诱导cap依赖性翻译。然而，当单个m6A被添加到5′UTR中，转录本被稳健翻译。甲基化的5′UTR在5′端、中间（中间）或3′端附近具有单个a，其翻译水平均相似（n=3；平均值±SD；**p<0.001，**p<00001，***p<0.00001）。示意图显示了A残基在每个β-珠蛋白5′UTR变体中的分布（未修饰的β-珠蛋白质5′UTR包含17个A残基）。（E） 单个m的mRNA6A在5′UTR内，无m6正如转录本的其余部分诱导cap依赖性翻译。未封闭的、荧光素酶编码的mRNAs，包含单个腺苷5′-单磷酸（AMP）或N个6-甲基腺苷5′-单磷酸（m6AMP）5′端，用于体外翻译。只有m6含A的mRNA被翻译，证明单个5′端m6残基能够诱导cap依赖性翻译（n=3；平均值±SD；**p<0.001）。与具有内部甲基化5′UTR的mRNA相比，该mRNA的翻译效率降低可能是由于mRNA的低效掺入导致的6T7 RNA聚合酶5′端的A残基。另请参见图S1。
图3
图3。米6A-中介翻译通过5′端依赖机制进行
（A） 使用capped，m6含有β-珠蛋白5′UTR序列的含A mRNA，该序列被修改为包含两个AUG起始密码子（示意图中的“AUG1”和“AUG2”）。大多数48S复合物在AUG1组装，AUG2检测到的48S复合体水平可以忽略不计。（B） 无盖、A-或m6编码GFP的含A的mRNA用于体外翻译。mRNA包含两个近kozak起始密码子：AUG 1编码全长GFP蛋白，内部定位的AUG2编码包含GFP C末端部分的帧内截断（~17kDa）蛋白。通过western blot测定全长和截短GFP蛋白水平（箭头所示的大小）。米6A主要促进全长蛋白的翻译，但不能诱导AUG2的内部进入介导翻译。核糖体蛋白RPS6的水平显示为负荷控制。（C） （B）中全长GFP蛋白水平的量化显示甲基化mRNA相对于非甲基化mRNA的蛋白表达增加（n=3；平均值±SD；**p<0.001）。（D） 在5′UTR至块5′端入口的开始处存在一个稳定的发夹，严重减弱了m6A介导的翻译（n=3；平均值±标准差；*p<0.01）。另请参见图S1。
图4
图4。43S复杂成分eIF3结合m6A类
（A） 指示的蛋白质/蛋白质复合物与放射性标记的A-或m-孵育6含A的RNA探针和交联。然后用RNase I去除未结合的RNA，用SDS-PAGE分离蛋白质，并检测放射性标记的RNA。eIF1、eIF1A、eIF2和40S核糖体亚基对甲基化RNA没有优先交联。然而，eIF3制剂在约60 kD、80 kD和110–160 kD的条带上表现出与甲基化RNA的强交联，这与eIF3复合物的多个亚基相对应，如图所示。（B） 如（A）所示，使用体外翻译试验中使用的HeLa细胞提取物进行交联试验。使用抗eIF3a或eIF3b抗体对eIF3复合物进行免疫沉淀，并检测到含有交联RNA的蛋白质。两种eIF3抗体都沉淀了优先与m交联的蛋白质6RNA。使用兔和鼠IgG控制抗体的免疫沉淀显示为阴性对照。所示蛋白质的蛋白质印迹表明其在免疫沉淀后富集（底部）。整个输入通道中有25%的材料是为IP通道装载的。另请参见图S2和S3。
图5
图5。细胞mRNA中的eIF3结合位点定位于m的位点6A 5′UTR内的残留物
（A） 显示了eIF3 PAR-iCLIP（浅蓝色）和单核苷酸分辨率m的读取簇6四种代表性mRNA的映射（Linder等人，2015）（miCLIP；red）(EIF4A3型,H3F3C型,SQLE公司、和IER5标准). eIF3a PAR-iCLIP读取集群与m具有高度特定的重叠65′UTR内内部位置的映射簇。这种共定位是5′UTR特有的，因为mRNAs含有多个m6CDS或3′UTR中的残基未能在这些位点显示eIF3a结合（例如IER5标准). 红色星号表示单个m的位置6以单核苷酸分辨率确定的位点。（B） eIF3与细胞mRNA的5′UTR结合6依赖A的方式。用GFP或F过度表达质粒转染HEK293细胞，并进行eIF3免疫沉淀以分离eIF3结合的mRNA。用5′UTR特异性引物RT-qPCR定量结合mRNA。含有高水平m的mRNA的5′UTR6在Fto过度表达后，A与eIF3的结合减少。不包含m的5′UTR6Fto过表达后，A的eIF3结合没有变化（n=3；平均值±SEM）。另请参见图S4和S5。
图6
图6。米6A调节压力诱导的翻译热休克蛋白70
（A） m的耗尽6甲基转移酶METTL3降低5′UTR m mRNA的TE6A.使用表达METTL3或对照siRNAs的HeLa细胞的核糖体分析数据（Wang等人，2015）来确定由单核苷酸分辨率m6映射。与非甲基化mRNAs（蓝色）相比，含有m6编码序列（CDS）或3′UTR（绿色）中的残基在TE中只表现出轻微的减少。然而，含有m的mRNA65′UTR内的A（红色）显示TE大幅降低。p值采用Mann-Whitney检验进行计算。（B） 各类m级TEs6如（A）所述，使用来自HeLa细胞的核糖体分析数据集分析含A的mRNA。图中所示为m的mRNA的TE（siMETTL3/siControl）平均倍数变化6A残基仅存在于5′UTR（红色）、3′UTR内（紫色）、终止密码子50 nt内（黄色）、CDS和/或3′UTR-内（绿色）或所有mRNAs（蓝色）中，如单核苷酸分辨率m所定义6映射。具有5′UTR m的mRNA6METTL3缺失后，A残基的TE显著降低，而m残基的转录本6与其他地区一样，没有显示出这种效果。如箭头所示，所有非化学对照mRNA计算的平均折叠变化减去背景后，计算所有平均折叠变化TE值（平均值±SEM；*p<0.05）。（C）Fto公司击倒增加了热冲击诱导的热休克蛋白70.MEF细胞稳定表达Fto公司shRNA或干扰shRNA受到热休克应激。在热休克后的不同时间收集细胞裂解物（“HS后”），然后用所示抗体进行蛋白质印迹分析。Fto公司与对照shRNA相比，敲除增加了应激诱导的Hsp70蛋白水平（“S exp”=短期暴露；“L exp”表示长期暴露）。另一种热休克诱导蛋白Hsp25的水平不受Fto公司击倒。右侧面板显示归一化为β-actin的Hsp70水平的量化（n=3；平均值±SEM；**p<0.1）。（D） MEF稳定地表示控制或Fto公司shRNA受到如（C）所示的热休克应激。使用蔗糖梯度分馏（左图）分离多聚体级分，然后进行RT-qPCR热休克蛋白70（右上面板）和Gapdh公司（右下角面板）。热休克蛋白70以下多糖组分中的水平增加Fto公司击倒，而Gapdh公司保持不变（n=3；平均值±SEM；热休克蛋白70：p=0.0007，双向方差分析；Gapdh公司：p=0.3722，考虑整个时间点范围的双向方差分析）。（E） MEF细胞被GFP或Fto慢病毒感染，并受到热休克应激。在热休克后的不同时间收集细胞裂解物，然后用所示抗体进行蛋白质印迹分析。与GFP过表达相比，Fto过表达降低了热休克诱导的Hsp70蛋白水平。Hsp25的水平不受Fto过度表达的影响。右侧面板显示归一化为β-actin的Hsp70水平的量化（n=3；平均值±SEM；*p<0.5）。（F） 无论是否有Fto过度表达的MEF都会受到热休克应激，如（E）所示。采用蔗糖梯度分馏法（左面板）分离多糖组分，然后进行RT-qPCR热休克蛋白70（右上面板）和Gapdh公司（右下角面板）。热休克蛋白70Fto过度表达后，多糖组分中的水平降低，而Gapdh公司保持不变（n=3；平均值±SEM；热休克蛋白70：p<0.0001，双向方差分析；Gapdh公司：p=0.1910，考虑整个时间点范围的双向方差分析）。另请参见图S5和S6以及表S1。
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    1. des Georges A，Dhote V，Kuhn L，Hellen CU，Pestova TV，Frank J，Hashem Y.哺乳动物eIF3在43S起始前复合体中的结构。自然。2015;525:491–495.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Dominissini D、Moshitch-Moshkovitz S、Schwartz S、Salmon-Divon M、Ungar L、Osenberg S、Cesarkas K、Jacob-Hirsch J、Amariglio N、Kupiec M等。m6A-seq揭示的人和鼠m6A RNA甲基体拓扑。自然。2012;485:201–206.-公共医学
    1. 吉尔伯特·W·V。思考细胞内部核糖体进入的其他方法。生物化学杂志。2010;285:29033–29038.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Gingras AC、Raught B、Sonenberg N.eIF4启动因子：核糖体mRNA募集效应器和翻译调节器。生物化学年度收益。1999;68:913–963.-公共医学

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