Allosteric modulation of peroxisomal membrane protein recognition by farnesylation of the peroxisomal import receptor PEX19

doi:10.1038/ncomms14635

.2017年3月10:8:14635。

doi:10.1038/ncomms14635。

过氧化物酶体输入受体PEX19法尼基化对过氧化物酶膜蛋白识别的变构调节

附属公司

¹结构生物学研究所，Helmholtz Zentrum München，Ingolstädter Landstr。德国纽黑堡85764，1号。
²慕尼黑综合蛋白质科学中心，生物分子核磁共振主席，慕尼黑慕尼黑理工大学化学系，利希滕贝格斯特。德国加兴85747，4。
^三CEITEC-捷克共和国布尔诺62500，卡梅尼塞5号，Masaryk大学中欧技术学院。
⁴奥地利格拉茨8010格拉茨医科大学分子生物学和生物化学研究所。
⁵德国波鸿44780波鸿鲁尔大学医学院系统生物学系生物化学和病理生物化学研究所。
⁶汉堡，诺克斯特EMBL。85，Geb。25A，22607汉堡，德国。

PMID： 28281558
预防性维修识别码： PMC5353646
内政部： 10.1038/ncomms14635

过氧化物酶体输入受体PEX19的法尼酰化对过氧化物酶体膜蛋白识别的变构调节

列奥尼达斯·埃马努利迪斯等。国家公社. 2017.

.2017年3月10:8:14635。

doi:10.1038/ncomms14635。

附属公司

¹结构生物学研究所，亥姆霍兹Zentrum München，Ingolstädter Landstr。德国纽黑堡85764，1号。
²慕尼黑综合蛋白质科学中心，生物分子核磁共振主席，慕尼黑慕尼黑理工大学化学系，利希滕贝格斯特。德国加兴85747，4。
^三CEITEC-捷克共和国布尔诺62500，卡梅尼塞5号，Masaryk大学中欧技术学院。
⁴奥地利格拉茨8010格拉茨医科大学分子生物学和生物化学研究所。
⁵德国波鸿44780波鸿鲁尔大学医学院系统生物学系生物化学和病理生物化学研究所。
⁶汉堡EMBL，诺丁汉。85，Geb。25A，22607汉堡，德国。

PMID： 28281558
预防性维修识别码： PMC5353646
内政部： 10.1038/ncomms14635

摘要

过氧化物酶体膜蛋白（PMP）的转运需要可溶性PEX19蛋白作为伴侣和输入受体。PEX19的C末端结构域（CTD）识别货物PMP是体内过氧化物酶体生物生成所必需的。PEX19中C末端CaaX基序的法尼基化增强了PMP相互作用，但其潜在的分子机制尚不清楚。在这里，我们报道了法尼基化人PEX19 CTD的NMR衍生结构，这表明法尼基部分埋藏在内部疏水腔中。这导致了大量构象变化，变构重塑PEX19表面，形成两个疏水囊，用于识别PMP中保守的芳香/脂肪族侧链。介导法尼酰基接触或直接参与PMP识别的PEX19残基的突变消除了货物结合，并且不能补充人类齐薇格患者成纤维细胞中的ΔPEX19表型。我们的结果证明了法尼基化调节蛋白质功能的变构机制。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

**图1。PEX19法尼基化的核磁共振分析。**
(一)人类PEX19的示意图概述：PEX19未折叠的N末端与过氧化物酶体膜蛋白PEX3和PEX14相互作用，C末端包含α-螺旋货物结合区和法尼基识别序列CaaX。法尼基转移酶催化法尼基部分从法尼基焦磷酸转移到CaaX盒的半胱氨酸。(b条)的覆盖¹H、，¹⁵具有（红色）和不具有（黑色）法尼基化的PEX19 CTD的N HSQC光谱。注释了受法尼基化强烈影响的酰胺共振。(**c（c）**)法尼酰化（top）引起的酰胺质子的化学位移扰动（Δδ）{¹高}-¹⁵对于具有（红色）和不具有（黑色）法尼基化的PEX19 CTD，显示了酰胺质子（底部）的N异核NOE（中间）和溶剂顺磁弛豫增强（sPRE）速率。利用误差传播计算了基于单个光谱中噪声s.d.的异核NOE数据的误差条。sPRE数据的误差条表示质子的拟合误差*R（右）*₁从不同浓度的Gd（DTPA-BMA）记录的弛豫速率。容纳CaaX盒的C端子区域的巨大变化以红色方框突出显示。PEX19 CTD的氨基酸序列和二级结构元素显示在顶部，涉及法尼基结合的脂肪族残基以黄色突出显示。接触法尼基或参与PMP识别的残基的点突变分别用绿色和紫色字母表示。

**图2。法尼基化PEX19 CTD的结构。**
(一)法尼基化PEX19 CTD的卡通表示。法尼基结合位点由螺旋α1（青色）、螺旋α2-α4（蓝色）、盖子区域（残基262-283；紫色）和CaaX盒（橙色）中的残基形成。法尼西尔被画成洋红的棍子。(b条)通过疏水性着色的法尼基PEX19 CTD的表面表征。包括螺旋α1和盖子的疏水表面区域由黑色虚线表示。(**c（c）**)法尼基识别位点的两种不同观点。虚线表示分子间NOE相关性，在PEX19法尼基化样品上使用蛋白质侧的各种标记方案收集。指出了法尼基周围PEX19 CTD褶皱中螺旋的相对位置。(d日)缺少C末端16残基的PEX19 CTD的晶体结构（CTDΔC，左）与法尼基化PEX19 CTD的溶液结构（右）的比较。盖子区域的结构变化以红色方框突出显示。(**e（电子）**)由螺旋α2-α4组成的核心螺旋束的结构非常相似，而螺旋α1（青色）的取向不同。盖子（残基262–283）覆盖法尼基化PEX19 CTD（紫色）中的法尼基，而在非法尼基PEX19 CTDΔC的晶体结构中，这些残基占据法尼基结合腔（橙色）。注意，为了清楚起见，NMR结构和连接螺旋的环区域中的残基283–299被省略。(**（f）**)PEX19法尼基化引起的盖的巨大构象变化表明，盖残基的Cα原子位置发生了变化，螺旋核结构域与**e（电子）**误差条表示核磁共振系综20个模型的标准差。最大的更改由红色框突出显示，如中所示d日.

**图3。影响法尼基识别的PEX19变体的功能和生化分析。**
(一)疏水相互作用色谱分析。使用递减（NH）的线性梯度从丁基Sepharose FF柱中洗脱蛋白质₄)₂SO公司₄浓度。对于PEX19 CTD野生型和每个变体，法尼基化蛋白与非法尼基形式相比表现出增加的洗脱体积（补充图4d）。该图显示了与野生型蛋白质（设置为1）相比，每个蛋白质的法尼基和非法尼基状态的疏水性的相对差异。(b条)PEX19变体对PEX19缺陷成纤维细胞的功能补充。通过编码全长PEX19变异体和eGFP-PTS1的双顺反子表达载体转染PEX19缺陷的成纤维细胞，将含有所示单氨基酸取代的PEX19导入PEX19缺失的纤维细胞。通过荧光显微镜监测模型过氧化物酶体蛋白转运底物eGFP-PTS1的定位（左栏）。采用免疫荧光显微镜（中柱）检测内源性PEX14作为过氧化物酶体膜蛋白。点状染色模式和eGFP-PTS1和PEX14的共同定位表明功能性过氧化物酶体蛋白转运（合并，右栏）。为了更好地进行比较，上部面板中显示了PEX19缺陷细胞仅表达来自载体的eGFP-PTS1。比例尺：10 微米。右侧所示的名称是指GFP本地化。(**c（c）**)Δ的定量分析*PEX19型*-单个PEX19变异体的表型互补。通过分析三个独立转染实验中的至少100个细胞获得数值。所示数据代表平均值±标准差(d日)法尼基化突变体的免疫印迹分析表明，所有变体均在野生型水平表达，除C296S（箭头）外，均为法尼基体内（箭头）。

**图4。PMP与非法尼基和法尼基PEX19 CTD结合的NMR分析。**
(一)的比较¹H、，¹⁵N HSQC光谱为100 μM无法尼酰化CTD（黑色），并且存在10倍过量的ALDP衍生肽（青色）。(b条)的比较¹H、，¹⁵N HSQC光谱为100 μM法尼基化PEX19不含CTD（黑色），且存在5（绿色）和10（红色）摩尔比的ALDP肽。灰色虚线表示用于消除肽储备溶液中DMF信号噪声的额外基线校正的位置。(**c（c）**)Met/Ile甲基的化学位移扰动¹H、，¹³C增加ALDP肽浓度的HSQC实验。黑色：游离PEX19 CTD 100 μM、蓝色、绿色和红色分别对应于200、500和1000 μM ALDP肽浓度。(d日)酰胺和甲基相对于PEX19氨基酸序列的化学位移扰动（CSP）的量化。(**e（电子）**)左图：根据CSP，PEX19 CTD的表面表示为红色。右图：以红色酰胺CSP为基础着色的骨架和描绘添加ALDP肽后的甲基CSP的球体的卡通表示（右）。灰色是指无法分析的残留物。

**图5。通过法尼基化PEX19 CTD识别PMP衍生肽。**
(一)过氧化物酶体膜蛋白的氨基酸序列。芳香残余物以红色突出显示；已知参与PEX19绑定的区域以粗体显示。(b条)对接模型显示PMP衍生肽芳香侧链的两个结合囊（绿色棒状和球形表示）。顶部：PEX19盖子和螺旋α1分别为深蓝色和青色。M179、Leu182、Pro272和Pro273的侧链显示为杆。底部：PEX19 CTD的表面表示，表示容纳ALDP肽中Phe71芳香侧链的疏水性空腔。(**c（c）**)体内PEX19 PMP结合位点突变的影响。用编码eGFP-PTS1和不同PEX19变体的双顺反子载体转染PEX19缺陷人成纤维细胞的免疫荧光显微镜图像。由于过氧化物酶体标记蛋白、eGFP-PTS1（基质蛋白）和PEX14（PMP）的线粒体定位错误，将缺乏PEX19的同一质粒用作阴性对照（ΔPEX19），显示弥散染色。将缺乏PEX19的同一质粒用作阴性对照（ΔPEX19），分别显示过氧化物酶体标记蛋白eGFP-PTS1（基质蛋白）和PEX14（PMP）的细胞溶质和线粒体定位错误。eGFP-SKL和PEX14的一致点状模式表明形成了具有进口活性的过氧化物酶体72 转染后h。比例尺：10 微米。(d日)含有进口过氧化物酶体的转染细胞数量的统计分析。从三个独立转染实验中的100个细胞中获得数值。所示数据代表平均值±标准差(**e（电子）**)突变体的免疫印迹分析表明，所有变体的数量与野生型蛋白相似。

**图6。法尼基化对PMP结合的变构调控示意图模型。**
在非法尼基化PEX19 CTD的情况下，螺旋α1在溶液中是柔性的，仅松散地附着在PEX19 CTD的螺旋核心结构域上，而盖子采用开放构象。法尼酰化诱导这两种结构元件的特定、刚性排列，从而形成疏水腔，然后形成PMP的高亲和力结合位点。

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1. Rucktaschel R.、Girzalsky W.和Erdmann R.过氧化物酶体的蛋白质进口机械。生物芯片。生物物理学。《学报》1808892-900（2011）。-公共医学
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[10] Jones J.M.、Morrell J.C.和Gould S.J.Pex19是一种主要的细胞溶质伴侣蛋白和1类过氧化物酶体膜蛋白的进口受体。《细胞生物学杂志》。164, 57–67 (2004).-项目管理咨询公司-公共医学

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