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年收入细胞开发生物。作者手稿；PMC 2014年9月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
年收入细胞开发生物。2011; 27: 25–56.
2011年7月21日在线发布。 数字对象标识：10.1146/年度生物-092910-154125
预防性维修识别码：项目经理4163802
美国国立卫生研究院：NIHMS620467标准
PMID：21801011

内质网膜蛋白插入

邵思晨1,2和拉马努扬·S·赫格德1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

真核细胞的细胞表面和大多数细胞内隔间的完整膜蛋白都组装在内质网中。两条高度保守且平行的途径介导膜蛋白靶向并插入该细胞器。大多数膜蛋白使用的经典共翻译途径涉及信号识别颗粒的靶向作用，然后通过Sec61转座子插入。许多尾锚定膜蛋白所采用的一种更为特殊的翻译后途径，由围绕一种称为TRC40或Get3的胞质ATP酶的完全不同的因子组成。这两种途径都克服了相同的生物物理挑战，即通过水环境运输疏水性物质，选择性地将其传递到几个细胞膜中的一个，并不对称地将其跨膜结构域整合到脂质双层中。在这里，我们回顾了这些核心膜蛋白插入途径背后的概念和机制主题，挑战我们理解的复杂性，以及克服这些障碍的未来方向。

关键词：靶向性，蛋白质移位

简介

整合膜蛋白（IMPs）占真核生物蛋白质组的20-30%，并且种类繁多。它们具有许多重要的细胞功能，如信号受体、介导细胞内运输、促进细胞器生物发生以及跨细胞膜运输各种分子。从结构上讲，IMP的范围从具有单个跨膜结构域（TMD），该结构域仅将可溶性结构域锚定在膜上，到具有包含20多个TMD的紧密包裹的束(图1一). 大多数细胞的IMP填充在分泌和内吞途径的质膜和细胞内隔间。所有这些蛋白质最初在内质网（ER）组装。这是IMP的TMD集成到膜中、确定最终拓扑、实现第三和第四结构的位置(Alder&Johnson 2004年,Rapoport等人，2004年,Skach 2009年). 如果IMP生物发生的这些决定性步骤是成功的，那么IMP随后会被分类到其功能的最终位置(Pryer等人，1992年,罗斯曼1994). 否则，几种质量控制途径中的一种会使IMP降解(Hegde&Ploegh 2010年,Meusser等人，2005年).

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完整膜蛋白的结构多样性。(一)几种类型的完整膜蛋白以不同的拓扑结构显示。大多数类型的膜蛋白是通过共翻译途径插入的，尽管有些使用翻译后途径。内质网。(b条)使用Kyte-Doolittle量表绘制G蛋白偶联受体（牛视紫红质）的亲水性图。疏水区域位于轴下方，用金表示。注意，七个跨膜结构域（TMD）中有六个很容易通过疏水性识别，但第七个更具极性。显示了第一个和最后一个TMD的序列；每个TMD内的极性残基用星号表示。(c（c）)牛视紫红质的三维结构表明TMD的结构高度可变；有些是倾斜或扭结的。TMD1和TMD7分别以蓝色和红色显示。TMD7的异常序列特征（参见面板b)对应于它在膜中的不寻常结构。

所有注定要插入内质网的IMP都面临一系列生物物理挑战，必须通过靶向和插入机制加以克服。首先，IMP的疏水性TMD必须不断地与水性胞浆屏蔽。这种屏蔽至关重要，因为极度拥挤的细胞溶质环境（约300 mg/ml蛋白质）会促进潜在的毒性聚集和不适当的相互作用。因此，TMD需要在靶向机制从核糖体中出现时被识别。其次，IMP必须靶向适当的细胞器，这需要细胞溶质靶向因子与特定的膜受体结合。第三，TMD需要通过膜的高度极性表面进入脂质双层的疏水核心。TMD插入必须是不对称的，最终方向与IMP的最终折叠状态一致。这意味着插入机器必须识别、定向并为非常广泛的序列提供进入膜的潜在路径。

绝大多数IMP在合成时被靶向并插入ER中。这种共翻译途径是30多年前发现的，它利用了细胞用于跨内质网转运可溶性蛋白质的相同机制(Anderson等人，1982年,Lingappa等人，1978年,2007年拉波波特,Wickner&Schekman 2005年). 然而，一些仅在翻译终止后TMD才从核糖体中出现的IMP不能进入共翻译途径(Borgese等人，2003年,Kutay等人，1993年). 相反，这些蛋白质通过一种完全不同的途径在翻译后插入，其关键成分最近才被发现(Borgese&Fasana 2010年). 这篇综述总结了我们目前对这两种IMP插入途径的了解，强调了从它们的比较中得出的共同原则，并确定了未来悬而未决的问题。

膜蛋白的特性和多样性

目前对IMP插入的理解在很大程度上取决于对IMP基板进行检查、比较、操作和设计的广泛研究。这些研究确定了天然IMP的统计特征，并通过实验探讨了IMP序列、膜插入和拓扑结构之间的关系。因此，对于TMD的共同特征和影响插入的周围序列，我们有一个坚实的工作框架。该框架还提供了插入机械可以处理的序列和结构的近似限制范围。从这些研究中得出的一个重要结论是，IMP插入机构必须具有显著的灵活性和高度的动态性。在讨论插入机制及其与膜蛋白底物相互作用的性质之前，我们首先总结了这些以底物为中心的研究。

跨膜域

TMD的一般特征必须与其所在的脂质双层所施加的生物物理限制相兼容(White&von Heijne 2008年,White&Wimley 1999年). 为了插入内质网，“理想的”TMD是由非极性、主要是疏水性侧链组成的约20个残基α-螺旋。该长度最适合跨越内质网膜的~30-ω脂质双层，α-螺旋结构使亲水肽主链的氢键最大化，以保护其免受膜磷脂的疏水酰基链的影响。事实上，TMD的唯一功能是将可溶性结构域锚定在膜上，与理想的TMD紧密相连。因此，对这些原理的理解长期以来一直被用于推导主要基于疏水性的TMD预测算法(Argos等人，1982年,Kyte&Doolittle 1982年).

然而，大多数TMD不仅是膜锚，还对其所在的蛋白质发挥其他功能作用。这些功能发生在局部环境中，通常与TMD最初插入的ER脂质双层不同。许多TMD与其他TMD是更复杂的IMP的一部分。即使是单跨IMP的TMD也常常具有额外的功能，例如与其他蛋白质相互作用或被膜内蛋白酶裂解的能力(Urban&Freeman 2002年). 此外，不同腔室的TMD具有不同的长度和序列特征，这似乎反映了细胞膜之间的脂质组成、膜不对称性和生物物理特性的巨大差异(Sharpe等人，2010年). 然而，所有TMD必须插入ER，每个TMD必须在合成后不久被分入脂质双层。因此，TMD最初插入的环境可能与它发挥作用的最终环境明显不同。这必然意味着TMD序列具有竞争约束：一方面，TMD必须具有某些特征，才能被插入机器识别。另一方面，它还必须具备允许其特定贩运、集结和在其最终环境中发挥作用的要素。

例如，多面体（或多屏）IMP通常包含极性显著、异常长或短、扭结或螺旋倾向差的TMD(Elofsson&von Heijne 2007年). 这种TMD在最终的IMP三级结构中可以完全稳定，但单独查看时很难将其识别为TMD(图1b、 c（c）). 事实上，对来自多面体IMP的单个TMD的直接分析表明，它们在靶向和插入分析方面往往较差(Enquist等人，2009年). 这些考虑解释了为什么基于水疗的预测算法比多面体IMP更准确地预测单跨IMP的TMD(琼斯2007,Ott&Lingappa 2002年). 因此，很明显，除了TMD的序列特征外，其在更复杂蛋白质中的位置上下文直接影响其与膜的整合。易位机制是如何解释这些上下文线索并将其与局部序列特征相平衡的，目前还只是部分了解（下面讨论了可能的模型）。

跨膜结构域整合的决定因素

直接实验量化了绝缘20残基测试序列中每个氨基酸对TMD插入倾向的相对自由能贡献(Hessa等人，2005a,b条;Hessa等人，2007年,Lundin等人，2008年,White&von Heijne 2008年). 在这些广泛的分析中，测量了许多工程序列的总插入效率，这些序列在TMD定向、氨基酸组成和氨基酸位置方面存在系统性差异。这些测试序列经过仔细定位，均匀地放置在移位机器内，然后直接量化其净插入效率(图2一). 除了确认预期的对疏水性的强烈依赖性外，还确定并量化了每个氨基酸的位置效应。值得注意的是，位置效应密切反映了脂双层生物物理性质的变化，从亲水性头部基团到每个小叶酰基链的中心并置。在任何测试序列中，每个氨基酸的表观自由能贡献都是相加的，总和决定最终插入概率。这种“生物疏水性尺度”与使用模型肽的生物物理分配实验之间的强相关性(Ulmschneider等人，2005年;Wimley&White 1996年,2000)这表明，对于由工程序列绝缘的孤立TMD，插入近似于水环境（可能位于移位通道内）和周围脂质双层之间的热力学驱动平衡。

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用于探测插入和拓扑序列决定因素的分析系统。(一)整合膜蛋白（IMP）通过早期跨膜结构域靶向并停靠在转座子上(灰色)，以及稍后的测试序列(红色)测量插入。这两种可能结果的相对量通常通过修饰（如糖基化）进行分析。(b条)一个单跨IMP及其侧翼序列被系统地改变，底物被呈现给易位装置。通过这种以易位-插入系统为目标的组合实现的最终拓扑结构被分析，同样典型地使用糖基化作为读数。

拓扑的行列式

正如TMD的氨基酸组成决定插入概率一样，一级序列也影响跨膜片段的拓扑结构。IMP拓扑结构的第一个确定的也是最重要的决定因素是正内部规则，在细胞质中统计发现TMD两侧的正电荷（来自赖氨酸和精氨酸）(Hartmann等人1989,冯·海因1986b). 这种效应在细菌IMP中最为显著(冯·海因1986b)很可能受到穿过膜的质子动力的强烈影响(曹等人，1995年)以及在膜的细胞质表面含有阴离子磷脂的双层不对称性(van Klompenburg等人，1997年). 在类似的真核生物ER中，没有双层不对称性或质子动力，与拓扑的正内部统计相关性不太一致(Johansson等人，1993年;Sipos&von Heijne 1993年;冯·海涅，1986年,1989;Wallin和von Heijne 1998年). 然而，对于单跨IMP和多面体IMP的第一个TMD来说，这一点仍然显而易见。这种效应的基础至少部分是TMD侧翼电荷与Sec61转座子的静电相互作用的结果，这可能不利于正电荷跨通道转移(Goder等人，2004年).

研究蛋白质N末端附近的单个TMD如何插入双层(图2b条)确定了其他可能影响TMD方向的因素(Higy等人，2004年,2005). 较长或更疏水的TMD有利于I型拓扑结构（N端朝向内质网腔，C端朝向胞浆），可能是因为TMD首先以这个方向进入转座子(Goder&Spiess 2003年,Wahlberg&Spiess 1997年)“更强”的TMD会在重新定向之前分裂成脂质双层。相反，位于TMD N端两侧的快速折叠结构域往往会导致II型拓扑结构（N端朝向胞浆，C端朝向内质网腔），可能是因为折叠结构域在空间上阻碍了跨定位子的移位(Denzer等人，1995年). 类似地，在N末端已经转移到内质网腔（通过可切割的N末端信号序列）后遇到的内部TMD被限制为I型拓扑，因为N末端被阻止返回细胞溶质。

在多面体IMP中，相邻TMD必然具有备用拓扑，因此第一个TMD的插入强烈限制了整个IMP的方向(Wickner&Lodish 1985年). 然而，这一最初的决定并不是绝对的，显然会受到下游事件的影响。在一些蛋白质中，第一个TMD不足以单独指示插入到一个独特的拓扑结构中，并与下一个TMD合作插入(Skach&Lingappa 1993年). 在其他情况下，具有两个TMD的蛋白质似乎可以采样多种拓扑状态，因为将糖基化位点引入到干预序列中可能会通过迫使多肽区域留在内质网腔中而使最终结果发生偏差(Goder等人，1999年). 因此，至少一些TMD可能会在最终插入双层之前对多个拓扑进行采样。确切地说，当拓扑不可逆设置时，仍不清楚，因为已经描述了多面体IMP的动态重定向的几个示例。例如，蛋白质Aquaporin-1最初是作为四TMD蛋白质制造的，但后来获得了六TMD拓扑结构(Lu等人，2000年). 最近，一个四TMD蛋白C末端的单个电荷突变足以完全逆转该蛋白的最终拓扑结构(Seppala等人，2010年). 这意味着即使最后一个密码子也不能不可撤销地设置拓扑，这表明非常遥远的序列元素可以影响更早合成的TMD的插入和拓扑。

预测的复杂性和局限性

边缘疏水TMD的插入和拓扑结构尤其受到局部和远距离位置效应的影响，包括侧翼和下游序列、相邻TMD的命运和三级相互作用，如与相邻TMD氢键(Enquist等人，2009年,Meindl-Beinker等人，2006年,Nilsson等人，2000年,Sato等人，1998年). 这不仅在如上所述的多面体IMP中明显，而且在单个TMD中也可以看到，其插入可能受到50多个氨基酸残基以外的带电氨基酸簇的影响(Fujita等人，2010年). 因此，从模型底物阐明的经验规则不一定适用于单独检查的TMD，尤其是在多面体蛋白中。

这些效应可能发生在翻译过程中，也可能是蛋白质折叠后期翻译后调节的结果(Kouko等人，2010年). 多面体IMP中不同的序列行列式如何合作决定最终拓扑结构的完整程度尚不清楚，并且仍然很难区分局部效应和全局效应的贡献，迄今为止只在少数情况下进行了研究(Gafvelin和von Heijne 1994年,Sato等人，1998年,Seppala等人，2010年,Skach 2009年). 因此，复杂IMP的高可靠性拓扑预测仍然是一个挑战，不同预测方法之间的一致性相对较差(Fagerberg等人，2010年,琼斯2007,Ott&Lingappa 2002年). 为了更好地理解和预测多面体IMP的插入，扩大IMP可用结构的数量至关重要。只有这样，才能准确地测试使用模型蛋白的一小部分从实验验证中导出的预测算法。此外，了解插入机制如何与TMD相互作用并促进TMD在分子细节中的整合，可能会为IMP的主要氨基酸序列如何解码为其最终结构提供更多见解。

共翻译膜蛋白插入

大多数真核IMP以共翻译方式插入ER膜。遗传、生化和系统发育分析，包括用纯化成分重建模型IMP插入的功能，确定了该插入途径的最小成分(Deshaies&Schekman 1987年,哥里奇和拉波波特1993,Görlich等人，1992年b,Jungnile等人，1994年,Oliver等人，1995年,Poritz等人，1990年,Rapoport等人，2004年,Rothblatt等人，1989年,Stirling等人，1992年,Wickner&Schekman 2005年). 靶向和插入机制在所有生物体中都是保守的，它们不仅用于IMPs，还用于可溶性蛋白的易位。在操作上，该途径可分为两个步骤：识别/靶向新生IMP到ER-localized转座子，以及将IMP移位/插入ER膜。

识别和瞄准

IMP靶向作用是在第一个疏水性元件（可切割的N末端信号序列或TMD）从翻译核糖体中出现时介导的。这种疏水结构域被核糖体上的信号识别颗粒（SRP）识别，通过与SRP受体（SR）的相互作用进入内质网，并通过GTPase依赖性步骤转移到Sec61转座子(Grudnik等人，2009年,Keenan等人，2001年,Wild等人，2004年;图3一). 与SRP结合的平移IMP基板的中分辨率（~8–12μl）低温电子显微镜结构(Halic等人，2004年)，核糖体-SRP-SR复合物(Halic等人，2006年)和核糖体上升链（RNC）-Sec61复合物(Beckmann等人，1997年,Beckmann等人，2001年,Ménétret等人，2000年,Morgan等人，2002年)提供如何实现目标的一般框架(Halic&Beckmann 2005年). SRP和SR几个关键领域的大量生物化学研究和高分辨率晶体结构对这一总体框架进行了实质性的改进和说明(Grudnik等人，2009年).

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共翻译膜蛋白插入的基本步骤。(一)核糖体上的信号识别颗粒（SRP）通过疏水性跨膜结构域（TMD）（或信号序列）识别完整膜蛋白（IMP）。它通过SRP受体（SR）靶向内质网（ER）膜并转移到Sec61易位通道。转移反应伴随着第二个识别步骤，这次是Sec61通道。然后，TMD通过侧向进入Sec61通道提供的脂质双层整合到膜中。下面的最后两个图是TMD早期和晚期集成步骤的示意图，其中TMD(红色)通过横向开口离开Sec61通道。(b条)核糖体上SRP的示意图，取自冷冻电子显微镜分析。SRP54的信号序列识别域（M域）以绿色表示，位于核糖体上的出口通道附近。Alu结构域中靠近延伸因子位点的部分结合在一起以减缓平移，以粉红色显示。(c（c）)SRP54的M结构域在两个视图中，疏水残基以绿色表示。红色球体表示疏水槽内信号序列（或TMD）结合的位置。

在普遍的模型中，SRP的54-kDa亚基（SRP54）位于核糖体的出口通道，并通过其M域与疏水性底物相互作用，而SRP的Alu域在核糖体上的延伸因子结合位点附近结合以减缓翻译(图3b条). 在SRP-SR相互作用后，SRP-核糖体复合体移动，将核糖体出口隧道部位的一部分暴露于Sec61。据推测，当Sec61与该暴露位点结合时，新生链从SRP转移到Sec61，SRP-SR复合体被分解，平移暂停被缓解。这些事件由SRP54的GTPase活性以及SR的α和β亚基协调，每个亚基对与底物、彼此、核糖体和易位子的相互作用都有反应。靶向反应的细节以及如何协调各个步骤在其他地方进行了广泛的审查(Grudnik等人，2009年,Keenan等人，2001年).

在本次审查中，有几个概念要点值得强调。首先，SRP与疏水信号或TMD的相互作用通过SRP54的M域中的深疏水槽发生(图3c（c）). 该结构域的X射线结构显示，疏水槽中排列着许多蛋氨酸，这些蛋氨酸被认为通过其柔性侧链促进不同序列的调节(Janda等人，2010年,Keenan等人，1998年). 因此，在RNC的背景下，SRP是相对杂乱和序列无关的，可以成功地靶向各种潜在IMP。其次，相互作用精确地发生在核糖体出口通道(Halic等人，2004年) (图3b条)从而完全排除TMD暴露于大量胞质溶胶。在协调传输至Sec61信道之前，保持这种交互，确保在瞄准期间持续屏蔽TMD。第三，SRP与第一个TMD的交互会暂时减慢转换速度(Lipp等人，1987年,Walter&Blobel 1981年). 这增加了瞄准的动力学窗口(Lakkaraju等人，2008年,Mason等人，2000年)并防止下游TMD在与转座子对接之前接触到胞浆。最后，TMD可能会以协调和明确的方式呈现给Sec61频道(Jiang等人，2008,Song等人，2000年)，尽管对这一步了解甚少。协调传输可能很重要，因为Sec61上的假定信号序列或TMD结合位点可能深埋在其结构中(van den Berg等人，2004年). 因此，假设RNC启动Sec61信道以接受信号序列或TMD(Osborne等人，2005年)类似于细菌中的其他易位伙伴（如SecA）如何启动SecY（Sec61α同源物）(Zimmer等人，2008年). 通过这种方式，TMD在整合前最少暴露于细胞溶质，这一主题似乎也适用于翻译后IMP插入（如下所述）。

Sec61-蛋白质传导通道

插入共翻译底物的内质网转座子中心由Sec61复合物组成，这是一种由α、β和γ亚基组成的异源三聚体。Sec61α无疑是形成易位通道的成分，为TMD插入脂质双层提供了一条侧向通路。早期的生物化学、生物物理和冷冻电镜研究表明，转座子通过保守和物种可交换的结合位点与核糖体紧密结合，并与核糖体道形成一条连续的通道，新生链通过该通道出现(Beckmann等人，1997年,Prinz等人，2000年). 电生理学测量和环境敏感荧光探针表明，新生蛋白质最初进入易位时处于水性环境中，功能重建明确确定Sec61复合物是促进IMP插入的核心因素(Crowley等人，1993年,1994;哥里奇和拉波波特1993;Simon&Blobel 1991年). 此外，交联研究表明，TMD在插入过程的早期，即与脂质相互作用之前或同时，与Sec61α持续相互作用(Do等人，1996年,Heinrich等人，2000年,Martoglio等人，1995年,Mothes等人，1997年)这表明Sec61复合物在蛋白质和脂质环境之间形成了插入TMD的界面。这与IMP插入的最简单情况一致，在这种情况下，转座子被动地促进TMD在其水性内部和周围疏水性双层之间的分配。

Sec61复合物的古生物和细菌同源物的高分辨率晶体结构提出了TMD侧向释放到脂质双层的机制模型(Tsukazaki等人2008,van den Berg等人，2004年) (图4a、 b条). 这些结构表明，一个Sec61异源三聚体由α亚基的伪对称排列组成两个结构域，分别由TMD 1–5和TMD 6–10组成。这些结构域形成一个沙漏状的水孔，由两个对称的漏斗状空腔组成，在双层中间汇聚成疏水残基的收缩环。在孔的内腔侧，一个短螺旋线被确定为塞子填充在漏斗的中心。γ亚基由两条螺旋组成：一条形成TMD，斜穿过两个α亚基结构域之间的界面，另一条位于膜的细胞质表面。β亚单位的单个TMD排列在α亚单位的第三面，使第四面通畅，作为从中央通道进入脂质双层的假定侧门。这个侧浇口的界面很复杂，主要由螺旋线2和7形成，螺旋线3和8起作用(图4一).

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Sec61转座子和潜在辅助因素。(一)从内质网（ER）腔和膜平面（旋转90°）观察Sec61复合体古生物同源物的结构表征。左半部和右半部显示出伪双重对称性。螺旋组织在被短螺旋塞堵塞的中心孔周围(紫色). 这两条蓝色螺旋线是螺旋线2和螺旋线7，它们形成了所谓的侧门。当它们被分离时，它们提供了从中央孔进入脂质双层的途径。在脂质双层视图中，请注意塞（位于中央孔中）直接位于侧门的后面，这说明了当门螺旋体分开时，脂质的进入是如何被调节的。(b条)面板中结构的示意图一. (c（c）)跨膜结构域（TMD）从Sec61通道（从内质网管腔观察）的横向退出如何受到以下因素影响的示意图反式-起作用的辅助因素。基线模型显示TMD(红色)拴在新生的链条上(黑线). 新生链位于中央通道，而TMD位于侧闸门。图上的箭头表示TMD在侧门和周围的脂质双层之间的分区(灰色平面). 如果局部环境被不同的脂质成分或附近的蛋白质改变，这种分配可能偏向膜。相反，与转座子结合的蛋白质可能会影响其动力学特性，例如打开侧门，从而不利于分裂成脂质双层。在最后一张图中，直接与TMD结合的辅助蛋白，如TRAM（易位链结合膜蛋白），也可以使TMD偏离Sec61通道。

广泛的交联研究令人信服地认为，在易位和IMP整合过程中，晶体结构中确定的假定通道容纳了新生链(Cannon等人，2005年). 为了实现这一点，第一个疏水信号序列或TMD与Sec61复合物的相互作用可能会将塞子从孔腔侧移开，并导致通道打开（参见中的最后步骤图3一). 顶盖位移的机制尚不清楚，但当第一个TMD或信号序列位于侧向闸门螺旋线2和7之间时，可能会发生顶盖位移。酵母和大肠杆菌使用信号序列的系统支持这种交互(Plath等人，2004年,Wang等人，2004年)这两条螺旋线与插头并置表明它们之间存在潜在的通信(van den Berg等人，2004年) (图4一). 值得注意的是，插入域或收缩环中的突变体大肠杆菌和酵母具有信号序列抑制因子（prl）表型，这允许部分缺陷的信号序列或TMDs与混杂的通道结合，正如从偏向开放状态的通道所预期的那样(Derman等人，1993年;Junne等人，2006年,2007,2010).

一旦塞子被移动并且通道处于开放状态（此类结构的配置仍然难以捉摸），它可以在其主要亲水通道内容纳横跨双层的新生链，同时仍然提供通过侧向门进入脂质双层的垂直点(图4c（c）). 通过这种方式，单个Sec61复合物可以允许跨膜转运或插入膜。单一Sec61异源三聚体是否始终是功能性转座子的活性状态尚不确定。对于分泌型和相对简单的（例如单跨）IMP，不需要借助额外的复杂性来令人满意地解释其移位和插入（尽管这并不排除其他因素发挥最大效率的关键作用）。然而，下文所述复杂IMP的大量观察结果表明，它们的正确插入很难与单一核糖体结合Sec61异源三聚体作为唯一机制相协调。

辅助因素

尽管Sec61复合物是共翻译IMP插入所必需的核心因子，但许多辅助因子可能有助于IMP以底物特异性方式的生物发生。事实上，更广泛的转座子是Sec61复合物与相关膜蛋白（包括酶（如信号肽酶复合物和寡糖转移酶复合物）、假定的辅助因子（如转座子相关蛋白（TRAP））的一个不明确的集合复合物和易位链相关膜（TRAM）蛋白]、膜伴侣（如Calnexin）和功能不明确的蛋白质[如核糖体相关膜蛋白4（RAMP4）、Sec62、Sec63、p180等](哥里奇和拉波波特1993,Meyer等人，2000年,Pina等人，2011年,Savitz&Meyer 1990年,Tyedmers等人，2000年,Yamaguchi等人，1999年). 许多这种机械的结构、化学计量和功能尚不清楚，它们在移位或膜插入中的作用基本上尚未探索。

一些辅助因子，如信号肽酶和寡糖转移酶，是IMP正确折叠和成熟所必需的，在某些情况下，也可能影响拓扑结构(Goder等人，1999年,Yamagishi等人，2011年). 其他如TRAP与膜结合核糖体稳定相关(Ménétret等人，2000年)并可能直接影响核糖体-转运蛋白复合物的结构(Fons等人，2003年,Ménétret等人，2000年)和/或Sec61 translocon的功能(Fons等人，2003年). 而其他的，如TRAM，则可以与新生易位蛋白的一个子集交联(Do等人，1996年,Görlich等人，1992年,Heinrich等人，2000年,Mothes等人，1994年). 如果有的话，这些因素在Sec61转座子附近会对IMP生物发生产生什么影响？

至少有三种可能的影响(图4c（c）). 首先，辅助因子可以暂时与新生链的部分直接相互作用，直接影响其移位、定向或膜插入。其次，一个辅助因素可能会改变插入TMD在离开Sec61通道时遇到的局部环境，因为它位于Sec61侧门附近，或者可能会影响局部脂质组成。第三，辅助因素可能与Sec61复合体相互作用，影响其动力学特性，例如其侧门的迁移率。这些机制在很大程度上仍然是假设的，但每种机制都会通过改变其在Sec61通道外的移位或分配行为来影响TMD的插入。

在各种转座子成分中，TRAM作为IMP生物发生的潜在辅助因子得到了最好的研究。TRAM是一种包含至少八个TMD的完整ER蛋白，通常位于Sec61复合物附近，是重建几个模型IMP整合所必需的(哥里奇和拉波波特1993). 交叉链接研究表明，TRAM可以与两个信号序列相互作用(Görlich等人，1992年,Voigt等人，1996年)和TMD(Do等人，1996年,Heinrich等人，2000年,McCormick等人，2003年)在Sec61α附近，支持在处理疏水结构域中发挥直接作用。功能研究表明，TRAM对具有弱疏水性信号序列或TMD的蛋白质的易位具有特别的刺激作用，并在不同程度上促进不同底物的整合(Heinrich等人，2000年,Voigt等人，1996年). 因此，TRAM可能仅在某些情况下是必要的，例如那些需要膜伴侣在能够插入双层的阈值处稳定边缘疏水性TMD的情况。TRAM可以在多面体IMP的插入中发挥类似的重要作用，在其协调分配到双层之前暂时“保持”一个或多个TMD(Do等人，1996年,Heinrich等人，2000年,Sadlish等人，2005年). 交联研究表明，多面体IMP的多个TMD在明显释放到双层之前与Sec61α和/或TRAM同时相互作用，这一点得到了支持(Heinrich&Rapoport 2003年,Sadlish等人，2005年). 因此，通过改变Sec61通道的局部环境，TRAM等蛋白质可能会使固有TMD疏水性标度发生偏移，从而有利于从通道中侧向退出。相比之下，可以想象，限制Sec61复合物动力学的蛋白质可能会通过缩小易位TMD的脂质接触窗口，限制侧门开放以防止插入。

共翻译膜蛋白拓扑发生

有了以上关于IMP底物的主要特征和Sec61复合物的基本性质的知识，如何对TMD识别和膜拓扑确定的整体图景进行概念化？这个问题很复杂，如上所述，可能不仅取决于TMD，还取决于其侧翼结构域、多肽内的位置、生物发生之前发生的事件以及许多其他因素。作为一个简化的起点，我们首先考虑一个由转座子结合核糖体合成的通用潜在TMD（即暂时不考虑靶向性），其中前面和后面的序列未指定(图5一).

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跨膜结构域（TMD）插入模型。(一)TMD-转座子相互作用的通用模型。TMD最初从核糖体中出现时(红色)进入Sec61通道的细胞溶质前庭(➀). 这个初始亚稳态允许新生链对两个方向中的任何一个进行采样(➁, ➂). 这些状态被设想为在有限的时间内是可相互转换的，直到TMD以一个或另一个方向横向移动到脂质双层中(➃, ➄). (b条)根据各种参数，面板中的事件顺序一可能偏向于一种或另一种结果。在所示示例中，N端域很长并且部分折叠(橙色)当TMD从核糖体中出现时。这极不利于其移位到内腔，这是I型拓扑采样的要求。因此，它的取样和最终插入II型方向是理想的结果。(c（c）)多面体整膜蛋白（IMP）中TMD非顺序插入的示例。从左侧开始，多面体IMP开始插入。在所示阶段，TMD1(黄色的)已插入，TMD2(绿色)正在进入易位通道。然而，由于TMD2的序列特征，它不被转座子识别，被跳过，导致其移位到内质网（ER）腔。TMD3型(红色)然后以与面板中所示类似的方式制作并与translocon交互一其局部序列特征非常有利于II型定位（与TMD1相同），从而迫使蛋白质先前易位部分（包括TMD2）的片段回到易位通道。微疏水TMD2现在可以与TMD3一起插入膜中。

跨膜域-转座子相互作用

光谱和交联研究表明，当候选TMD完成合成并位于核糖体隧道内时，它可以与隧道内的蛋白质相互作用，并被诱导形成更紧密（可能是α-螺旋）的结构(Woolhead等人，2004年). 据推测，并非每个TMD都需要这样的事件，但它似乎代表了TMD识别的第一点(Liao等人，1997年). 有趣的是，在胞浆中观察到类似的TMD或核糖体内的其他基序感应，对核糖体结构产生影响（例如，通过向其表面招募因子）(Berndt等人，2009年,Mariappan等人，2010年)和功能（如平移失速或延迟终止）(Mariapan等人，2010年,Nakamura等人，1996年,Yanagitani等人，2011年). 是否在转座子处观察到RNC的类似作用尚不完全清楚，但这可能涉及核糖体-转座子复合物结构的改变，也可能涉及转座子组成的改变(Liao等人，1997年,2009年人才库,Woolhead等人，2004年). 这种结构变化可以使转座子在TMD从核糖体中出现时准备好处理TMD。

接下来，候选TMD退出核糖体隧道，可能进入Sec61复合体的细胞溶质前庭(图5一). 目前对TMD的二级结构了解甚少，但考虑到至少一些TMD能够对多种构象和拓扑方向进行采样，因此可能具有高度动态性(Goder&Spiess 2003年,Goder等人，1999年). TMD（和紧邻的侧翼区域）可以通过与Sec61通道残基的相互作用而部分稳定(Goder等人，2004年;Junne等人，2006年,2010;McCormick等人，2003年)或附近的膜蛋白，如TRAM(Do等人，1996年,Heinrich等人，2000年). 随着TMD以外至少20个残基的进一步合成，它将有可能自由地对I型和II型拓扑进行采样。

在I型构型中，下游多肽将驻留在细胞溶质前庭和/或位于核糖体和易位子之间的线轴上(图5一,左边). 在II型结构中，下游多肽将位于Sec61通道内(图5一,正确的). 在拓扑方向取样期间，TMD的位置和二级结构尚不清楚，但可能至少部分取决于其氨基酸组成和疏水性。最吸引人的可能性是TMD是α螺旋的，并在侧门处保持平衡，在那里它可以对脂质环境进行采样，并可能退出通道(Hessa等人，2005a,2007). 交叉链接研究证明，TMD从相对刚性的位置与Sec61通道进行蛋白质相互作用(McCormick等人，2003年,Sadlish等人，2005年). 已观察到一些TMD与TRAM和/或脂质同时交联到Sec61α(Do等人，1996年,Heinrich等人，2000年,Martoglio等人，1995年,Mothes等人，1997年,Sadlish等人，2005年)这表明它们位于侧门。如果没有其他约束，TMD将基于局部序列特征（如TMD疏水性、长度和侧翼电荷）确定方向。通过进一步合成，候选TMD可以横向分割成双层（可能通过横向栅极）(Heinrich等人，2000年).

假设在膜结合核糖体上合成的大多数（如果不是全部的话）TMDs都是以这种通用的方式处理的，即它们与核糖体、Sec61复合物和辅助因子进行某些定型的相互作用，这是很有吸引力的。每个TMD的独特之处在于其采样不同拓扑结构和/或脂质双层的能力受到限制。这些限制可能由局部序列特征（TMD疏水性、氨基酸组成、侧翼电荷）、位置上下文（TMD在蛋白质中的位置）以及反式-影响因素。这些约束对TMD动态的净影响将是以高度关联的方式偏置每个TMD的拓扑和插入。考虑到这个框架，现在让我们考虑一下它如何应用于从简单到复杂的不同类型的蛋白质。

单筛分膜蛋白

一般机制很容易解释在N末端约40个残基内仅含有TMD的单跨IMP(Higy等人，2004年). 在这些情况下，N端域足够短且无结构，以避免TMD对每个拓扑进行采样。在II型取向中，N末端结构域是细胞溶质，而I型取向的取样需要N末端结构区通过水性Sec61通道易位或位于水性Sec61-通道内。TMD的整合确保了最终的拓扑结构，蛋白质的剩余部分在膜结合核糖体上完成合成。

当TMD之前的N端域较长或结构化时，情况会发生变化(Kida等人，2001年,2005). 现在，TMD对I型拓扑进行采样的能力不受欢迎，因为N端域无法轻松通过狭窄的Sec61信道(图5b条). 因此，倾向于对II型方向进行采样，从而在TMD集成后对最终拓扑产生偏差。I型拓扑结构基本上不受欢迎的N端结构域长度在某种程度上取决于N端序列的特征，但根据对天然蛋白质的检测，它似乎约为50–60个残基(Wallin和von Heijne 1995年).

为了制造具有更长N末端结构域的I型蛋白质，在合成TMD之前，通常需要一个可切割的N末端信号序列来启动N末端的移位。一旦N末端连接到内腔，TMD就会从核糖体中出现，并可能经历上述相同的一般步骤，但无法轻易取样II型拓扑结构（因为已经移位的N末端需要通过Sec61通道拉回以适应这种情况）。因此，该约束会使I型拓扑中的插入产生偏差。

因此，即使是这些简单IMP的拓扑也由局部序列特征（例如疏水性和侧翼电荷）和更多全局约束（例如N末端结构域的长度和结构）的组合决定。如果全局约束严重，则可以绕过不利的局部特征。例如，具有大N端域的II型IMP可能不需要遵守正插入规则，以确保有效插入到正确的拓扑中，因为这种替代方案非常不受欢迎。因此，TMD上下文（有时甚至比局部序列元素还要多）可以在插入和拓扑中发挥非常大的作用；这一原则对于下一步考虑的多面体IMP尤其重要。

多主题膜蛋白

30多年前提出的最早的多面体IMP插入模型设想了每个TMD从核糖体中出现时的连续整合(布洛贝尔1980,Wessels&Spiess 1988年). 这种顺序插入模型显然是可行的，它要求每个TMD及其局部序列元素具有足够的鲁棒性，以驱动其转座子识别和膜插入。由于多面体IMP中的TMD需要交替方向，因此每个TMD都应该包含关键的拓扑决定因素，例如不对称侧翼电荷。这加上前面TMD施加的限制，将促进适当的生物发生。对于某些蛋白质来说，这种情况很可能发生，在细菌系统中，顺序插入相对常见是可行的，因为细菌系统中的正插入规则要严格得多，插入机制似乎更简单。

如上所述，真核多面体IMP在结构上更加多样化，其TMD比原核IMP更少定型。这可能是因为它们需要在不同的交互和监管方面具有更大的功能动态性，从而施加相当大的顺序约束，这些约束可能与插入所需的约束冲突。这些相同的特征也可能是为什么真核IMP在异源系统中表达不佳，相对于原核IMP难以结晶的原因。这些和其他考虑因素意味着，尽管如此，仍必须在本地IMP的上下文中插入那些孤立地无法插入的识别性差的TMD(Enquist等人2009,Lu等人，2000年). 想象一下这是如何发生的一种方式是，如果通常不利于TMD插入的局部贡献可以被蛋白质其他部分强加的强大约束所克服(Fujita等人，2010年,Kouko等人，2010年,Nilsson等人，2000年,Yamagishi等人，2011年).

作为一个例子(图5c（c）)假设多面体IMP的第二个TMD（TMD2）疏水性较差，因此在首次合成时未被识别为TMD。这段多肽不是插入膜中，而是转移到内质网腔中。合成后期产生的是TMD3，它具有很强的局部拓扑决定因素，并且具有适当的疏水性，可以有效插入膜。TMD3将进入易位，可能对不同的取向和状态进行采样，并横向插入膜中。如果TMD3强烈支持与已插入的TMD1相同的拓扑结构，则会迫使一段干预多肽跨越膜。当以这种方式进行约束时，能量消耗最小的结果是将先前跳过的边缘TMD2插入膜中。因此，在这种情况下以及相关的情况下，TMD可以不连续地插入，其中一些暂时跳过并短暂停留在内质网腔或胞浆中。人工构建的多面体TMD已经证明了这一点，在内质网腔和胞浆中都观察到弱识别的TMD(Goder等人，1999年,Kouko等人，2010年,Yamagishi等人，2011年). 即使在体内，在多面体IMP生物合成过程中，天然IMP的TMD至少暂时进入胞浆和/或内质网腔(Cheng&Gilmore 2006年).

可以进一步设想这一主题的几个变化。首先，候选TMD可以临时存储在集成地点或附近，而不必完全释放到膜中，而不是被完全跳过(Do等人，1996年,Sadlish等人，2005年). 这种TMD可能由辅助蛋白或Sec61复合物的一部分持有。此类临时TMD可在稍后通过上述相同机制，根据下游事件整合甚至重新定向(Kouko等人，2010年,Lu等人，2000年). 在更复杂的场景中（建立在基本相同的原则上），可以临时存储或跳过多个TMD，只是为了在它们最初遇到translocon后重新定向和集成。在极端情况下，TMD子集的重新定位和插入将在翻译后完全发生，这一过程类似于可溶性蛋白折叠(Kouko等人，2010年,Lu等人，2000年,Skach 2009年). 这种翻译后IMP折叠（以及可能的重新定向）是如何发生的，目前还完全没有研究。在非序列或翻译后插入的每一种不同情况下，可能需要胞浆、膜和/或腔中的伴侣来稳定中间产物，以尽量减少非途径相互作用。

上述框架是从最简单的模型蛋白研究发展而来的，这些模型蛋白探索了TMD-转座子相互作用的机制问题，并结合了复杂蛋白的平行研究，阐明了初生IMP可能经历的体操类型。然而，除了Sec61综合体和可能的TRAM之外，这些拟议过程所需的机制仍然探索得很差。事实上，只有稳健插入的模型I型和II型单跨IMP才能用纯化的Sec61复合物和TRAM重建到任何合理的效率(哥里奇和拉波波特1993,Oliver等人，1995年). 因此，尽管我们可以大致解释插入机制如何适应序列和生物物理特性差异很大的TMD，但分子水平的理解仍有待严格发展。

理解共同翻译途径的挑战

在上面，我们提出了一个合并的共翻译IMP插入模型，该模型平衡了纯热力学效应与其他因素的贡献，这些因素可以通过多种方式修改或约束TMD插入。单个TMD在隔离插入物中通过其净“生物疏水性”进行分析的观察(Hessa等人，2007年)提出了一种潜在的水-脂分配机制，该机制与从结构研究中推导出的侧向门控核心Sec61通道非常吻合(van den Berg等人，2004年). 然而，这一基本原理必须通过几个额外的变量进行修改，例如复杂IMP的TMD预测失败、在天然蛋白质中观察到的大量非经典TMD，以及工程IMP和天然IMP研究中插入行为的多样性。为了解释这些无数的观察结果，我们的工作模型提出，处理新制造的疏水元件的基线定型机制是由以下因素的组合动态偏置的顺式-作用局部序列元素，更遥远的全局约束，以及反式-起作用的辅助因素。

我们目前对顺式-作用序列行列式（局部和远距离）相当广泛，可以根据需要进行进一步的细化。然而，关于转座子如何解释这些序列的机械图像是有限的。尽管ER处共翻译IMP插入的核心机制已经确定，结构信息正在出现，但功能细节仍不清楚。虽然很早以前就实现了用纯化膜因子对模型IMP插入物进行非常优雅的重组(哥里奇和拉波波特1993)其随后应用于理解详细机制或复杂IMP插入在技术上具有挑战性。目前，基本上所有体外插入研究都使用粗制ER微粒体，其膜因子既不明确，也几乎完全不易操作。因此，未来的一个主要目标是开发一种由纯化的重组蛋白重组而成的健壮但具有高度可塑性的插入系统。

开发方法，高效地重述并准确地检测复杂IMP插入由可溶性ER膜提取物重建的蛋白质脂质体中，是一个重要的直接目标。最终计划是用重组来源产生的关键因子（例如Sec61复合物或TRAM）替换关键因子，从而进行详细的结构-功能分析。对于对重要细胞过程（如IMP插入）的机械洞察，这种生物化学策略（与平行结构研究相结合）将是成功不可或缺的，因为间接影响和代偿性变化很难用敲除策略控制。对于IMP生物发生的更细微方面，例如插入模糊的TMD或确保高保真拓扑确定(Junne等人，2007年,Tipper&Harley 2002年)仔细设计的基因筛查或精确的分析结合大规模的突变收集可能有助于确定假定的辅助因子的作用。

转移后膜蛋白插入

尽管大多数ER-IMP是靶向的，并且是共翻译插入的，但一个亚群是翻译后插入的。尽管Sec61与其他因子（如Sec62和Sec63）的复合物可以介导酵母中可溶性蛋白质的翻译后易位(2007年拉波波特,Wickner&Schekman 2005年)，还没有发现在翻译后膜蛋白插入中的作用。这意味着另一种可能将膜蛋白子集插入内质网膜的方式。翻译后插入的蛋白质将包括任何含有TMD的IMP，这些TMD在翻译过程中暴露于胞质溶胶的时间不够长，无法被核糖体结合的SRP有效识别。这些蛋白质的翻译终止使其成为较差的SRP底物，需要通过纯粹的翻译后机制进行识别、靶向和插入。

这类蛋白质的例子包括任何方向的极小IMP和尾锚定（TA）蛋白质，它们仅在C末端约40个残基内含有TMD(Borgese&Fasana 2010年,Chi等人，1996年,科伊奇等人，2005年,Navarre等人，1994年,Wawrzynow等人，1992年)（请参见图1一). 小IMP的数量尚不清楚，主要是因为它们很难通过生物信息学进行识别。尽管如此，一些研究表明，小蛋白（其中许多被预测为IMP）在基因组注释中的代表性相当低(Frith等人，2006年,Gerstein等人，2010年,Hemm等人2008,Ingolia等人，2009年,Roy等人，2010年).

相比之下，TA蛋白得到了很好的注释，生物信息学研究表明，它们包含了大多数真核生物基因组中约3-5%的IMP(Beilharz等人，2003年,Kalbfleisch等人，2007年). 在哺乳动物中，这相当于~300–400，其中大多数靶向内质网进行插入(Wattenberg&Lithgow 2001年). 它们功能多样，成员参与细胞内运输（例如，基本上所有SNARE）、蛋白质移位（例如Sec61β和γ）、蛋白质成熟、降解、细胞器结构和脂质稳态(Borgese等人，2003年). 因此，它们的正确插入在所有真核生物中都具有基本的细胞重要性。

TA蛋白参与SRP通路的逻辑不相容性早就被认识到了(Kutay等人，1993年). 此后不久的研究严格证明，对于模型TA蛋白，翻译后插入既不依赖也不有效地参与SRP-Sec61系统(Brambillasca等人，2005年,Kutay等人，1995年,Steel等人，2002年,Yabal等人，2003年). 尽管随后的许多研究证实，这与ATP和蛋白质依赖的过程有关(Abell等人，2007年;Kim等人，1997年,1999;Masaki等人，2003年)直到最近，TA-蛋白插入途径的具体机制或连贯框架仍不清楚。由于翻译后IMP插入途径需要克服共同翻译途径面临的相同生物物理障碍，因此在共同翻译途径中建立的概念对于解释翻译后途径至关重要。

TRC40：一种尾锚定蛋白靶向因子

在共翻译途径中，SRP既起到伴侣作用，又起到靶向作用，确保在细胞溶质转运过程中完全屏蔽其疏水性物质，直至到达转座子。由于TA蛋白必须有类似的伴侣，生物化学策略寻找TMD依赖的相互作用伙伴，这些伙伴在成功靶向膜之前一直保持关联(Favaloro等人，2008年,Stefanovic&Hegde 2007年). 这导致鉴定出一种高度保守的基本细胞溶质ATP酶，命名为TRC40，用于40kDa的TMD识别复合物(Stefanovic&Hegde 2007年). TRC40在进化上与细菌亚砷酸盐转运因子ArsA有关（因此其最初的注释为Asna-1），尽管其在真核生物中的功能明显不同，在TA插入中发挥作用。

在体外哺乳动物系统中进行的无偏倚生化研究确定TRC40是大多数（但不是所有）新合成的ER-靶向TA蛋白在胞浆中通过TMD依赖性结合的主要相互作用伙伴(Favaloro等人，2008年,2010;Stefanovic&Hegde 2007年). 重要的是，TRC40没有与来自翻译核糖体的TMD相互作用，但更喜欢在C末端附近含有TMD的核糖体释放蛋白(Stefanovic&Hegde 2007年). 相反，SRP与核糖体释放TMD的相互作用通常效率低下，可能是因为SRP相对于核糖体出口隧道的精确定位高度支持SRP与底物的相互作用。这些观察结果有助于解释为什么TRC40和SRP途径尽管在其他方面识别出相似的TMD，但它们并不相互竞争或干扰。进一步研究表明，TRC40在内质网膜上具有假定的蛋白受体，该受体以依赖于TRC40 ATP酶活性的方式刺激底物释放。随着TRC40的释放，TA蛋白被插入到膜中。因此，TRC40作为一种细胞溶质伴侣蛋白的鉴定为翻译后TA-蛋白的插入提供了基本框架(Stefanovic&Hegde 2007年;图6一).

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尾锚定（TA）蛋白插入。(一)介导TA蛋白翻译后插入的已知成分和步骤的示意图模型。当合成TA蛋白的跨膜结构域（TMD）时，它有助于向核糖体表面募集预靶向因子。哺乳动物体内由Bag6、TRC35和Ubl4A组成。酵母中的类似复合物由Sgt2、Get4和Get5以及其他伴侣形成。它位于核糖体附近，有利于TA蛋白释放后的捕获。预靶向因子和靶向因子（哺乳动物中为TRC40，酵母中为Get3）(粉红色)成立TRC。这被认为是一种瞬态复合物，有助于TA蛋白的分类、识别和装载到靶向因子上。靶向因子是一种ATP酶，其底物结合形式被认为是ATP结合的（用T表示）。这通过酵母中由Get1和Get2组成的受体传递到内质网（ER）膜（Get1的哺乳动物同源物可能是WRB）。Get1-2-3的对接复合物在某种程度上促进了底物的释放和插入，这取决于Get3对ATP的水解。现在的活性Get3（处于不同的开放构象中）被回收到胞浆中，以完成插入循环。(b条)Get3二聚体在开放构象（缺乏核苷酸）和闭合构象（结合ADP-AlF）中的结构表征4). 在左边的两个结构中，疏水残基显示为绿色，说明闭合构象包含一个大的疏水槽。右侧面板显示了与模型TA蛋白TMD区域结合的闭合构象的假设模型。疏水性TMD（19个残基）显示为红色，侧翼序列显示为金色。

酵母的GET途径

TRC40的高度进化保守性大大加快了这一基本框架的进展。这个酿酒酵母同源物（最初称为Arr4，再次基于其与ArsA的序列同源性）与一系列看似不同的表型相关，这些表型都是膜相关过程(Auld等人，2006年,Shen等人，2003年). 分泌突变体大规模遗传交互作用研究中发现的囊泡转运缺陷(Schuldiner等人，2005年)，将其作为高尔基复合体到内质网转运途径的一部分（因此称为Get3），尽管许多早期表型仍然无法解释。当发现Get3在酵母TA-蛋白生物发生中起关键作用时，这一问题得到了很好的解决；每一种不同的表型都是由不同的TA蛋白决定的(Schuldiner等人，2008年). Get3与TA蛋白的TMD相互作用，其缺失导致ER TA蛋白在胞浆或线粒体中的定位错误(Jonikas等人，2009年,Schuldiner等人，2008年). 因此，Get3现在是TA蛋白引导进入内质网的GET途径的一部分(图6一).

酵母基因的原始和后续合成遗传阵列分析(Battle等人，2010年;Costanzo等人，2010年;Jonikas等人，2009年;Schuldiner等人，2005年,2008)将Get3与其他五个基因聚集在一起，其产物是膜蛋白Get1和Get2以及细胞溶质蛋白Get4、Get5和Sgt2。正如他们相似的遗传相互作用所预期的那样，每个缺失的表型都是相似的，并且都显示了TA蛋白错误插入和定位错误的证据(Costanzo等人，2010年,Jonikas等人，2009年,Schuldiner等人，2008年). Get3与ER-localized Get1和Get2有很强的物理和遗传相互作用(Auld等人，2006年)这表明它们形成了靶向内质网的Get3的膜受体(Schuldiner等人，2008年). 如果没有Get1和/或Get2，Get3是细胞溶质，通常与TA蛋白形成洗涤剂不溶性聚集体。体外重组显示，Get1/2以ATP依赖的方式将Get3募集到ER膜(Schuldiner等人，2008年). 因此，Get1和Get2被认为形成了一个ER-localized复合物，作为Get3介导的TA-蛋白靶向的受体(图6一). 到目前为止，还没有确定Get2的哺乳动物同源基因，而Get1的哺乳动物同源物，即富含色氨酸的碱性蛋白（WRB），直到最近才被提出可能在TA蛋白插入中发挥作用(Vilardi等人，2011年).

跨膜域识别机制

SRP结合信号序列的结构基础揭示了只有一般生物物理特性的高度多样性序列是如何被识别的(Janda等人，2010年,Keenan等人，1998年). 识别一个完全不同的TMD识别因子(Stefanovic&Hegde 2007年)提供了一个独特的机会来扩展这些原则。事实上，几乎同时，几个小组报告了各种Get3同源物的晶体结构(Bozkurt等人，2009年,Hu等人，2009年,Mateja等人，2009年,Suloway等人，2009年,Yamagata等人，2010年). 这些研究确定Get3是一种锌2+-配位同二聚体，其每个单体包含一个ATP酶结构域和一个动态a-螺旋结构域，其构象以核苷酸依赖的方式变化。在无核苷酸（或ADP-结合）的开放构象中，每个Get3单体的螺旋结构域彼此分开并折叠以掩埋大多数疏水表面(图6b条). 与之形成鲜明对比的是，含有ADP-AlF的闭合构象4−（一种ATP水解过渡态模拟物）包含并置的螺旋结构域，这些结构域经过重排，显示出富含蛋氨酸残基的深层疏水沟，很像SRP54的M结构域(Mateja等人，2009年) (图6b个，与相比图3c（c）).

Get3的疏水槽足够大，可以容纳约20个残基的α-螺旋（模拟于图6厘米,右侧面板)，与典型TMD的特征一致。相比之下，类似的SRP沟要小得多，可能是因为它还必须结合含有相当短（约7个残基）疏水区域的信号序列。突变和功能分析表明，Get3凹槽残基对底物相互作用很重要，并且在功能上与ATP酶结构域的开关区相连(Mateja等人，2009年). 氢氘交换实验进一步支持了螺旋结构域在TA-蛋白结合中的直接作用(Bozkurt等人，2009年). 因此，目前的模型是，TRC40/Get3中TA蛋白的结合和释放与其ATP结合和水解循环紧密协调(图第6页). 然而，对于基质加载和卸载事件如何在TA靶向通路其余部分的背景下进行时空协调，尚需建立一个机制框架。

预定目标事件

SRP靶向范式强调了TMD通过胞浆持续伴随的重要性。然而，Get3和TRC40都与核糖体无关，这表明可能存在上游预靶向因子来桥接核糖体和这些靶向因子。同时，我们观察到，人们对Get4和Get5了解甚少，它们与Get3形成三元复合物，并且在早期的核糖体蛋白质组学分析中发现了它们(Fleischer等人，2006年,Jonikas等人，2009年). 因此，推测Get4和Get5在确保Get3有效捕获底物方面发挥了一定作用(Jonikas等人，2009年)最近在酵母和哺乳动物系统中的两项平行研究支持了这一模型(Mariappan等人，2010年,Wang等人，2010年).

在酵母中，对基因鉴定的Get3、Get4、Get5和Sgt2的生化解剖和结构研究表明，稳定的Get4-Get5亚复合物是招募Sgt2（通过Get5）和Get3（通过Get4）的支架(Bozkurt等人，2010年,Chang等人，2010年,Chartron等人2010,Wang等人，2010年). Sgt2通过其TPR基序进一步与各种伴侣相互作用，重要的是，还直接与ER-目的TA蛋白的TMD相互作用(Wang等人，2010年). 这表明Get4-Get5亚复合物架起了两个TMD特异性伴侣中士2和Get3的桥梁，形成了TRC(图6一). 在生化分析的基础上，与Sgt2结合的TA底物可以以Get4-Get5依赖的方式有效地转移到Get3(Wang等人，2010年). 加上基因分析表明，第二军士、第四军士和第五军士在该途径中的作用比第三军士更早(Battle等人，2010年,Costanzo等人，2010年,Jonikas等人，2009年)，这些发现表明Sgt2-Get4-Get5亚复合体在将底物加载到靶向因子Get3上时具有预靶向功能。Sgt2对ER而非线粒体TA蛋白的选择性进一步表明了在这些目的地之间的排序中的作用(Wang等人，2010年).

在哺乳动物系统中，TRC40捕获TA-蛋白需要额外的因素，生化分离鉴定为由Bag6（也称为Bat3或Scythe）、TRC35和Ubl4A组成的三蛋白亚复合物(Mariappan等人，2010年). TRC35和Ubl4A分别是Get4和Get5的可识别同源物，而Bag6在下拉实验中被独立鉴定为TMD-特异性TA-蛋白相互作用物(Leznicki等人，2010年,Mariappan等人，2010年,Stefanovic&Hegde 2007年). 其他相互作用研究表明，Bag6复合体可以与TRC40相互作用(Mariappan等人，2010年)根据酵母同源性，推测通过TRC35。因此，TRC35-Ubl4A亚复合物似乎桥接了两个TMD相互作用的伴侣Bag6和TRC40，形成哺乳动物TRC，类似于酵母中的情况。这种功能的证据来自于Bag6亚复合物的耗竭导致TRC40高效捕获TA-蛋白的观察(Mariappan等人，2010年)减少插入内质网微粒体(Leznicki等人，2010年). 因此，哺乳动物Bag6-TRC35-Ubl4A亚复合物和酵母Sgt2-Get4-Get5亚复合物是类似的（部分同源的）预靶向因子，它们分别将TA-蛋白底物直接结合并转移到TRC40和Get3(图6一). Sgt2的哺乳动物同源物（称为SGTA和SGTB）是否也在预靶向步骤中发挥作用尚待确定。然而，值得注意的是，观察到SGTA与Bag6相互作用（Winnefeld等人，2006年），表明它是哺乳动物和酵母系统中TRC的一部分。

目前尚不清楚是否需要涉及看似复杂的机制的预靶向步骤，但它可能会增加分选的保真度，提供一个调节点或质量控制点，促进底物加载到TRC40上，或在TRC40和核糖体之间架起桥梁，以最大限度地减少底物暴露于胞浆。为了支持最后一个观点，Bag6复合物优先与合成疏水结构域的核糖体结合，即使这些结构域仍在核糖体隧道内，这为TA蛋白如何进入其靶向途径提供了一种合理的机制，尽管细胞中有许多其他伴侣系统(Mariappan等人，2010年). TA蛋白翻译终止的几倍延迟可能促进Bag6复合物的招募(Mariappan等人，2010年). 因此，Bag6复合物可能会释放该终止块，以协调TA-蛋白释放与Bag6核糖体募集。

此外，Bag6复合物似乎确实通过作为分诊因子为TA途径提供了额外的功能。它不仅可以招募TRC40用于生产性靶向，还可以招募泛素化机制来促进底物降解(Hessa等人，2011年). 这种多功能性似乎对细胞溶质的质量控制很重要，其中插入失败的膜蛋白必须有效降解。了解这种分类功能是如何工作的，以及它是否也用于调节不同条件下TA蛋白插入水平，还有待研究。

理解后解放道路的挑战

虽然我们对哺乳动物和酵母系统的理解都不完整，但将两者结合起来考虑，可以提供从核糖体到内质网膜的连贯路径(图6a). 尽管如此，这种TA-插入途径已经被画成了大笔一挥，对大多数步骤缺乏精细的理解。从核糖体开始，一个关键问题就是TA底物是如何首先被捕获的。虽然Bag6复合物似乎被招募到核糖体中(Mariappan等人，2010年)其结合位点以及与核糖体或底物的相互作用机制尚不清楚。更具体地说，需要确定Bag6底物相互作用结构域的性质及其相对于核糖体出口通道的位置。一个有吸引力的想法是，如果TA蛋白的N末端可溶性结构域与核糖体相关的Hsp70结合(Gautschi等人，2001年,Nelson等人，1992年). 在这个观点中，Hsp70相互作用会暂时束缚TA蛋白，使其在翻译终止时无法逃逸到胞浆中。Hsp70与Bag6（或酵母中的Sgt2）之间的相互作用(Kaye等人，2000年,Thress等人，2001年,Wang等人，2010年)这样，即使第二军士或第六军士没有准确地在出口通道处保持平衡，也可能有助于捕获TMD。

Bag6或Sgt2复合物最初捕获后，接下来的步骤是分别将底物转移到TRC40或Get3。考虑到成分之间已经详细的相互作用映射，机械理解（至少在酵母中）似乎唾手可得(Chang等人，2010年,Wang等人，2010年)，了解几个因素的结构(Bozkurt等人，2009年,Chang等人，2010年,Hu等人，2009年,Mateja等人，2009年,Suloway等人，2009年,Yamagata等人，2010年)以及用重组蛋白重建该事件的能力(Wang等人，2010年). 推测Sgt2复合物（特别是Get4）和Get3之间的核苷酸依赖性相互作用(Chartron等人，2010年)将促进后者的构象变化，从而使疏水沟槽的暴露与基底转移相协调。可能需要一定程度的配位，以避免过早释放底物或不适当地暴露Get3上的大疏水表面。

最后的靶向和插入步骤目前正在等待详细的机制分析，这首先需要用重组因子进行重组。一旦完成，就可以研究ATP酶循环与靶向、底物释放和插入的协调机制。目前，Get1和Get2似乎是唯一的插入膜因子(Schuldiner等人，2008年)，但这还没有得到严格的证明。还不清楚TMD插入脂质双层是否仅仅需要在膜附近从Get3/TRC40释放，或者是否需要蛋白质因子发挥更积极的作用。至少一些TMD能够在无人协助的情况下插入(Brambillasca等人，2005年,2006)这使得前一种模型具有吸引力，但考虑到暴露TMD的聚集潜力，依靠体内自发过程似乎风险很大。因此，Get1和Get2在靶向、刺激ATP酶活性、底物释放和插入方面的确切作用仍有待阐明。在酵母以外的生物体中，TRC40受体的身份尚待确定。然而，考虑到TRC40的高度保守性，最终证明结构相似的弱同源序列并不令人惊讶。

最后，这一途径的结构基础仍然是一个需要深入研究的领域。与生化分析一样，最具挑战性的是涉及核糖体的最早步骤和涉及膜的最后步骤。真核核糖体结构的最新进展(Armache等人，2010年,Ben-Shem等人，2010年)增加IMP表达和结晶的成功率(Granseth等人，2007年)，有理由对这两方面持乐观态度。重要的是，酵母中GET途径的非本质性(Schuldiner等人，2005年,2008)大大缓解了在体内进行体外研究得出的见解测试的技术障碍。因此，似乎有可能在没有蛋白质合成的复杂特征的情况下，相对简单的翻译后插入途径比长期研究的共翻译途径更容易产生其秘密。

结论

真核细胞已经进化出显著的协调和调节机制，一旦TMD从核糖体中出现，就会立即屏蔽TMD，直至其插入脂质双层。这种协调不仅涉及精确的空间调节（例如相对于出口隧道的SRP定位），还涉及通过影响平移延伸和终止的时间调节。毫无疑问，膜插入途径中的所有底物捕获和转移反应将被证明是高度协调的，但我们目前对它们的分子认识有限。例如，尽管底物从SRP转移到Sec61复合体在确保有效移位和插入方面起着关键作用，但人们对其了解甚少。因此，了解固有不溶性结构域（如TMD）如何在水性细胞溶质中导航是一个令人着迷的一般生物化学问题。

对这个问题的解释可能还将揭示许多不同的膜蛋白靶向途径（到线粒体、过氧化物酶体和叶绿体以及ER）如何保持不同，尽管TMD是每种情况下的主要识别元件。例如，SRP如何避免线粒体膜蛋白从核糖体中出现，或者为什么线粒体TA蛋白不参与ER途径？答案可能不仅在于识别因子的内在特性，还在于它们的时空协调。在SRP和TRC40之间缺乏串扰的情况下，可以看出如何实现这一点；前者通过核糖体定位获得优势，而后者则具有更高的细胞浓度。然而，一般来说，确保识别大致相似底物的靶向通路之间的高保真性的机制仍有待充分阐明。

由于保真度不太可能完美，因此存在处理IMP目标定位失败的机制(Hessa等人，2011年). 考虑到含有TMD的蛋白质不能自由存在于胞质溶胶中，可以预见胞质质量控制途径需要与靶向途径紧密相连。因此，非常有趣的是，在TA途径中，Bag6和Ubl4A都含有泛素样结构域，通常参与蛋白质降解途径。这些结构域中至少有一个（位于Bag6上）参与招募泛素化机制，以促进细胞溶质中膜蛋白的降解(Hessa等人，2011年). 了解蛋白质靶向性与降解的关系不仅对质量控制很重要，而且可能对IMP丰度的细胞调节也很重要。

在膜水平上，TMD从水环境向疏水环境移动的确切机制仍有待在高分辨率下确定。对于Sec61依赖性途径，这一关键步骤对于多面体IMP的了解尤其少。目前的模型不是相互排斥的，范围很广，从顺序插入到合成后插入一些TMD的模型。对于TA蛋白来说，这个问题完全没有解决，甚至连实现靶向性后是否需要插入机制这一基本问题都不确定。最后，是否还有其他IMP插入途径有待发现的问题仍有待解决。不仅一些TA蛋白无法与已知的机制相互作用，而且TA蛋白也能够插入缺乏GET途径的酵母中（尽管保真度降低）。此外，对小型IMP的理解很差，但需要以不同的方向插入，可能需要独特的机械。因此，在IMP插入ER的领域，从基于一般发现的问题到高度机械化的问题，还有很多问题有待探索。

​

总结要点

  1. 必须克服许多生物物理障碍，才能通过水性胞浆靶向疏水性整体膜蛋白，并引导它们进入内质网的脂质双层。
  2. 任何给定TMD的插入和拓扑都受到局部和远端序列决定因素的复杂组合的影响。这大大增加了多面体膜蛋白高度可靠的预测算法的复杂性。
  3. 大多数完整膜蛋白由SRP共同翻译靶向，随后通过Sec61转座子插入。
  4. Sec61转座子由一个水孔和一个侧门组成，该侧门允许TMD分裂成脂质双层。Sec61通道附近或与之相关的辅助因子可能促进一些蛋白质的插入。
  5. 通过对蛋白质其他部分组装的强烈限制，可以促进边缘疏水TMD在复杂蛋白质中的插入。这可能允许相对极性序列在最终3D结构中用作TMD。
  6. TA蛋白通过TRC40/GET途径翻译后插入，该途径由与共翻译途径完全不同的机制组成。
  7. 在靶向和插入过程中，膜蛋白从一个复合物转移到另一个复合体可能受到高度调节，以尽量减少TMD暴露于细胞液中。
  8. TA-蛋白靶向的多个步骤可能有助于提高靶向的保真度，并提供质量控制或调节点。

未来的问题

  1. 在定义明确的生物化学系统中，能够有效地重演膜蛋白插入的功能操作插入机制，这对于理解分子机制至关重要。
  2. 变速箱-有助于多面体膜蛋白插入和插入后折叠的作用因子需要确定和完善。
  3. TA蛋白的翻译后靶向和插入需要用完全重组的蛋白质重建，其结构可以指导详细的机械和生物物理分析。
  4. 膜蛋白插入的新途径可能仍有待发现，因为越来越多的小膜蛋白的插入研究很少。

致谢

这项工作得到了国立卫生研究院NICHD校内研究项目的支持。

词汇表

进口整体膜蛋白
TMD公司跨膜结构域
急诊室内质网
SRP公司信号识别粒子
SR公司SRP受体
RNC公司核糖体上升链
有轨电车易位链缔合膜蛋白
助教尾部锚固
TRC公司TMD识别复合体
GET（获取）TA蛋白的引导进入

脚注

披露声明

作者不知道任何可能影响本次审查客观性的附属关系、成员资格、资金或财务持有。

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