p38α/MK2途径诱导氧化代谢

p38α活化促进葡萄糖氧化和脂肪酸合成

接下来，我们分析了p38α活化对底物利用的影响。我们发现，表达MKK6的细胞显示出尼罗河红检测到的脂滴含量增加，当PH-797804抑制p38α时，脂滴含量受损（图2a个和补充图^第2页). 脂滴可以作为中性脂质储存的细胞内位点，不仅对脂质代谢至关重要，而且对能量稳态也至关重要，其功能障碍与多种病理学有关。脂肪酸合成所需的大部分碳来自葡萄糖输送的丙酮酸，丙酮酸在线粒体中转化为乙酰辅酶A后，以柠檬酸盐的形式排泄到胞浆中，用于进一步的脂质合成¹⁰.使用¹⁴我们证实C-葡萄糖掺入增加从头开始合成脂质（图2亿). 线粒体丙酮酸脱氢酶（PDH）复合体通过将丙酮酸转化为乙酰辅酶a，在碳流量调节中起着守门人的作用。MKK6的表达降低了PDH的E1α亚单位（PDHA1）的抑制性磷酸化，而PH-797804逆转了这种抑制性磷酸化合，这表明p38α信号正向调节PDH的活性，导致丙酮酸氧化增加（图2厘米). 与这种可能性一致，我们检测到MKK6的表达在基础（常规）条件下增加了耗氧率（OCR），这是由p38α激活介导的，基于其被PH-797804逆转（图二维和补充图^第3章). OCR的增加至少部分与ATP的生成有关，因为在寡霉素的存在下OCR减少（图二维). 此外，代谢率的提高与细胞外酸化率（ECAR）的增加相关（图第二版)主要反映了乳酸从丙酮酸转化后的分泌¹⁹然而，其他代谢过程，如CO₂TCA循环的生产也可能导致ECAR变化²⁰我们还发现表达MKK6的细胞分泌更多的乳酸（图第2页)这表明p38α的持续激活除了促进葡萄糖氧化外，还导致糖酵解增加。最近，研究表明，即使在低浓度下，四环素也能诱导线粒体蛋白毒性应激，导致线粒体动力学和功能的改变²¹为了排除四环素治疗独立于MKK6表达而诱导上述效应的可能性，我们使用没有诱导系统的亲本U2OS细胞表达MKK6。我们发现用四环素处理这些细胞既没有激活p38α途径（补充图^S4a系列)OCR也没有增加，如果有什么变化的话，基础呼吸率和最大呼吸率都略有下降（补充图^S4b系列). 这些结果支持p38α信号对线粒体功能的积极影响。

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图2

MKK6表达引发的代谢变化。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)量化脂滴含量24 h和48 在存在或不存在p38α抑制剂PH797804（PH）的情况下，在MKK6诱导后h。(b)成立¹⁴分析新合成的蛋白质和脂质中的C-葡萄糖24 在MKK6诱导后h，表示为向控制方向的折叠变化。(c（c）)使用所示抗体通过免疫印迹法分析在有或无PH的情况下，来自对照细胞和表达MKK6的细胞的总裂解物。未折叠的免疫印迹如补充图所示^第8节(d日)分析耗氧量12 在PH存在或不存在的情况下诱导MKK6表达后h。结果显示为O的pmoles₂每10人消耗⁵细胞。(e（电子）)测定细胞外酸化率12 在有或无PH的情况下诱导MKK6后h。结果显示为分泌h的pmoles⁺每10⁵细胞。(（f）)在32 h、 并表示为 μmol（摩尔） × 10⁶细胞⁻¹ × 小时⁻¹.

p38α激活诱导线粒体生物发生

线粒体呼吸增加可能是由于线粒体质量或线粒体功能的改变。用Mitotracker Deep Red染色显示MKK6诱导增加了线粒体区室，并且这种作用被p38α抑制所逆转（图3a年)，但在不表达MKK6的四环素处理的U2OS细胞中未观察到（补充图^S4c系列). 与p38α活化诱导线粒体生物发生的观点一致，我们观察到p38α诱导电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（VDAC1）上调，VDAC1是一种位于线粒体外膜的孔蛋白（图3亿). 基于线粒体转录因子A（TFAM）的积累，分离线粒体的免疫印迹分析进一步支持了MKK6表达细胞中线粒体生物生成的增强，TFAM控制线粒体DNA编码基因的转录以及生物生成过程中的DNA复制（图3立方厘米). 线粒体中TFAM的增加与MKK6表达诱导的基因组DNA拷贝数标准化的线粒体DNA拷贝数增加相一致（图三维). 这些变化与线粒体功能增加有关，这由ATP生成增加决定（图第三版)通过增强线粒体膜电位（图3英尺). 典型线粒体生物发生的两个因素是c-Myc和PGC1α^22——24我们发现p38α激活增加了两者的表达（补充图^S5a系列和^b)，但击倒c-Myc或PGC1α不会影响MKK6表达细胞中观察到的线粒体质量增加（补充图^S5c–f型)。

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图3

MKK6表达影响线粒体功能。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)使用MitoTracker Deep Red在指定时间测量对照组和MKK6表达细胞的线粒体质量，并用与对照组相比的倍数变化表示。(b)用免疫印迹法分析对照细胞和MKK6表达细胞的总裂解物。(c（c）)在p38α抑制剂PH797804（PH）存在或不存在的情况下，从对照细胞和表达MKK6的细胞中提取线粒体24小时 h.通过免疫印迹分析所示线粒体蛋白的表达。未截取的免疫印迹如补充图所示^第8节(d日)在有或无PH的24小时内，分析对照细胞和表达MKK6的细胞中线粒体DNA（mtDNA）与基因组DNA（gDNA）的比率 小时(e（电子）)在有无PH值的情况下，在MKK6诱导后的指定时间分析ATP水平，并将其归一化为细胞数量。对照细胞的数值标准化。(（f）)在12和24小时，在有无PH的情况下测量对照细胞和表达MKK6的细胞的线粒体膜电位 小时(克)24岁时对照组和MKK6表达细胞的定量 h，其含有管状（T）、碎裂（F）和甜甜圈（D）线粒体，用Tom 20染色可见。酒吧==========================================================10 微米。

正确的线粒体动力学对细胞生存至关重要，并且在受到外界刺激和代谢状态的影响时会发生快速变化²⁵奇怪的是，我们观察到MKK6表达诱导线粒体断裂，导致管状结构数量减少，出现更圆的结构（图3克)。

线粒体超氧化物的产生与p38α诱导的细胞死亡

线粒体分裂与细胞凋亡有关²⁶。我们发现MKK6的表达导致细胞存活率降低，从24小时开始检测到 h通过Annexin V和PI染色，并被p38α抑制逆转（图4a类和补充图^S6a系列). 进一步的分析表明，用胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD或Q-VD处理部分但显著地阻止了由MKK6表达引发的活细胞群的下降（补充图^S6b系列). 这些结果表明，MKK6表达可能诱导不同类型的细胞死亡，由caspase依赖和独立事件介导。另一方面，用坏死抑制剂Nec-1处理不影响MKK6表达引发的细胞死亡（补充图^S6c系列)。

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图4

线粒体活性氧增加有助于MKK6表达诱导的细胞死亡。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)使用Annexin V/PI染色在指定时间测定细胞存活率。活细胞被确定为细胞群Annexin V⁻和PI⁻(b)在32 h，表示为nmol / 5 × 10⁴细胞。(c（c）)在MKK6诱导后的指定时间，使用DCFH-DA探针分析总ROS水平。数值表示为DCF与对照细胞平均荧光的倍数变化。(d日)24小时后，对照组和MKK6表达细胞中的ROS水平 用DCFH-DA探针分析p38α抑制剂PH797804（PH）或SB203580（SB）对h的影响。数值表示为DCF平均荧光的折叠变化。(e（电子）)用SB处理或模拟处理的对照细胞和MKK6表达细胞的线粒体ROS水平在24 h使用MitoSox探头。数值表示为针对对照细胞的MitoSox平均荧光的折叠变化。

我们的结果表明，p38α诱导的代谢重编程已经在12岁时被检测到 h、 由细胞呼吸增加、线粒体生物量增加和葡萄糖消耗增加决定，这是24岁时开始检测到的细胞死亡之前的结果 p38α激活后h。MKK6表达诱导的细胞代谢加速也导致代谢副产物如乳酸的生成增加（见图第2页和铵（图第4页)以及ROS发电量的增加（图4c类). 活性氧的增加需要激活p38α，因为化学抑制p38α可以逆转这一过程（图4天)或p38α下调，但不受p38γ下调的影响（补充图^第1天). 使用线粒体特异性探针MitoSox，我们还检测到MKK6表达后线粒体ROS增加，这被p38α的抑制所逆转（图第四版). 然而，与p38α诱导的代谢变化先于细胞死亡的观点一致，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD并不影响MKK6诱导的线粒体活性氧增加（补充图^S6d系列). 重要的是，在不表达MKK6的四环素处理的U2OS细胞中，线粒体ROS和细胞存活水平均未受到影响（补充图^S4d系列和^{e（电子）})。

细胞内抗氧化系统是维持细胞内氧化还原平衡的关键。一种非常重要的细胞内抗氧化剂是谷胱甘肽，可以解毒H₂O（运行）₂通过GSH过氧化物酶产生氧化的GSH（GSSG），然后GSH还原酶使用NADPH作为电子供体将其还原为GSH。我们发现MKK6的表达并不影响GSH总量或减少的水平（图5a级)这表明，由于细胞内抗氧化系统的效率下降，活性氧没有增加。用经典抗氧化剂如NAC（N-乙酰半胱氨酸）和GSH处理表达MKK6的细胞证实了这一结果，这些抗氧化剂未能逆转ROS的增加（图5亿). 另一方面，线粒体靶向抗氧化剂MitoQ²⁷MKK6降低ROS诱导（图5厘米). 有趣的是，MitoQ大大挽救了MKK6表达引发的细胞死亡，这表明线粒体ROS参与了这一过程（图5天). 为了研究超氧化物产生是否与线粒体活性相关，我们分析了MitoQ是否影响MKK6表达细胞的OCR。细胞培养基中添加MitoQ可以减少耗氧量，这可能是由线粒体复合物I的抑制作用介导的，而不依赖于其抗氧化功能^28,29因此，我们发现与MitoQ孵育24小时 h降低了对照细胞和MKK6表达细胞的OCR（图第五版)这表明，由于呼吸链的激活增加而产生的超氧物会导致细胞死亡。

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图5

MKK6表达加速细胞代谢。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)在24小时时，对对照细胞和MKK6表达细胞中的谷胱甘肽含量（总量和减少量）进行分析 h，表示为 微摩尔/10^三细胞。(b)NAC处理的对照细胞和表达MKK6的细胞中的ROS水平（5 mM）和谷胱甘肽（5 mM）在24时进行分析 使用DCFH-DA探针诱导MKK6后h。(c（c）)用MitoQ（500 nM）在24时进行分析 h使用DCFH-DA探头。(d日)用MitoQ（500 nM）持续2天，通过Annexin V/PI染色分析细胞存活率。数据来自3个独立实验。(e（电子）)分析耗氧率24 在常规条件下诱导MKK6表达后和添加MitoQ（500 nM），如图所示。结果以O的pmoles表示₂每10人消耗⁵细胞。

表达组成活性MKK6的细胞的产生

使用NanoJuice（Merc Millipore）将构建物pcDNA4 TO（Invitrogen）和pcDNA6-MKK6DD转染U2OS细胞。MKK6DD是特异性p38 MAPK激活剂MKK6的组成活性形式，其激活环残基Ser207和Thr221突变为天冬氨酸。转染后，对细胞进行胰蛋白酶处理，以1:4、1:3和1:2的稀释度进行电镀，并在含有4 μg/ml Blasticin S HCl（Invitrogen，A11139-03）和35 μg/ml玉米醇溶蛋白（Invitrogen，R250-01）。每3天更换一次培养基，当菌落足够大时，将其采摘并重新放置在24孔板中。所选克隆被扩增并测试p38 MAPK激活。为了诱导MKK6DD的表达，在2.5 × 10⁵对于6孔板，5 × 10⁵对于60-mm板或1.2 × 10⁶对于10厘米的平板，当它们达到85%的汇合时，新鲜培养基中含有1 μg/ml四环素（西格玛87128-25 G） 或者加入相应量的乙醇（1∶100稀释液）。在1 mg/ml，储存于−20 摄氏度。

表达shRNA的慢病毒感染

在慢病毒传递系统中产生短发夹RNA（shRNA），293 T细胞（60%融合）转染shRNA-encoding DNAs（5 μg）p38γ的pLKO.1-shMAPK12（Sigma，克隆ID TRCN0000006145 μg）和∆89包装DNA（4.5 μg）使用氯化钙法。一夜之间，媒体被取代，48 h后，收集含有病毒的培养基并通过PVDF过滤器。对于细胞感染，含有病毒的培养基在含有6 mg/l聚乙烯，孵育10 min，然后放置在细胞单层上。第二天更换了媒体，24 h后，开始用嘌呤霉素（1 μg/ml）24–48小时 h.在含有嘌呤霉素（1）的培养基中培养选定的细胞群 μg/ml）。

siRNA转染

细胞在60 mm培养皿中生长至60%融合，并根据制造商的说明使用Dharmafect转染试剂盒转染5 μl，共25μl c-Myc（ID 103828，Life Technologies，AM16708）和PPARGC1A（ID 108385，Life Technologies，AM 51331）或加扰（Ambion 4390843）的μM siRNA作为对照, 最终浓度为65 纳米。细胞被镀48个 小时后，恢复了16次 h，然后继续进行实验。

膜联蛋白V/PI染色

使用FITC Annexin V试剂盒（BD Pharmingen，556547）检测细胞死亡。实验前一天，2 × 10⁵将细胞/孔接种在6孔培养皿上。经过适当的处理，培养基被收集到2 ml Eppendorf管。用PBD和200清洗细胞单层 加入微升胰蛋白酶。使用之前移除的培养基收集细胞。将所有死亡和活细胞离心5次 1000时最小值 转速。用1x结合缓冲液清洗细胞一次，然后在500分钟内重新悬浮 μl浓度为1的结合缓冲液 × 10⁶细胞/ml.100 μl溶液（1 × 10⁵细胞）转移到新的Eppendorf管中，4.5 添加μl FITC Annexin V。染色时间为20 室温下黑暗条件下的min，之后为450 μl绑定缓冲液和5 添加μl PI溶液。样品被转移到冰上并立即进行分析。

增殖试验

细胞以3.5的密度播种 × 10⁴细胞/孔进入96孔板16 治疗前h。使用MTT细胞生长试验（Merck Millipore，CT02）分析细胞增殖。细胞增殖增加表现为在第0天测量的经处理细胞相对于未经处理对照细胞的吸光度的倍数变化。

ATP测量

使用ATP测量试剂盒（Invitrogen，A22066）对ATP检测进行分析。处理后，用TBS冲洗细胞一次，胰酶消化并离心造粒。样品立即冷冻在干冰上并储存在−80 摄氏度。对于ATP检测，含有5-7的冷冻颗粒 × 10⁵使用细胞。样品制备，100 加入微升沸腾MQ水，并将试管置于95 3摄氏度 分钟，然后在冰上。为了去除细胞碎片，将样品离心5 13000时的最小值 转速。收集上清液并转移到新试管中。将细胞裂解物稀释3-5倍，并根据制造商提供的方案分析ATP水平。将值标准化为单元格编号。

细胞呼吸

细胞被镀12个 实验前4小时 × 10⁴细胞进入XF细胞微孔板的每个孔中，总体积为150 μl含10的DMEM mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺。4之后 h、 额外250英镑 加入μl培养基。实验开始时，用XF细胞Mito应激试验培养基清洗细胞一次，并添加500 μl/孔对照分析培养基和500 μl/孔含有1 μg/ml四环素用于MKK6表达。12之后 OCR的感应测量开始。在化验前一小时，将平板放置在37 °C培养箱，无CO₂同时，在无一氧化碳的培养箱中，滤筒配流盘水合₂是根据制造商的建议准备的。在研究中，我们使用了1 μM寡霉素，0.5 μM羰基氰化物间氯苯肼（CCCP），0.5 μM鱼藤酮和抗霉素。耗氧量使用Seahorse Bioscience的XFp细胞外通量分析仪测量，并归一化为蛋白质量。

谷胱甘肽含量

总谷胱甘肽（GSSG + GSH）和还原（GSH）谷胱甘肽使用GSH/GSSG-Glo™分析（Promega）进行测量。5000个细胞被镀入96孔板18 实验前h。治疗后，取出培养基，50 添加μl总/氧化谷胱甘肽裂解试剂并培养5 在摇床上搅拌分钟。下一个50 将μl荧光素生成试剂添加到所有孔中，并在RT下培养30 最小值100 加入μl荧光素检测试剂，孵育15 测定min和发光。对细胞数量进行数据归一化。

线粒体膜电位

一个6孔盘子的每个孔接收2个 ml新鲜完整培养基，含200 nM TMRE，细胞培养30 37分钟黑暗中 摄氏度。为了取出未结合的探针，用PBS清洗细胞一次，胰酶消化并在500分钟内重新悬浮 μl含抑肽酶的PBS（1 μg/ml）。立即用流式细胞仪测定线粒体膜电位。

线粒体质量

用Mitotracker深红色（Invitrogen）染色测定线粒体含量。一个6孔盘子的每个孔，包含大约2个 × 10⁵接收的单元格2 200毫升完整培养基 nM Mitotracker深红色培养30天后 37时最小值 °C，移去培养基，用PBS清洗细胞一次，胰酶消化并在500℃重新悬浮 μl含抑肽酶的PBS（1 μg/ml）。立即用流式细胞仪测定线粒体含量。

线粒体和基因组DNA提取和量化

将细胞分成三份，置于32 mm的平板中，并按所需时间处理。处理细胞后进行胰蛋白酶化，在PBS中洗涤并计数。1 × 10⁶细胞在515年被裂解 μl溶出液（75 mM氯化钠，50 mM EDTA，0.02%十二烷基硫酸钠，0.4 mg/ml蛋白酶K），50℃孵育 2°C h.添加一体积异丙醇后，在4 2°C h.样品离心30 8500时最小值 转速为4转/分 摄氏度。用70%的冷乙醇清洗颗粒，风干，50分钟后再悬浮 μM TE并储存在−20 摄氏度。要执行RT-PCR，2 μl DNA（100 ng/μl），5 μl Syber Green，5 微升MQ水和0.5 μl正向和反向引物混合。分别使用针对Actin B和COXII的引物计算基因组和线粒体DNA的比率。

ROS检测

使用两种不同的探针检测ROS生成，检测一般氧化的2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Sigma，D6883）和MitoSOX™Red（ThermoFisher scientific，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M36008”，“term_id”：“214108”，”term_text“：”M36008“}}M36008型)，针对线粒体ROS。治疗前一天，2 × 10⁵在6孔培养皿中每孔培养细胞。可视化ROS、DCFH-DA（最终浓度10 μM）或MitoSox（最终浓度5 μM）添加到培养基中进行最后30次 分钟后，取出培养基，用PBS清洗细胞一次，胰酶消化并在500分钟内重新悬浮 μl含1.4的PBS μg/ml抑肽酶。立即用流式细胞仪进行分析。

脂滴

细胞被放置在6孔板上，并处理所需的时间。A 0.5 制备尼罗河红在PBS中的µM溶液，并将其添加到细胞单层中10 RT时的min。通过胰蛋白酶法收集细胞，在500分钟内重新悬浮 μl PBS并在流式细胞仪Ex/Em上分析==========================================================552/636 纳米。

葡萄糖消耗、谷氨酰胺消耗和乳酸生成

单元格（5 × 10⁵每60mm板）被镀成两份18 在含有10的培养基中进行实验前h mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺。第二天，收集并统计时间为0的细胞。同时含10的新鲜培养基 mM葡萄糖和2 将mM谷氨酰胺添加到其他板中。在每个时间点，对细胞进行胰蛋白酶化和计数，收集培养基并储存在−20 摄氏度。通过改进己糖激酶/葡萄糖6-磷酸脱氢酶分光光度法测定D-葡萄糖⁴⁵使用商业试剂。谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶反应首先转化为谷氨酸，然后量化谷氨酸浓度来测定。在ADP和NAD存在下，谷氨酸通过谷氨酸脱氢酶转化为α-酮戊二酸来测定谷氨酸浓度^{+ 45}.用分光光度法测定培养基中的L-乳酸⁴⁵基于乳酸脱氢酶和NAD将乳酸氧化为丙酮酸⁺在联氨存在下。NAD（P）H的产生是在340时测得的 Cobas-Mira Plus分析仪中的nm。培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量以及乳酸的产生量均通过时间和所有培养期内存在的细胞数量进行校正。假设每个培养时间之间呈线性增长。所有结果均以μmol表示 × 百万个细胞⁻¹ × 小时⁻¹.

细胞内氨积累

使用氨测定试剂盒（Abcam，ab83360）检测氨。单元格（5 × 10⁵每60毫米板）以一式18份的方式进行电镀 实验前h。处理后，细胞在分析缓冲液中均质，以达到最终浓度2 × 10⁶细胞/100 μl，13000×离心 10克 4时最小值 摄氏度。10 根据制造商的建议，使用μl上清液进行分析。

mRNA表达分析

根据制造商的说明，使用Ambion的RNA迷你试剂盒从细胞中提取总RNA。为了测定RNA浓度，在260 测量纳米。cDNA来自1 μg使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）纯化的RNA，最终体积为20 μl。对于RT-PCR，4 将μl cDNA（15 ng/反应）分三次装入96 well板和6 添加μl的混合反应。将平板密封并离心1 200时最小值 × g，运行如下：50 2°C 最小值，95 10°C 最小值，在95℃下进行40次变性循环 15°C s、 56℃退火 15°C s、 72时的伸长率 60°C s、 以及95的最后三个步骤 15°C s、 60个 2°C 最小值和95 15°C s.GAPDH被用作参考，ΔΔC（t）方法被用于量化基因表达。引物序列如表所示1.

免疫印迹法

大约40 μg蛋白质在10%或12%SDS-PAGE Laemmli凝胶上分离，取决于感兴趣蛋白质的分子量。采用湿印迹系统（Bio-Rad）将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，用0.1%蓬松（在5%乙酸中）染色以评估转移效率。膜堵塞1 室温下5%非脂肪乳（PBS）中的h。初级抗体在PBS中用5%的BSA和0.1%的吐温20稀释。以1:1000的浓度使用以下抗体：p38α（细胞信号，9218）、P-p38（Thr180/Tyr182）（细胞信号传导，9211 S） ，P-MAPKAPK2（Thr222）（细胞信号，3044 S） 、P-Hsp27（Ser82）（StressGene，SPA-523）、P-PDHE1-A I型（Ser293）（Merk Millipore，ABS204）、c-Myc（Abcam，ab32072）、Tim-44（BD，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“T14720”，“term_id”：“440699”，“term_text”：“T14720”}}T14720型)，TFAM（Abcam，ab131607），VDAC-1（Abcam，ab14734），P-CREB（Ser133）（细胞信号，#9191），P-eIF4E（Ser209）（细胞信号，#9741）。MKK6兔抗血清已在前面描述过⁴⁶，p38γ抗体由Ana Cuenda（CNB，马德里）善意提供。以1:5000的比例使用Tubulin（Sigma，T9026）作为负荷控制。次级Alexa氟结合抗体在1%非脂肪乳中稀释1:5000。使用奥德赛红外成像系统（Li-Cor Biosciences）分析膜。

成立¹⁴C转化为脂质和蛋白质

细胞以2.5的密度播种 × 10⁵细胞/孔（6孔板）和18 h后改变培养基，对细胞进行不同处理以激活或抑制p38 MAPK通路。6之后 h、 培养基中添加微量[U¹⁴C] 葡萄糖或[U¹⁴C] 谷氨酰胺（0.1 μCi/ml），细胞进一步培养24小时 h.实验一式三份。用PBS清洗细胞，用200 μl 0.5%Triton X-100，储存于−80 °C持续1-5天。解冻后，180 取μl悬浮液进行油脂和蛋白质提取。第一个600 添加μl氯仿/甲醇（2:1）并旋转1 分钟后，将混合物离心500 × 5的g min.将富含脂质的氯仿相风干过夜，并在200年内重新悬浮 μl氯仿。富含蛋白质的阶段用甲醇洗涤，并在14200纺丝 × 5的g 分钟，风干过夜。第二天，蛋白质部分在200 μl盐酸胍6 M，在65岁时孵化 15°C 最小值。¹⁴C掺入量大于1 使用MicroBeta2闪烁计数器（PerkinElmer）测量每个样品的最小值，并对蛋白质浓度进行标准化。

我们感谢Mike Murphy和Sebastian Rogatti（英国剑桥MRC）为MitoQ、Travis Stracker和Suvi Aivio（巴塞罗那IRB）以及Cristina Muñoz-Piñedo（巴塞罗那IDIBELL）提供了多项建设性建议，并感谢Lídia Bardia和Advanced Digital Microscopy Core Facility为共焦显微镜提供帮助。这项工作得到了欧洲委员会（ERC 294665）、西班牙MINECO（BFU2010-17850）、AGAUR（2014 SRG-535）和BBVA基金会对A.R.N.的资助。N.T.和K.S.承认“La Caixa”博士前奖学金。M.C.承认2014年AGAUR拨款SGR-1017以及ICREA学院（ICREA基金会-加泰罗尼亚总干事）的支持。巴塞罗那IRB通过塞韦罗·奥乔亚卓越中心奖和加泰罗尼亚政府CERCA项目获得了MINECO的机构资金。