Perturbation of m6A writers reveals two distinct classes of mRNA methylation at internal and 5' sites

doi:10.1016/j.celrep.2014.05.048

.2014年7月10日；8(1):284-96.

doi:10.1016/j.celrep.2014.05.048。 Epub 2014年6月26日。

m6A写作者的扰动揭示了内部和5'位点上两类不同的mRNA甲基化

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¹麻省理工学院和哈佛大学博德学院，美国马萨诸塞州剑桥02142。
²麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；怀特海生物医学研究所，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；麻省理工学院生物系，美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
^三麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学科学部免疫学研究生项目，邮编02115。
⁴怀特海生物医学研究所，美国马萨诸塞州剑桥02142。
⁵麻省理工学院布罗德学院和哈佛大学，剑桥，马萨诸塞州，邮编02142；哈佛大学干细胞研究所和干细胞与再生生物学系，美国马萨诸塞州剑桥市，邮编02138。
⁶怀特海生物医学研究所，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；美国马萨诸塞州波士顿布鲁克林大道450号达纳-法伯癌症研究所放射肿瘤学系，邮编02215。
⁷麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；美国马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院免疫学和炎症疾病中心，邮编02129。
⁸麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；美国麻省理工学院麦戈文脑研究所，马萨诸塞州剑桥市，邮编02139；美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院脑与认知科学与生物工程系，邮编02139。
⁹麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；麻省理工学院生物系，剑桥，马萨诸塞州02139，美国；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院系统生物学系02114电子地址：lander@broadinstitute.org。
¹⁰麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；麻省理工学院生物系，剑桥，马萨诸塞州02139，美国；霍华德·休斯医学院，美国马里兰州20815，Chevy Chase，Jones Bridge路4000号。电子地址：aregev@broad.mit.edu。

PMID： 24981863
预防性维修识别码：项目经理4142486
内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2014.05.048

m6A写作者的扰动揭示了内部和5'位点上两类不同的mRNA甲基化

施拉加·施瓦茨等。单元格代表. 2014.

.2014年7月10日；8(1):284-96.

doi:10.1016/j.celrep.2014.05.048。 Epub 2014年6月26日。

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¹麻省理工学院和哈佛大学博德学院，美国马萨诸塞州剑桥02142。
²麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；怀特海生物医学研究所，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；麻省理工学院生物系，美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
^三麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学科学部免疫学研究生项目，邮编02115。
⁴怀特海生物医学研究所，美国马萨诸塞州剑桥02142。
⁵麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；哈佛大学干细胞研究所和干细胞与再生生物学系，美国马萨诸塞州剑桥市，邮编02138。
⁶怀特海生物医学研究所，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；美国马萨诸塞州波士顿布鲁克林大道450号达纳-法伯癌症研究所放射肿瘤学系，邮编02215。
⁷麻省理工学院布罗德学院和哈佛大学，剑桥，马萨诸塞州，邮编02142；美国马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院免疫学和炎症疾病中心，邮编02129。
⁸麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；美国麻省理工学院麦戈文脑研究所，马萨诸塞州剑桥市，邮编02139；美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院脑与认知科学与生物工程系，邮编02139。
⁹麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；麻省理工学院生物系，剑桥，马萨诸塞州02139，美国；哈佛医学院系统生物学系，美国马萨诸塞州波士顿02114，电子地址：lander@broadinstitute.org。
¹⁰麻省理工学院和哈佛大学博德学院，剑桥，马萨诸塞州02142，美国；麻省理工学院生物系，剑桥，马萨诸塞州02139，美国；Howard Hughes医学院，4000 Jones Bridge Road，Chevy Chase，MD 20815，美国。电子地址：aregev@broad.mit.edu。

PMID： 24981863
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内政部： 2016年10月10日/j.celrep.2014.05.048

摘要

N6-甲基腺苷（m6A）是一种常见的mRNA修饰物，在微调RNA生命周期中具有潜在作用。在这里，我们确定了一个与甲基转移酶复合物成分METTL3相互作用的密集蛋白质网络，并表明其中三个（WTAP、METTL14和KIAA1429）是甲基化所必需的。通过监测WTAP缺失后的m6A水平，可以定义准确的近单核苷酸分辨率甲基化图，并将其分类为WTAP依赖和独立位点。WTAP依赖位点位于转录物的内部位置，在我们调查的各种系统中拓扑是静态的，并且与mRNA稳定性呈负相关，这与确定“基本”降解率的作用一致。WTAP-independent位点形成于第一个转录基，作为帽结构的一部分，存在于数千个位点，形成了以前未被认可的转录组复杂性层。我们的数据揭示了这种RNA修饰的蛋白质组和转录基础。

PubMed免责声明

数字

**图1。甲基转移酶复合物组分的蛋白质组学鉴定**
**（A-B）**与HIS标记METTL3（A）和V5标记METTL14（B）相关的蛋白质。定量富集与对照的折叠变化(方法)跨越两个生物复制。**（C）**与生物素化、甲基化RNA诱饵相关的蛋白质，与两个生物复制品中生物素化和非甲基化的对应物相比。**（D）**在不同的质谱实验中确定的与诱饵蛋白（灰色阴影节点）的关联网络。从诱饵A到目标B的边缘表明，在A上执行IP时，B富集（折叠变化>1.5）。仅显示传入次数≥2的目标节点。边缘宽度区分诱饵（粗线）和非诱饵（细线）之间的关联。如果用含有m6a“作者”（METTL3/METTL14/WTAP）的蛋白诱饵进行浓缩，边缘会被染成深红色；如果用“读者”（YTHDF1/YTHDF2/YTHDF3）进行浓缩，则边缘会被染成青色；如果用甲基化诱饵进行富集，边缘会变成深蓝色。进一步从功能上分析，KIAA1429的节点以较厚的边界标记。

**图2。甲基转移酶复合物组分的扰动识别复合物依赖性和非依赖性甲基化位点**
**（A）**K-表示小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中检测到的16487个位点（行）的log2转换过输入峰值得分（黄色：高，蓝色：低）的聚类。仅在2个或更多呈现样本（列）中检测到的位点，最大峰值过输入得分大于8，并且在表达高于60的基因中^第个显示百分位数。站点最初使用k-means聚类为5个簇，然后根据特征的相似性，将其中三个簇与现有簇手动合并，生成3个簇（用黑线分隔）。为了可视化，日志₂（POI）得分上限为4.5，然后转换为Z得分。内部shRNA标识符用括号表示。**（B）**（A）中三个簇中距离最近的一致性位点的距离分布。**（C）**（A）中的位点在五个基因片段中的分布（Dominissini等人，2012）。**（D）**由（A）中确定的位点组成的内部外显子的长度在已确定的簇中的分布。**（E）**K-表示在人类A549细胞中检测到的17331个位点（行）的log2转化的峰值过输入得分的聚类，如在A中所示。**（F）**如图所示，K表示一组实验的log2转换过输入峰值得分的聚类，这些实验涉及使用siRNAs扰动A549细胞。在60以上表达的基因中，仅绘制WTAP依赖位点（行）^第个所有条件下的百分位数。**（G）**如图所示，经siRNA处理的A549细胞的相对m6A/A比率由HPLC-M/S测量。绘制了poly（A）分数（蓝色）和flowthrough（橙色）的数值。**（H）**IP（蓝色）和输入（红色）实验对用shGFP（顶行）或shWTAP（底行）处理的A549细胞中选定基因的覆盖示例。

**图3。人类和小鼠甲基化动力学目录**
**（A）**描述本研究中描述的四个实验系统的方案。左上角：多西环素诱导的OKMS（OCT4、KLF4、MYC和SOX2）成纤维细胞重编程为iPSC。左下：分化为神经祖细胞的人类胚胎干细胞。右上角：由脂多糖（LPS）刺激的骨髓衍生树突状细胞。右下：胚胎和成年小鼠的大脑。**（B、C）**在一个或多个样本（列）中确定的所有WTAP依赖位点（行）的POI得分热图（如图1A所示），在60以上表达的基因中^第个所有条件下的百分比(方法)人类（B）或小鼠（C）。**（D、E）**人类（D）和小鼠（E）中的条件数量（X轴，共7个，分别在B和C中，不包括任何遗传扰动），在这些条件中，位点被识别为存在（POI>4）。根据POI得分，将站点分为三个大小相等的组。

**图4。看家基因的甲基化被耗尽，并与转录稳定性降低有关**
**（A）**MEF中基因表达和甲基化密度之间的关联。**（B）**在人类（顶部）、小鼠（中部）和酵母（酵母）中含有非甲基化基因的前GO类别。图中显示了非甲基化基因在每个类别中的比例。仅表达大于60的基因^第个百分位和超过500nt的GO类别，并且只有包含>30个匹配基因的GO类别被考虑用于该分析。**（C）**不同基因属性（Y轴）和甲基化密度之间的相关性（Spearmanρ，X轴）。抄本半衰期来源于（Schwanhausser等人，2011）。我们仅使用A549细胞中定义的位点（图2E），在长度大于500nt且表达于60^第个分位数，最大POI得分>8，与WTAP-depleted细胞相比，未受干扰细胞中的POI得分至少增加50%，并且这些细胞位于TSS片段以外的片段中。(D类)对解释的变异性差异进行分析（R²，X轴）从线性回归模型中消除每个指示变量后，根据所有变量预测甲基化密度。**（E）**mRNA半衰期（Schwanhausser等人，2011年）和甲基化密度之间的关联。半衰期被分为10个大小相等的箱子，并计算每个箱子的平均甲基化密度。误差线-SEM。

**图5。甲基化转录起始位点（mTSS）的鉴定**
**（A）**33714个位点中检测位置（深绿色条）或紧邻上游位置（浅绿色条）含有腺苷（Y轴）的位点的比例，在注释TSS的50 nt内读数>10。使用指定的阈值，根据折叠变化（IP over input；X轴）将站点分为两个区。**（B）**一组3445个假定mTSS的序列标志，log2折叠变化超过4.5。显示了假定甲基化mTSS的位置，以及位于上游约30 bp处的TATA盒信号的位置。**（C）**4879个位点子集中由2个或更多CAGE标签（Y轴）支持的假定mTSS的比例，其中“腺苷”位置位于“Stack”位置之前。腺苷位置（粉色条）、堆栈位置（青色）和4879个随机分配给前50 nt（灰色条）内同一组基因的位置均显示比例。**（D）**日志的分布₁₀（C）中定义的三组CAGE标签的转换数量。**（E、F）**人类iPSCs中具有多个内部mTSS的基因示例。显示了从IP（蓝色）和输入（红色）样本中前50个带注释位置的每个位置开始的读取数。检测到的mTSS以灰色突出显示，并用黑色箭头标记；假定的penultimate-base RT-dropoffs用紫色箭头表示。

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