过氧化物酶体生物发生因子翻译后靶向内质网膜的网织红同源结构域蛋白
和
山本康诺
神户大学医学研究生院生理与细胞生物学系膜动力学系，神户，650-0017日本
佐坂敏树
神户大学医学研究生院生理与细胞生物学系膜动力学系，神户，650-0017日本
神户大学医学研究生院生理与细胞生物学系膜动力学系，神户，650-0017日本
通讯作者。 2017年9月7日收到；2018年1月24日接受。
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补充数字
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摘要
内质网（ER）由一类含有网织蛋白同源结构域（RHD）的膜蛋白形成，该结构域是一个保守的疏水结构域，包含两个短发夹跨膜结构域。RHD存在于ER膜的外小叶中，产生高曲率的ER膜。虽然大多数注定要进入分泌途径的膜蛋白是共翻译靶向的，并插入到ER膜中，但含有RHD的蛋白是如何靶向并插入ER膜的分子机制仍有待阐明。在这里，我们表明含有RHD的蛋白质可以翻译后靶向ER膜。PEX19是一种细胞溶质过氧化物酶体，可选择性识别含RHD的新生蛋白，并与膜过氧化物酶PEX3协同调节其翻译后靶向性。因此，这些过氧化物酶体生物生成因子为含RHD蛋白的膜插入提供了一种替代的翻译后途径，这意味着内质网膜形成和过氧化物酶生物生成可能由翻译后膜插入协调。
介绍
在真核细胞中，将进入分泌途径的各种类型的膜蛋白插入内质网（ER）膜，内质网是分泌的起点1,2普遍认为，这种膜插入的最显著机制是由细胞溶质信号识别颗粒（SRP）、ER-localized SRP受体和由Sec61复合物组成的ER-loclized translocon介导的共翻译途径三,4SRP等待核糖体出口通道中膜蛋白的疏水性N末端信号序列或跨膜结构域（TMD）出现并捕获它，从而暂停膜蛋白的翻译延伸5,6SRP受体将SRP-核糖体上升多肽链复合物招募到内质网膜上，并将其交给Sec61转座子（蛋白质传导通道），然后将膜蛋白共同翻译插入内质网7–11.
虽然大多数膜蛋白都采用这种SRP介导的协同翻译途径，但越来越多的证据表明，某些类别的膜蛋白也采用其他翻译后途径。尾部锚定（TA）蛋白是一类通过单个C末端TMD锚定在脂质双层上的膜蛋白，它编码内质网靶向信息12,13由于TMD距离其C末端非常近，当核糖体终止TA蛋白的翻译时，TMD仍在核糖体隧道内，从而排除了SRP介导的共翻译途径2,14–18因此，TA蛋白在哺乳动物中使用了一种称为TRC40通路或GET的独特机制(G公司被引导的E类第个条目，共个条目T型酵母中的蛋白质途径2,16–18用于翻译后膜插入。从核糖体释放后，新生TA蛋白的TMD被一种胞质ATP酶TRC40识别19，并输送至ER膜19–21CAML和WRB是两种不同的内质网膜蛋白，构成TRC40受体，从TRC40中接收新生的TA蛋白，并调节翻译后插入内质网22–25TA蛋白的另一种备用途径，称为SND(S公司建议零售价i第依赖性靶向）途径，最近在酵母中发现26SND途径由一个核糖体相关蛋白Snd1和两个ER膜蛋白Snd2和Snd3组成，这两个蛋白都与Sec61转座子形成复合物。与酵母中的发现一致，哺乳动物的Snd2同源物hSND2（也称为TMEM208）已被证明与Sec61转座子有关27并介导TA蛋白插入ER膜27,28表明SND途径在进化上是保守的。最近的一项研究表明，UBXD8，一种以脂滴为目的的膜蛋白，采用另一种翻译后途径29新生UBXD8被法尼基化PEX19捕获29，一种细胞溶质过氧化物酶体生物生成因子（也称为过氧化物酶）30–32PEX19翻译后靶向UBXD8并与PEX3合作将其插入ER膜29，一种ER-localized过氧化物酶体生物生成因子，作为PEX19受体发挥作用30–32，然后将UBXD8定位在脂滴上。UBXD8有一个短发夹TMD，在N端编码ER靶向信息，并将短发夹TM插入ER膜的外叶33,34基于这些发现，先前的研究表明PEX19和PEX3为具有单个短发夹TMD的脂滴决定的膜蛋白提供了翻译后途径29尽管从未证明除UBXD8以外的脂滴决定的膜蛋白确实采取翻译后途径。
除了TA蛋白和UBXD8外，在某些情况下，具有负责SRP结合的TMD的膜蛋白也可能采取翻译后途径。鉴于核糖体在哺乳动物细胞中高速翻译mRNA（每秒约6个氨基酸）35,36，推测高翻译速度可能导致SRP有时不能共翻译靶向编码ER靶向信息的TMDs位于C末端附近的膜蛋白。分泌蛋白也是如此，事实证明，编码内质网靶向信息的N端信号序列接近C端的短分泌蛋白可以逃避SRP识别，被翻译后靶向并被钙调素插入内质网膜37因此，可能存在一条未知的翻译后途径，使膜蛋白逃避SRP识别作为备用途径。值得注意的是，网织红细胞，内质网膜形成蛋白38–40，是这种可能的备份路由的理想客户机，因为其编码ER目标信息的TMD位于C终端附近，如下所述。然而，网织红细胞是否能被翻译后靶向并插入内质网膜尚不清楚。
网状结构是一类保守的内质网膜形成蛋白38–40由四个成员组成的家族，网织红1、网织红2、网织黄3和网织红441每个家族成员都有几个剪接亚型41,42网织蛋白的主要结构以网织蛋白同源结构域（RHD）为特征，该结构域包含两个短发夹TMD38,41,43两个短发夹TMD位于内质网膜的外叶中，这反过来扩大了外叶相对于内叶的面积，产生了高曲率膜，如内质网小管和内质网片的边缘38–40,44RHD不限于网状子家族成员。我们已经证明Arl6IP1是一种含有RHD的内质网膜蛋白，它与网织红细胞一样形成内质网45FAM134B是最近发现的ER-吞噬受体，也含有RHD并使ER膜向ER-吞噬方向变形46编码网织红蛋白2、Arl6IP1和FAM134B的人类基因突变导致遗传性痉挛性截瘫和遗传性感觉神经病47–49强调了含RHD蛋白质的生物学重要性。先前的研究表明网织红蛋白3与内质网膜共翻译靶向50然而，鉴于RHD通常位于蛋白质的C末端不远处，含有RHD的蛋白质有时可能会逃脱SRP介导的共翻译靶向作用，并采取上述假定的替代翻译后途径插入膜。在这项研究中，我们表明含有RHD的蛋白质可以翻译后靶向ER膜。PEX19选择性地识别含RHD的新生蛋白质，并与PEX3合作调节翻译后靶向性，这表明PEX19和PEX3构成了含RHD蛋白质的替代性膜插入机制。
结果
含RHD蛋白翻译后靶向ER膜
为了检测含RHD的蛋白质是否翻译后靶向ER膜，我们采用了在体外使用半完整细胞进行分析。用洋地黄素处理盖玻片上生长的HeLa细胞，以使质膜选择性渗透。Arl6IP1和网织红细胞被选为含RHD蛋白的代表。3xFLAG标记的Arl6IP1（3xFLAG-Arl6IP）和网织红4 合成了C（3xFLAG-Rtn4C）在体外用兔网织红细胞裂解物。在环己酰亚胺终止翻译反应后，将合成3xFLAG-Arl6IP1或3xFLAG-Rtn4C的网织红细胞裂解物与半透性HeLa细胞孵育，然后用针对FLAG标签和蛋白质二硫异构酶（PDI）（ER标记蛋白）的抗体进行免疫染色。与不含3xFLAG标记蛋白的网织红细胞裂解物相比，合成3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C的网织白细胞裂解物中检测到强烈的FLAG标记免疫反应信号（图). 重要的是，FLAG标签的免疫反应信号与PDI的信号很好地融合。这些结果表明Arl6IP和Rtn4C是翻译后靶向ER膜的。
将含RHD的蛋白质翻译后靶向ER膜。用1 mM环己酰亚胺，与半渗透HeLa细胞孵育，然后用抗FLAG pAb和抗PDI mAb进行免疫染色。箭头表示通过3xFLAG-Arl6IP1或3xFLAG-Rtn4C与PDI共定位判断的翻译后靶向内质网膜。棒材，20 微米。
接下来，我们评估了含有RHD的蛋白质是否在我们的在体外化验。合成3xFLAG-Arl6IP1或3xFLAG-Rtn4C的兔网织红细胞裂解物与半渗透HeLa细胞在环己酰亚胺存在下孵育，以与上述相同的方式使翻译后靶向ER膜。用缓冲液清洗后，用0.1培养样品 M碳酸钠（pH11.0）提取外周膜蛋白，然后用抗FLAG pAb和抗PDI mAb进行免疫染色。虽然外周膜蛋白的提取严重破坏了内质网的形态，但根据残留PDI的免疫反应性判断，在内质网膜上很容易检测到3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C的显著免疫反应性（图S1安培). 此外，我们还对3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C是否对碳酸钠萃取有抗性进行了生化评估。用洋地黄素使HeLa细胞半渗透并悬浮在缓冲液中。合成3xFLAG-Arl6IP1或3xFLAG-Rtn4C的兔网织红细胞裂解物与半永久性HeLa细胞悬浮液在放线菌酮存在下在微型离心管中孵育。用缓冲液清洗后，半永久性HeLa细胞悬浮在0.1 M碳酸钠（pH11.0）并进行超速离心，然后用抗FLAG pAb和抗PDI mAb进行Western印迹。与之前的研究一致，碳酸钠提取了外周膜蛋白和管腔蛋白51，在上清液中检测到一半以上的PDI（图S1B年). 相比之下，几乎所有的3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C都在颗粒中检测到，这表明3xFLAC-Arl6IP和3xFLAG-Rtn4C对碳酸钠萃取有抵抗力（图S1B年). 这些结果表明，含有RHD的蛋白质并非与ER膜外周相关，而是翻译后插入ER膜。
PEX19作为一种选择性结合新生RHD蛋白的蛋白质的鉴定
结果如图所示提示兔网织红细胞裂解物含有一个或多个因子，可调节含RHD蛋白的翻译后靶向性。因此，我们接下来寻求纯化和鉴定靶向因子。合成FLAG-标记的Arl6IP1（FLAG-Arl6IP1）的兔网织红细胞裂解物与抗FLAG单克隆抗体固定化琼脂糖孵育。为了检查污染，未合成FLAG-Arl6IP1的兔网织红细胞裂解物也与抗FLAG单克隆抗体固定化琼脂糖孵育。结合蛋白进行SDS-PAGE，然后进行银染色。除了FLAG-Arl6IP1，还有五个突出的波段，分别位于120、60、55、40和29 kDa（p120、p60、p55、p40和p29）在合成FLAG-Arl6IP1的兔网织红细胞裂解物的洗脱液中特异性检测到（图)，并进行质谱分析。p55被鉴定为SRP54，是SRP的一个组成部分，在共同翻译靶向中与信号序列或TMD结合中起核心作用52这一结果表明，与之前显示Rtn3共翻译靶向的报告一致50，Arl6IP1可以被SRP共翻译靶向，并可能通过易位插入ER膜。p120、p60、p40和p29被鉴定为Bat3（也称为Bag6）53–55，蛋白酶体26 S亚单位ATP酶156，PEX1930–32和核糖体蛋白L10a57分别为。其中，PEX19最近被证明可以介导UBXD8的翻译后靶向性，UBXD8-是一种脂质滴的膜蛋白29因此，PEX19的鉴定促使我们检查含RHD的蛋白质是否以与脂滴决定膜类似的方式利用PEX19进行翻译后靶向。
PEX19作为一种蛋白质的鉴定，该蛋白质选择性地结合到含有RHD的新生蛋白质。(A类)从兔网织红细胞裂解物中纯化Arl6IP1结合蛋白。将合成FLAG-Arl6IP1的兔网织红细胞裂解物与抗FLAG单克隆抗体固定化琼脂糖孵育。为了检查污染，未合成FLAG-Arl6IP1（对照裂解物）的兔网织红细胞裂解物也与抗FLAG单克隆抗体固定化琼脂糖孵育。结合蛋白通过与大量过量的游离FLAG肽竞争洗脱，然后进行SDS-PAGE，然后进行银染色。p120、p60、p55、p40和p29被鉴定为Bat3（也称为Bag6），蛋白酶体26 质谱法分别测定S亚单位ATP酶1、SRP54、PEX19和核糖体蛋白L10a。(B类)PEX19与含RHD的新生蛋白质的选择性结合。在合成FLAG-Arl6IP1、FLAG-Rtn4C、FLAG-atlastin-1和FLAG-syntaxin-1的兔网织红细胞裂解物中添加1 mM嘌呤霉素，然后与抗FLAG单克隆抗体固定化琼脂糖孵育。用SDS样品缓冲液煮沸洗脱结合蛋白，然后进行SDS-PAGE，然后用抗PEX19 pAb和抗FLAG pAb进行Western印迹。
我们检查了PEX19是否选择性识别含RHD的蛋白质。FLAG-Arl6IP1、FLAG-tagged Rtn4C（FLAG-Rtn4C）和FLAG-tagned网状子3 合成了A（FLAG-Rtn3A）在体外以兔网织红细胞裂解物为含RHD蛋白质的代表。此外，还合成了FLAG-tagged atlastin-1（FLAG-atlastin-1）和FLAG-tagned syntaxin-1（FLAG syntaxin-1）在体外作为其他类内质网膜形成蛋白的代表58和尾锚定蛋白的代表59分别为。用嘌呤霉素终止翻译反应后在体外合成的FLAG标记蛋白用抗FLAG单克隆抗体固定化琼脂糖拉下，然后用抗PEX19单克隆抗体进行蛋白质印迹。用FLAG-Rtn4C和FLAG-Rnt3A以及FLAG-Arl6IP1将PEX19拉下（图和图S2). 另一方面，PEX19没有被FLAG-syntaxin-1和FLAG-atlastin-1拉下（图). 这些结果表明，PEX19选择性地识别含RHD的新生蛋白。
PEX19选择性介导含RHD蛋白靶向ER膜
接下来，我们研究了PEX19在将含RHD的蛋白质靶向ER膜上的作用。最近的研究表明，法尼基形式的PEX19参与UBXD8的翻译后靶向29因此，我们首先检测了法尼基化缺陷突变体PEX19 C296S过度表达的影响60,61Arl6IP1靶向ER膜。将HA标记的Arl6IP1（HA-Arl6IP1）转染到具有或不具有FLAG标记的PEX19 C296S（FLAG-PEX19 C296S）的HeLa细胞中。与我们之前的报告一致45HA-Arl6IP1的过度表达显示了广泛的网状染色模式，表明增强的肾小管内质网，诱导了内质网的异常圆形结构，并将PDI从外周内质网小管中排除（图)表明Arl6IP1的膜插入能有效地收缩外周内质网小管。重要的是，HA-Arl6IP1和FLAG-PEX19 C296S的共表达经常显示HA-Arl6 IP1的弥漫染色（图)，表明PEX19 C296S的过度表达诱导了Arl6IP1的异常扩散定位。在过度表达FLAG-PEX19 C296S的细胞中，PDI仍被排除在外周ER小管外，这表明尽管PEX19 C2 96S过度表达，但仍有足够数量的Arl6IP1插入ER膜。接下来我们研究了野生型PEX19过度表达的影响。值得注意的是，FLAG-tagged野生型PEX19（FLAG-PEX19）的过度表达表现出与FLAG-PEX19 C296S相同的效果（图). 因此，这些结果表明PEX19的过度表达干扰了Arl6IP1亚群对ER膜的靶向作用。Rtn3A也获得了类似的结果。HA标记的Rtn3A（HA-Rtn3A）的过度表达显示了广泛的管状ER网络，并有效地收缩了外周ER小管，其特征是PDI被排除在外周ER小管之外（图S三). HA-Rtn3A和FLAG-PEX19 C296S或FLAG-PEX19的共表达经常显示HA-Rtn5A的弥散染色，而PDI仍被排除在过度表达FLAG-PEX296S或FLAG-PEX19的细胞的外周ER小管中（图S三)表明PEX19的过度表达干扰了将Rtn3A亚群靶向ER膜。另一方面，当HA标记VAP-A（HA-VAP-A）时，ER-localized TA蛋白62通过TRC40途径翻译后插入，转染到HeLa细胞中，无论是否有FLAG-PEX19 C296S或FLAG-PEX19，HA-VAP-A定位于ER膜，无论PEX19和PEX19 C2 96S是否过度表达（图). PEX19和PEX19 C296S的过度表达也不会影响TMEM33的内质网定位，TMEM33是一种内质网膜蛋白，具有三个TMD，预期通过转座子共翻译插入63（图S4). 总之，这些结果表明，PEX19的过度表达特异性地干扰了含有RHD的蛋白质对ER膜的靶向作用。
PEX19选择性地介导Arl6IP1靶向ER膜。(A类)PEX19过度表达诱导Arl6IP1而非VAP-A的扩散定位。将HA-Arl6IP1或HA-VAP-A转染到HeLa细胞中，加入或不加入FLAG-PEX19 C296S，然后用抗HA单克隆抗体、抗FLAG单克隆抗体和抗PDI单克隆抗体进行免疫染色。棒材，20 微米。(B类)PEX19过度表达诱导的弥散定位的量化。随机选择50个转染细胞(A类)计算HA-Arl6IP1或HA-VAP-A弥漫定位的细胞数。HeLa细胞也转染HA-Arl6IP1或HA-VAP-A和FLAG-野生型PEX19（FLAG-PEX19 WT），并以与(A类)同样计算HA-Arl6IP1或HA-VAP-A弥漫定位的细胞数量。误差条代表三个独立实验的SD。双星号表示统计显著性（学生t吨测试**第页 < 0.01).
我们推断，如果PEX19介导将包含RHD的蛋白质靶向ER膜，PEX19的缺失将导致聚集在细胞质中的ER靶向不适合RHD的蛋白的积累。为了测试这种可能性，我们将靶向PEX19的siRNA或阴性对照siRNA转染到HeLa细胞中。PEX19的敲除通过免疫印迹证实（图S第5页). 当细胞在蛋白酶体抑制剂MG132的存在下培养时，在PEX19敲除的细胞中经常检测到内源性Rtn3的点样免疫反应信号，但在对照siRNA转染的细胞中没有检测到（图)这表明，与上述推理一致，PEX19敲除导致细胞质中膜插入不合格Rtn3的聚集。在没有MG132的情况下，未检测到点状免疫反应信号（图S6)，表明泛素-蛋白酶体系统能迅速降解ER靶向不称职的RHD蛋白，以避免蛋白在细胞质中聚集。
在MG132存在下，PEX19敲除导致内源性网织红蛋白3的细胞质聚集。用靶向PEX19或对照siRNA的siRNA转染HeLa细胞，并在蛋白酶体抑制剂MG132存在下培养，然后用抗Rtn3 pAb和抗PDI mAb进行免疫染色。方框区域表示提示内源性Rtn3细胞质聚集的点状免疫反应信号。棒材，20 微米。
我们研究了TRC40通路的敲低对Arl6IP1内质网定位的影响。以CAML或WRB为靶点的三个独立的siRNA，两者都是TRC40通路的组成部分22–24，转染HeLa细胞，然后转染HA-Arl6IP1。无论CAML或WRB被敲除，HA-Arl6IP1定位于ER膜并使ER膜变形，表明TRC40通路不参与PEX19-介导的ER靶向（图S7).
总的来说，这些结果表明PEX19选择性地将含RHD的蛋白质靶向ER膜。
PEX3参与将含有RHD的蛋白质翻译后靶向ER膜
PEX3是PEX19的ER膜受体30–32并已证明与PEX19协同调节UBXD8翻译后插入ER膜29因此，我们研究了PEX3是否以与脂滴决定的膜蛋白类似的方式将含RHD的蛋白质的翻译后靶向性介导到ER膜。靶向PEX3和靶向PEX19的siRNA分别转染到HeLa细胞中，以击倒内源性PEX3与PEX19。通过定量RT-PCR证实了PEX3的敲除（图S5亿). 用洋地黄素对敲除的细胞进行半渗透，并用在体外用兔网织红细胞裂解物以与图中相同的方式合成3xFLAG-Arl6IP1或3xFLAG-Rtn4C进行翻译后靶向分析与图中的结果一致，对照siRNA-转染细胞在ER处显示出强烈的3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C免疫反应信号，表明Arl6IP1和Rtn4C是翻译后靶向ER膜的（图和图S8). 重要的是，与对照siRNA-转染细胞相比，PEX3敲低的细胞在ER处显示出非常微弱的3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C免疫反应信号，表明PEX3的敲低显著降低了翻译后靶向性。另一方面，PEX19敲除细胞中3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C的免疫反应信号与对照siRNA-转染细胞中的免疫反应相似，可能是因为兔网织红细胞裂解物将PEX19供应给Arl6IP 1和Rtn4C在体外翻译后靶向分析。为了验证PEX3敲除对含RHD蛋白的翻译后靶向的抑制作用，将具有沉默突变抗siRNAs的HA-标记PEX3构建物转染到PEX3击倒细胞中，然后用在体外翻译后靶向分析。经HA免疫反应鉴定，转染siRNA-resistant PEX3-HA的PEX3敲低细胞在内质网处显示出比相邻未转染PEX3击低细胞更强的3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C免疫反应信号（图S9)表明PEX3的外源表达挽救了PEX3敲除的抑制作用。为了进一步验证PEX3特异性参与将含RHD的蛋白质翻译后靶向ER膜，我们检测了另一个过氧化物酶体生物发生因子的敲除作用。两个独立的靶向PEX5的siRNA，对过氧化物酶体生物发生至关重要，并介导过氧化物酶基质蛋白向过氧化物质体的转运31,64，转染到HeLa细胞中，以使内源性PEX5被敲除，如定量RT-PCR所证实（图S5摄氏度)，然后是在体外翻译后靶向分析。PEX5敲低的细胞显示出3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C的显著免疫反应信号，这与输注对照siRNA的细胞中的信号相似（图S10)表明含有RHD的蛋白质的ER靶向性不受PEX5敲除的影响。总的来说，这些结果表明PEX3特异性地介导含RHD蛋白的翻译后靶向ER膜，同时也表明过氧化物酶体的生物发生与含RHD蛋白质的ER靶向没有直接关系。
PEX3参与Arl6IP1翻译后靶向ER膜。用靶向PEX3或PEX19的siRNA或对照siRNA转染HeLa细胞，半透化，并进行在体外用3xFLAG-Arl6IP1进行翻译后靶向分析，如图所示箭头表示通过3xFLAG-Arl6IP1与PDI共定位判断的ER膜翻译后靶向。棒材，20 微米。
讨论
在本研究中，我们表明含RHD的蛋白质可以通过翻译后途径靶向ER膜。PEX19选择性识别新生的含有RHD的蛋白质，并与PEX3合作介导其翻译后靶向。已经确定PEX19和PEX3之间的相互作用构成过氧化物酶体膜蛋白和脂滴决定的膜蛋白的膜插入机制29–32因此，PEX19引导的含RHD的蛋白质可能通过PEX3相互作用插入ER膜。然而，我们的结果并不否认含有RHD的蛋白质的共翻译途径，因为我们确定SRP54是一种与新生的含RHD的蛋白结合的蛋白质，如图所示事实上，我们观察到PEX19的过度表达和敲除不足以完全消除含RHD蛋白的ER定位，如图和，增加了大量含有RHD的蛋白质可能被共翻译插入ER膜的可能性。此外，之前的研究表明，Rtn3与内质网膜共翻译靶向50因此，PEX19和PEX3将作为翻译后途径的替代膜插入机械。
目前尚不清楚为什么含有RHD的蛋白质需要两条不同的途径来插入膜。鉴于RHD通常位于蛋白质的C末端附近，SRP在翻译过程中有时可能无法识别RHD。因此，一种可能的解释是PEX19和PEX3可能构成性地为碰巧错过共翻译途径的含有RHD的蛋白质提供备用途径。自从PEX19和PEX3被描述为过氧化物酶体生物生成的必要因素以来30–32翻译后的途径可能与过氧化物酶体的生物发生有关。值得注意的是，大多数含RHD的蛋白质都是内质网膜形成蛋白，这增加了内质网形成和过氧化物酶体生物生成之间可能存在功能协调的可能性。一致的是，网织红蛋白已被证明参与酵母过氧化物酶体生物发生的调节65,66尽管尚不清楚哺乳动物细胞是否也是如此。总的来说，另一种可能的解释是，含有RHD的蛋白质可能会优先采取翻译后途径，通过塑造内质网膜来调节过氧化物酶体的生物发生。此外，鉴于PEX19和PEX3介导脂滴决定的膜蛋白的翻译后膜插入29ER膜的形成也可能与脂滴的形成有关。还需要进一步研究，以了解这三种细胞器，ER、过氧化物酶体和脂滴如何通过发育后膜插入进行沟通。
在本研究中，我们证明了包含RHD的蛋白质是PEX19的特定客户，如图所示普遍认为RHD将两个短发夹TMD插入膜的外叶，导致膜弯曲38–40,44PEX19还可以调节UBXD8翻译后插入ER膜29有趣的是，UBXD8有一个短发夹TMD，插入膜的外叶，尽管它没有诱导膜弯曲的活性。综上所述，这些结果提出了一个诱人的可能性，即PEX19可能优先识别新生的短发夹TMD，并不仅对含RHD的蛋白质和UBXD8，而且对与PEX3合作的包含短发夹式TMD的广泛膜蛋白介导翻译后膜插入。因此，PEX19-PEX3系统可以作为将任何包含短发夹TMD的膜蛋白插入ER膜的基本机制。
虽然已经确定PEX19与PEX3结合并将过氧化物酶体膜蛋白插入过氧化物酶膜30–32目前尚不清楚短发夹TMD是否与过氧化物酶体膜蛋白共享PEX19的结合区域。PEX19的法尼基化是否调节与RHD的结合也尚不清楚。需要进行进一步的结构和生化分析，以揭示PEX19如何识别广泛的短发夹TMD并调节其膜插入的分子机制。
在图中和图。 第3页，野生型PEX19的过表达以及PEX19 C296S的过表达诱导了HA-Arl6IP1和HA-Rtn3A的异常扩散定位。然而，这些结果并不一定表明PEX19的法尼基化对于内质网靶向是必不可少的，因为我们从未检测过有多少过多的野生型PEX19蛋白被法尼化。因此，我们不能排除过表达野生型PEX19的很大一部分可能没有法尼基化的可能性，导致包含RHD的蛋白质的异常扩散定位。另一方面，还有另一种可能的解释。过度表达的PEX19可能会捕获HA-Arl6IP1和HA-Rtn3A的细胞质池，由于内源性PEX19的数量有限，这些细胞质池本应用于蛋白酶体降解。事实上，只有在蛋白酶体抑制剂MG132存在的情况下，才在PEX19敲除的细胞中检测到内源性Rtn3的细胞质积累，如图所示这表明，当细胞缺乏足够量的PEX19时，含有RHD的蛋白质的细胞质池被蛋白酶体降解并迅速清除。由于内源性PEX3的数量有限，大多数PEX19–HA-Arl6IP1和PEX19-HA-Rtn3A复合物可能不会靶向ER膜，最终使它们异常地停留在细胞液中。需要进一步研究以揭示PEX19的法尼基化参与RHD蛋白的ER靶向性，并阐明PEX19过度表达的影响。
除PEX19外，我们还从兔网织红细胞裂解物中纯化了Bat3，作为一种与新生Arl6IP1结合的蛋白质，如图所示有趣的是，之前的研究也表明，Bat3是从兔网织红细胞裂解物中纯化出来的，是一种与新生UBXD8结合的蛋白质29因此，存在Bat3可能调节PEX19介导的短发夹TMDs的识别的可能性。另一方面，研究表明，Bat3能够捕获定位错误的膜蛋白的TMD，以防止细胞液中不希望的聚集，从而导致其通过泛素蛋白酶体系统降解54,55因此，也不能排除Bat3可能与内质网靶向功能不全的RHD蛋白或UBXD8的短发夹TMD结合以降解蛋白酶体的可能性。一致的是，需要蛋白酶体抑制剂来检测Rtn3的细胞质聚集，如图所示表明ER靶向功能不全的Rtn3是泛素-蛋白酶体系统的底物。需要进一步的生化分析来解决这些问题。
总的来说，过氧化物酶体生物生成因子PEX19和PEX3为含RHD蛋白质的内质网靶向提供了一种替代的翻译后途径，这意味着内质网膜的形成可能通过膜插入与过氧化物酶生物生成相协调，过氧化物酶体生物生成因子可能是一种基本的机制，可将包含短发夹TMD的广泛膜蛋白插入内质网膜。
材料和方法
质粒
对于在体外翻译后，在T7启动子的控制下，将编码人类Arl6IP1、人类网状红细胞4C（Rtn4C）、小鼠网状红细胞3A（Rtn3A）、大鼠atlastin-1和大鼠syntaxin-1的cDNA亚克隆到pBluescript-KS载体中，并使用N末端三重FLAG标签（3xFLAG）或单个FLAG标签。对于哺乳动物表达，将编码人类Arl6IP1、小鼠Rtn3A、大鼠VAP-A、人类PEX19和人PEX19法尼基化缺陷突变体（PEX19 C296S）的cDNA亚克隆到带有N末端HA标签或FLAG标签的pCMV载体中。将编码人类PEX3和人类TMEM33的cDNA亚克隆到带有C末端HA标签的pCA载体中。为了产生抗siRNA形式的PEX3，通过使用QuikChange Lightning（安捷伦科技公司）的定点突变引入沉默突变，并使用以下引物集。siRNA#1-抗性PEX3的感义引物；5′-ctcaatgaaactagagacatttggaaagccctgacttccagatttggatatatataaaccgagttt-3′。抗siRNA#1的PEX3反义引物；5′-aaacctcggttaaaacaggttattcaaactgtggagagtcaggcttccaacctctagtccattggag-3′。siRNA#2-抗性PEX3的敏感引物；5′-ggaggctagaatacatgccagctaggaggagtatcattggaagtaaccagactt-3′。抗siRNA#2 PEX3的反义引物；5′-aagtctctggttactctcaaatgatactgccttagctgcaatttgcagccccc-3′。
抗体
分别从Thermo Fisher Scientific（目录号PA5–22129）、Abcam（目录号ab2792）、Proteintech（目录号12055–2-AP）、Roche（目录号11 867 423 001）和Sigma（目录号F7425）购买了兔抗PEX19 pAb、鼠抗PDI mAb、兔抗Rtn3 pAb和兔抗FLAG pAb。
半完整HeLa细胞的制备
HeLa细胞在12 mm盖玻片，如前所述用洋地黄素半渗透23简单地说，用含有20 mM HEPES–KOH pH7.4、110 mM醋酸钾（KOAc），2 mM乙酸镁，并用补充有40 µg/ml洋地黄苷冰敷10次 min.用KHM缓冲液清洗细胞一次，然后用含有90 mM HEPES–KOH pH7.4和50 mM KOAc两次。在补充有2.5 mM氯化钙2室温下20 min。用KHM缓冲液冲洗两次后，盖玻片上的半渗透细胞受到在体外膜靶向分析如下所述。
在某些情况下，10 用Lipofectamine RNAi MAX（Invitrogen）将nM靶向人PEX19（赛默飞世尔科学公司；分类号s11612、s11613）、人PEX3（赛默飞世尔科学公司；分类号s16154、s16156）或人PEX5（赛默飞世尔科学公司；分类号s11630、s11632）的消音器选择siRNA转染到HeLa细胞中，并培养48–72 h以允许击倒PEX19、PEX3或PEX5，然后进行半渗透。值得注意的是，这些siRNAs与之前研究中验证的相同29.
体外膜蛋白翻译后靶向ER膜的检测
合成了3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C在体外根据制造商手册，分别使用pBluescript KS-3xFLAG-Arl6IP1和pBluesscript KS-3x FLAG-Rtn4C作为模板的兔网织红细胞裂解物转录-翻译耦合系统（TnT快速耦合转录/翻译系统（Promega））。通过添加1终止翻译反应 mM环己酰亚胺。盖玻片上的半渗透HeLa细胞与35 μl兔网织红细胞裂解物在37℃下合成3xFLAG-Arl6IP1或3xFLAG-Rtn4C 90°C min，使翻译后靶向进入内质网膜。用KHM缓冲液清洗三次后，用4%多聚甲醛固定细胞，然后用0.2%Triton X-100渗透。在某些情况下，用KHM缓冲液冲洗三次后，用0.1 M碳酸钠（pH11.0），4 30°C min提取外周膜蛋白，用KHM缓冲液再次洗涤三次，然后固定和渗透。样本用抗FLAG pAb和抗PDI mAb双重免疫染色，如下免疫组织化学所述。
碳酸钠萃取法对含RHD蛋白膜插入的生化评价
HeLa细胞生长在6厘米的培养皿上，以上述相同的方式用洋地黄素进行半渗透，并悬浮在KHM缓冲液中。合成了3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C在体外带200 μl兔网织红细胞裂解物，如上所述。通过添加1终止翻译反应后 mM环己酰亚胺，兔网织红细胞裂解物与25 µl（110 微细离心管中的半渗透细胞悬浮液，并在37℃下旋转 90°C min，使翻译后靶向进入内质网膜。为了去除含有未插入3xFLAG-Arl6IP1和3xFLAG-Rtn4C的兔网织红细胞裂解物，在1200℃离心收集半渗透细胞 × 克在4 5°C min。将半渗透细胞重新悬浮在KHM缓冲液中，并在1200℃下离心 × 克在4 5°C 分钟。为了完全去除兔网织红细胞裂解物，此清洗步骤重复三次。然后将半渗透细胞悬浮在100 0.1微升 M碳酸钠（pH11.0），并在4 30°C 提取外周膜蛋白的时间为min，其次是100000次的无曲霉素 × 克在4 30°C min。上清液（提取部分）经过TCA沉淀并在120 µl SDS样品缓冲液。颗粒（未提取部分）于120年再次悬浮 µl SDS样品缓冲液。
Arl6IP1结合蛋白的免疫亲和纯化
合成了FLAG-Arl6IP1在体外使用pBluescript KS-FLAG-Arl6IP1作为模板的TnT快速耦合转录/翻译系统。250 将合成FLAG-Arl6IP1的兔网织红细胞裂解物微升与30 µl抗FLAG M2单克隆抗体结合琼脂糖珠（Sigma），4 °C过夜。用含有20 mM Tris–HCl pH7.5150 mM氯化钠，2 mM氯化镁2，用添加0.3的结合缓冲液洗脱结合蛋白 mg/ml FLAG肽。样品进行SDS-PAGE，然后进行银染色。从凝胶中切下感兴趣的条带，用胰蛋白酶消化，然后进行质谱分析。
PEX19与含RHD的蛋白质的结合
合成了FLAG-Arl6IP1、FLAG-Rtn3A、FLAG-R tn4C、FLAG-atlastin-1和FLAG-syntaxin-1在体外使用TnT快速耦合转录/翻译系统，分别使用pBluescript KS-FLAG-Arl6IP1、pBluesscript KS-FFLAG-Rtn3A、pBluesscript KS-FLAG-Rtn4C、pBluestcript KS_FLAG-atlastin-1和pBluesScript KS-FLA G-syntaxin-1作为模板，然后添加1 mM嘌呤霉素终止翻译反应。80 μl兔网织红细胞裂解物与10 4μl抗FLAG M2单克隆抗体结合琼脂糖珠 4°C h.在用结合缓冲液广泛清洗后，用煮沸的SDS样品缓冲液洗脱结合蛋白。对样品进行SDS-PAGE，然后用抗PEX19 pAb和抗FLAG pAb进行蛋白质印迹。
免疫组织化学
将哺乳动物表达载体的适当组合转染到12 mm带Effectene（QIAGEN）的盖玻片。转染后第二天，细胞用4%多聚甲醛固定，然后用0.2%Triton X-100渗透。在用含有1%BSA的PBS封闭后，样品与一级抗体孵育，然后与Alexa荧光染料（Invitrogen）结合的二级抗体孵育30 min.用PBS清洗后，将其嵌入共焦成像系统（蔡司，LSM 510 Meta）进行观察。
用于敲除PEX19，10 将以人PEX19为靶点的nM沉默选择siRNAs用Lipofectamine RNAi MAX转染到HeLa细胞中。转染后第二天，用添加1 µM MG132（Sigma），并将细胞培养17 h以抑制蛋白酶体，然后进行上述免疫染色。
对于CAML或WRB的击倒，50 用Lipofectamine RNAi MAX将nM靶向人CAML的隐形siRNA（赛默飞世尔科学公司；目录号CAMLGHSS188680、CAMLGHSS188681、CAMLGHSS101333）或WRB（赛默飞世尔科学公司；目录号WRBHSS111382、WRBHSS111383、WRBHSS111384）转染到HeLa细胞中。转染后第二天，随后用效应基因转染HA-Arl6IP1并进一步培养过夜，以使CAML或WRB被完全敲除并表达HA-Arl6 IP1，然后进行如上所述的免疫染色。值得注意的是，这些siRNA已经在我们之前的研究中得到验证23.
定量RT-PCR
使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）从转染有感兴趣siRNA的HeLa细胞中分离出总RNA，并用SuperScript VILO（Invitrogen）反向转录到cDNA中。在LightCycler上进行定量PCR®480实时PCR系统（罗氏），使用KAPA SYBR FAST主混合液（KAPA BIOSYSTEMS）。将PEX3转录物和PEX5转录物的量标准化为GAPDH。
致谢
我们感谢神户大学医学研究生院质谱综合中心的质谱分析。这项工作得到了JSPS KAKENHI Grant Numbers、15K07000、25293071和16K15218的支持。
作者贡献
Y.Y.和T.S.设计了这项研究。Y.Y.进行了实验。Y.Y.和T.S.分析了数据并撰写了手稿。
脚注
电子辅助材料
补充信息本文随附于10.1038/s41598-018-20797-0。
出版商备注：Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。
工具书类
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