线粒体靶向化合物及其对细胞生物能量学的影响^☆

摘要

介绍

很明显，一些疾病的病理机制与线粒体氧化应激增加有关，从而导致生物能量功能障碍。这是意料之中的，因为线粒体既是活性氧和氮物种（ROS/RNS）的产生者，又是活性氧和氮素物种的靶点。在许多情况下，线粒体功能障碍是由于呼吸链复合物的氧化修饰而发生的，而后氧化修饰会放大并促进进一步的氧化损伤。确切的机制仍在积极研究中，但线粒体似乎特别容易受到脂质过氧化形成的活性脂质物种的影响[1]反应性脂质类通过诱导超氧化物和过氧化氢的形成以线粒体为靶点，最终导致生物能量功能障碍和有丝分裂[2–4]尤其是，有丝分裂对于维持线粒体质量控制和细胞存活至关重要，并且在很大程度上依赖于线粒体DNA的完整性、氧化磷酸化和自噬[5]这些途径可以被ROS/RNS修改，因此可能适合用线粒体靶向抗氧化剂进行治疗。已经开发出了几种策略，将小分子抗氧化剂靶向线粒体，以评估其在各种疾病模型中抑制氧化应激的能力[6,7]例如，Mitoquinone（MitoQ）已成功用于人类疾病，如丙型肝炎诱导的肝病和皮肤光损伤，以及许多实验动物模型，包括缺血再灌注、神经退行性疾病、糖尿病和酒精诱导的肝脂肪变性[8–14]这些发现支持线粒体靶向抗氧化剂通过防止线粒体异常氧化还原信号和氧化应激在临床上有益的概念。

有几种将分子靶向线粒体的方法，其中最通用的方法之一是将药效团偶联到亲脂阳离子，如三苯基鏻（TPP）⁺)[6]这种离域阳离子具有疏水性，可以自由通过质膜和其他细胞器的磷脂双层，而无需特定的摄取机制。这是因为细胞的负质膜电位（-30mV至-60mV）驱动TPP的运动⁺从细胞外间隙进入细胞质室最多可达10倍。火力发电厂⁺由于线粒体膜电位较高（−140至−180 mV），可在线粒体内进一步累积数百倍[15,16]已确定TPP的累积量约为10倍⁺线粒体膜电位每增加～60 mV[17]由于TPP+共轭化合物的摄取程度取决于血浆和线粒体膜电位、孵育体积、细胞体积和特定细胞内线粒体的数量，线粒体内发现的化合物的数量在不同细胞类型之间可能有很大差异[18]此外，使用TPP的治疗分子⁺部分使用不同的碳链连接物来连接官能团，了解细胞如何响应TPP物理性质的变化是很重要的⁺线粒体导向化合物。一旦进入线粒体，TPP⁺分子主要位于磷脂双层的线粒体基质表面，连接体和官能团位于内膜内[19,20].火力发电厂的锚固范围⁺线粒体内膜的分子取决于疏水性、连接单元的长度和官能团[17]TPP的膜锚固⁺线粒体内积聚的分子可以产生有益的作用，例如清除反应性自由基、防止膜脂质过氧化、控制线粒体氧化还原信号和/或改变TPP的任何药理作用⁺组。

已经表明TPP的物理特性⁺共轭化合物和连接链也可以决定线粒体内分子的积累程度。例如，三苯基甲基膦（TPMP），一种附着在TPP上的单碳甲基⁺与TPP相比，具有相对较低的疏水性和缓慢的细胞内线粒体堆积速率⁺由于较长的碳连接体而更疏水的分子[17,21]。由于物理性质的差异以及激活和再循环酶（如复合物II）活性位点的获取途径的不同，靶向抗氧化基团的功效也因其连接链长度而异。火力发电厂⁺原则上，由于其与线粒体的相互作用，部分也可能具有药理或抑制特性，线粒体可能被连接基团和具有抗氧化特性的功能药效团所修饰[19].

火力发电厂的性质⁺共轭化合物在细胞培养体系中得到了广泛的研究。例如，TPP浓度高⁺在用肌醇1,4,5-三磷酸刺激的HELA细胞中，有助于细胞内钙的调节，其中MitoQ和TPP⁺治疗显著增加线粒体基质钙浓度[22]研究还表明，暴露于这些靶向化合物后，线粒体的钙流出延迟[22]本研究表明TPP⁺自身抑制Na⁺（或H⁺)/钙²⁺从而增加心肌内钙水平。线粒体Na的抑制程度⁺（或H⁺)/钙²⁺TPP换热器更大⁺与MitoQ相比[22]线粒体靶向抗氧化剂也被用作探针，以检查线粒体活性氧对细胞信号事件的贡献。在人类乳腺癌细胞中，MitoQ通过自噬和凋亡细胞死亡机制抑制细胞增殖[23]具体而言，MitoQ导致检查点激酶磷酸化和Keap1与Nrf2的解离，导致Nrf2转录活性增加[23]在大鼠心肌成肌细胞中，MitoQ和MitoTempol均被测定为在不改变ATP水平的情况下抑制过氧化氢信号介导的肌肉分化[24]最近，已经确定，当以剂量依赖的方式以150nM或更高的浓度添加到牛主动脉内皮细胞时，MitoQ使线粒体解偶联，同时诱导糖酵解[25]在上述研究中，所有线粒体靶向抗氧化剂的浓度都高于通过药理学方法可以达到的浓度，并且与保护作用相关体内 [26].

因此，越来越清楚的是，对连接子、线粒体靶向基团和功能基团的修饰在确定线粒体靶向化合物的生物特性方面非常重要。因此，重要的是通过对TPP的影响进行系统研究来进一步评估这些特性⁺在包括药理学上发现的低nM水平的浓度范围内的缀合化合物。在这里，我们研究了细胞的生物能量反应，特别是MES-13细胞对TPP所附的选定药效团的耗氧量（OCR）和pH值（ECAR）率⁺使用Seahorse Biosciences XF-24通量分析仪。尽管TPP对细胞生物能量学的影响是一致的⁺共轭化合物-这些化合物的浓度通常至少为一个数量级或高于疾病模型中与有益作用相关的水平，不太可能参与作用机制体内他们还建议，应控制在细胞培养系统中使用线粒体靶向抗氧化剂来测试线粒体活性氧物种的作用，以防TPP的非特异性效应⁺和链接器组。

材料和方法

TPP衍生品

TPMP、BTPP和DTPP化合物包含不同长度的侧链（分别为甲基、丁基和癸基），但没有抗氧化基团(图1A–C）。MitoQ、MitoTempol和MitoE是含有功能性抗氧化基团的TPP衍生物(图1D–F）。通过向亲脂TPP共价加成喹啉合成了MitoQ⁺通过脂肪族碳链的部分[27]MitoTempol由哌啶氮氧化物TEMPOL与脂肪族碳链偶联组成，并以TPP终止⁺部分[28].MitoE是通过将维生素E（α-生育酚）与亲脂TPP结合而产生的⁺阳离子[29].

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图1

火力发电厂化学结构⁺衍生产品。（A–C）TPMP、BTPP和DTPP为控制TPP⁺用于区分抗氧化官能团与靶向部分和烷基连接链的作用的衍生物。（D–F）MitoQ、MitoTempol和MitoE为TPP⁺由功能性抗氧化基团组成的衍生物。

使用Seahorse XF-24细胞外流量分析仪测量线粒体功能

为了测试TPP衍生物对MES-13细胞中细胞生物能量学的影响，使用了Seahorse Biosciences（马萨诸塞州北比勒里卡）的SeahorseXF-24分析仪。将MES-13细胞接种在Seahorse XF-24专用细胞培养板中，每孔30000个细胞。大约24小时后，在Seahorse XF-24细胞外通量分析仪中同时评估基础耗氧率（OCR）或细胞外酸化率（ECAR）之前，在37°C下用无缓冲DMEM替换培养基1小时。30分钟后，整个TPP⁺将衍生物分别注射到MES-13细胞中（0、0.01、0.1或1μM）。TPP的影响⁺对生物能量学衍生物进行两小时的测量，然后使用线粒体功能测定评估代谢曲线[30](图2). 随着时间的推移，测量基础OCR和ECAR，然后观察线粒体抑制剂、寡霉素（1μg/mL）、FCCP（2μM）和抗霉素A（10μM）的作用。确定的细胞生物能量参数为ATP相关呼吸、质子泄漏、最大和储备容量。ATP相关呼吸是根据基线OCR和添加寡霉素后呼吸的差异得出的。抗霉素A和寡霉素的OCR差异代表了质子泄漏所消耗的氧气量。通过从FCCP诱导的OCR中减去添加抗霉素A后的OCR来确定最大OCR。最后，通过最大呼吸（FCCP）和基础呼吸之间的差值计算储备容量。所有数据均表示为TPP前基础OCR或ECAR的百分比⁺衍生注入，以便对不同的化合物进行比较。

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图2

用于评估线粒体靶向化合物对线粒体功能的急性影响的生物能量谱示意图。

结果和讨论

延长TPP烷基链的效果⁺细胞生物能量学衍生物

TPMP是TPP的甲基化形式⁺是本研究中使用的最简单的导数(图1A） ●●●●。它是含有抗氧化剂或其他官能团的更复杂衍生物的常用控制方法，以排除TPP的作用⁺观察到的生物效应的一部分。图3A显示了TPMP（0.1μM和1μM）对细胞生物能量学的影响。允许细胞建立稳定的基线，然后将胎压监测蛋白注入细胞培养基，如图所示。低浓度TPMP（0.1μM）对基础OCR无显著影响，而1μM TPMP在2 h内逐渐降低OCR。此时，如前所述，使用线粒体抑制剂进行线粒体功能测定[30]寡霉素导致对照细胞OCR显著降低，TPMP显著抑制OCR。为了确定最大呼吸容量，将FCCP注射到培养基中，并使OCR相对于添加寡霉素之前测得的点增加。有趣的是，在1μM TPMP存在的情况下，寡霉素对FCCP呼吸的刺激显著增强。最后，注射抗霉素A显著抑制所有组的呼吸，对TPMP（1μM）处理的细胞的影响更大。ECAR作为糖酵解指数，在与图4。添加TPMP后，ECAR立即增加，在添加后约1小时达到最大水平(图4A） ●●●●。在对照细胞中，添加FCCP后ECAR最大，而在TPMP（1μM）处理的细胞中没有进一步增加。

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图3

TPMP、BTPP和DTPP对耗氧率（OCR）的急性影响。将MES-13细胞以每孔30000个细胞的速度接种在海马XF-24平板中24小时。在分析之前，用低缓冲DMEM培养基替换细胞培养基，并在37°C下平衡1 h。在注射（A）TPMP（0.1μM或1μM）、（B）BTPP（1μM。评估TPP的急性影响后⁺对照组，注射寡霉素（1μg/mL）、FCCP（2μM）和AA（10μM）。数据表示为注射TPMP、BTPP或DTPP前相对于基础OCR率的百分比。所有显示的数据均为平均值±SEM，n个=3-5组。

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图4

TPMP、BTPP和DTPP对细胞外酸化率（ECAR）的急性影响。将MES-13细胞接种在Seahorse XF-24板中，每孔30000个细胞，持续24小时。在向细胞培养基中注射（A）TPMP（0.1μM或1μM）、（B）BTPP（1μM。随后，注射寡霉素（1μg/mL）、FCCP（2μM）和AA（10μM）以进一步评估糖酵解。数据表示为注射TPMP、BTPP或DTPP前相对于基础ECAR率的百分比。所有显示的数据均为平均值±SEM，n个=3-5组。

接下来，我们使用为TPMP制定的协议，使用另外两种化合物BTPP和DTPP，检查了延长烷基链对细胞生物能量学的影响(图3B、 C）。与TPMP相比，接触1μM BTPP的细胞与对照细胞相比，测得的任何生物能量参数均无变化(图3B） ●●●●。DTPP（1μM）导致基础OCR短暂下降，在20分钟内恢复到控制水平(图3C） ●●●●。然而，添加寡霉素并没有引起预期的OCR降低，进一步添加FCCP会抑制呼吸，而不是刺激反应。抗霉素A抑制OCR的程度与对照组相同，表明这些反应起源于线粒体。如所示图4B、 BTPP对细胞基础糖酵解速率无影响。然而，DTPP诱导了基础ECAR的快速增加，并且在添加寡霉素或FCCP后没有进一步刺激(图4C） ●●●●。

从这些数据可以清楚地看出，TPP⁺基团对细胞生物能量学具有功能性影响，细胞生物能量对烷基连接体基团高度敏感，而烷基连接体先前被认为基本上是惰性的。这种影响很大程度上可能是由于TPP分子与更疏水的碳链结合时，其吸收程度增加。TPMP的作用是抑制基础呼吸，但对最大呼吸的影响最小。由于FCCP将导致线粒体内膜去极化和线粒体基质中TPMP的丢失，这表明TPMP对氧化磷酸化的影响是可逆的。暴露于TPMP的细胞ECAR快速增加表明糖酵解激活以补偿线粒体ATP生成的损失。相比之下，DTPP的表现完全不同，因为寡霉素敏感性现在完全降低，这与DTPP在线粒体基质和细胞液之间的快速循环一致，从而减少了质子电化学电位梯度对呼吸的控制，从而有效地解钩线粒体。

烷基TPP中添加抗氧化官能团的效果⁺细胞生物能量学链

评估将官能团偶联到烷基TPP的影响⁺部分，我们研究了MitoQ、MitoTempol和MitoE的影响(图1D–F）。细胞对1μM MitoQ的生物能量反应如所示图5A.在细胞建立稳定的基线后，将MitoQ注射到细胞培养基中，并在2小时内使耗氧量稳定下降。令人惊讶的是，寡霉素并没有像预期的那样引起细胞呼吸的显著下降，FCCP也没有刺激呼吸。然而，抗霉素A将呼吸抑制到与对照细胞相似的水平。MitoQ对糖酵解的影响(图6A） 根据中测量的参数确定图5A.MitoQ导致ECAR最初短暂增加，在2小时内恢复到基础水平(图6A） ●●●●。注射寡霉素后糖酵解轻微增加，FCCP或抗霉素A治疗未进一步刺激(图6A） 这表明MitoQ正在破坏呼吸链将电子转移到氧气的能力。

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图5

MitoQ、MitoTempol和MitoE对耗氧率（OCR）的急性影响。将MES-13细胞接种在Seahorse XF-24板中，每孔30000个细胞，持续24小时。在分析之前，用低缓冲DMEM培养基替换细胞培养基，并在37°C下平衡1 h。进行基础OCR测量约30分钟，然后注射（A）MitoQ（1μM）、（B）MitoTempol（1μM）或（C）MitoE（1μM.）。两小时后，测定寡霉素（1μg/mL）、FCCP（2μM）和AA（10μM）处理的效果。数据表示为相对于注射MitoQ、MitoTempol或MitoE前的基础OCR率的百分比。所有显示的数据均为平均值±SEM，n个=3-5组。

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图6

MitoQ、MitoTempol和MitoE对细胞外酸化率（ECAR）的急性影响。在评估急性（A）MitoQ（1μM）、（B）MitoTempol（1μG）或（C）MitoE（1μC）治疗的效果之前，测量基础ECAR。两小时后，注射寡霉素（1μg/mL）、FCCP（2μM）和AA（10μM）。数据表示为相对于注射MitoQ、MitoTempol或MitoE前的基础OCR率的百分比。所有显示的数据均为平均值±SEM，n个=3-5组。

MitoTempol（1μM）对细胞耗氧量的影响如所示图5B.在基本OCR读数后，将MitoTempol添加到细胞中，导致线粒体呼吸的逐渐下降，随后寡霉素和FCCP治疗会加剧这种下降。用抗霉素A注射液进一步抑制线粒体呼吸以控制水平。有趣的是，MitoTempol处理的细胞对线粒体测定的呼吸反应与DTPP介导的反应类似(图3B） ●●●●。这些发现表明，MitoTempol可能以与DTPP类似的方式降低呼吸。如所示图6B、 MitoTempol导致ECAR持续增加20分钟，然后在2小时内持续下降。

最后，对MitoE进行测试，发现其在注射后导致呼吸逐渐下降，与TPMP类似(图5C、，​C、 3A）。三A） ●●●●。与抑制氧化磷酸化一致，MitoE导致糖酵解增加，而寡霉素或FCCP注射不会进一步刺激糖酵分解(图6C） ●●●●。还评估了与DTPP相比，MitoQ、MitoTempol和MitoE的效果的进一步分析，如所示图7在另一系列实验中，确定非线粒体靶向化合物辅酶Q₁₀Tempol和维生素E对线粒体呼吸没有影响(表1). 然而，线粒体靶向抗氧化剂在较高浓度（1μM）下的作用与未经处理的对照组相比有显著差异(表2).

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图7

DTPP、MitoQ、MitoTempol和MitoE对线粒体生物能量学的急性影响。将MES-13细胞接种在Seahorse XF-24板中，每孔30000个细胞，持续24小时。在分析之前，用低缓冲DMEM培养基替换细胞培养基，并在37°C下平衡1 h。进行基础OCR测量约30分钟，然后注射DTPP（1μM）、MitoQ（1μM）、Mito Tempol（1μM.）或Mito E（1μM.）。两小时后，测定寡霉素（1μg/mL）、FCCP（2μM）和AA（10μM）处理的效果。基础OCR计算为化合物注射前和暴露两小时后OCR的差异。ATP连接是寡霉素治疗前后OCR的差异。质子泄漏是注射寡霉素和抗霉素A后OCR的差异。最大值是注射FCCP后的OCR。储备容量是基本OCR和最大OCR之间的差异。数据表示为相对于复方注射前的基础OCR率的百分比。所有显示的数据均为平均值±SEM，n个=3-5组。^⁎第页与未经治疗的对照组相比，使用ANOVA和Newman–Keuls进行统计比较。

表1

非线粒体靶向抗氧化剂的生物能量谱。将MES-13细胞接种在Seahorse XF-24板中，每孔30000个细胞，持续24小时。在分析之前，用低缓冲DMEM培养基替换细胞培养基，并在37°C下平衡1 h。在注射辅酶Q后，进行大约30分钟的基本OCR测量₁₀（1μM）、Tempol（1μM）或维生素E（1μM.）。两小时后，测定寡霉素（1μg/mL）、FCCP（2μM）和AA（10μM）处理的效果。基础OCR计算为化合物注射前和暴露两小时后OCR的差异。ATP连接是寡霉素治疗前后OCR的差异。质子泄漏是注射寡霉素和抗霉素A后OCR的差异。最大值是注射FCCP后的OCR。数据表示为相对于复方注射前的基础OCR率的百分比。所有显示的数据均为平均值±SEM，n个=3–5组。*，第页与未经治疗的对照组相比，使用ANOVA和Newman–Keuls进行统计比较。

非线粒体靶向抗氧化剂的生物能量特征
基本OCR（%）
辅酶Q10	1微米	99±1.2
四甲基哌啶	1微米	89±1.7
维生素E	1微米	103±2.4
ATP关联OCR（%）
辅酶Q10	1微米	72±2.5
四甲基哌啶	1微米	65±1.6
维生素E	1微米	72±3.7
质子泄漏OCR（%）
辅酶Q10	1微米	20±0.5
四甲基哌啶	1微米	19±0.8
维生素E	1微米	19±1.6
最大OCR（%）
辅酶Q10	1微米	143±7.1
四甲基哌啶	1微米	146±9.1
维生素E	1微米	149±6.2

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表2

线粒体靶向抗氧化剂的生物能量特征。将MES-13细胞接种在Seahorse XF-24板中，每孔30000个细胞，持续24小时。在分析之前，用低缓冲DMEM培养基替换细胞培养基，并在37°C下平衡1 h。在注射MitoQ、MitoTempol或MitoE后，进行大约30分钟的基础OCR测量。两小时后，测定寡霉素（1μg/mL）、FCCP（2μM）和AA（10μM）处理的效果。基础OCR计算为化合物注射前和暴露两小时后OCR的差异。ATP连接是寡霉素治疗前后OCR的差异。质子泄漏是注射寡霉素和抗霉素A后OCR的差异。最大值是注射FCCP后的OCR。数据表示为相对于复方注射前的基础OCR率的百分比。所有显示的数据均为平均值±SEM，n个=3-5组。^⁎第页与所有组相比，<0.05，使用ANOVA和Newman–Keuls进行统计比较。

线粒体靶向抗氧化剂的生物能量谱
基本OCR（%）			质子泄漏OCR（%）
MitoQ公司	0.01微米	94±2.2	MitoQ公司	0.01微米	14±5.3
	0.1微米	97±1.3		0.1微米	25±2.1
	1微米	70±4.1⁎		1微米	47±2.4⁎
MitoTempol公司	0.01微米	101±1.5	MitoTempol公司	0.01微米	21±1.4
	0.1微米	91±2.8		0.1微米	19±0.7
	1微米	70±3.0⁎		1微米	49±2.9⁎
MitoE公司	0.01微米	100±5.4	MitoE公司	0.01微米	23±1.5
	0.1微米	103±1.6		0.1微米	22±3.1
	1微米	73±1.2⁎		1微米	36±2.2⁎
ATP链接OCR（%）			最大OCR（%）
MitoQ公司	0.01微米	66±1.7	MitoQ公司	0.01微米	136±5.8
	0.1微米	72±3.3		0.1微米	130±3.3
	1微米	13±3.2⁎		1微米	62±7.0⁎
MitoTempol公司	0.01微米	63±2.2	MitoTempol公司	0.01微米	119±6.2
	0.1微米	57±2.7		0.1微米	124±4.5
	1微米	7±1.9⁎		1微米	42±6.8⁎
MitoE公司	0.01微米	72±2.9	MitoE公司	0.01微米	170±9.0
	0.1微米	74±6.3		0.1微米	150±3.8
	1微米	26±2.6⁎		1微米	108±1.3⁎

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结论

综上所述，这些数据表明烷基TPP⁺链引发细胞的生物能量反应，这与抑制氧化磷酸化一致，并取决于烷基链的长度。先前的研究表明，连接泛喹啉部分和TPP的不同碳链长度的影响⁺研究小组表明，化合物的保留和积累取决于烷基链的长度[17,21,31]TPP的疏水性⁺化合物是控制化合物积累的重要因素。例如，TPMP（辛烷-1-醇/PBS分配系数为0.35）在达到稳定状态之前缓慢积累到细胞内的线粒体中，这与呼吸抑制的缓慢开始相一致图4 [17]然而，TPP⁺具有较长碳链连接剂（例如DTPP或MitoQ）的化合物（辛烷-1-醇/PBS分配系数为3000）在线粒体中积累更快，并更快地达到稳定状态，然后可以通过在基质和膜间空间之间循环或可能通过与线粒体内膜中的蛋白质相互作用来有效地解偶联线粒体，从而增加其对穿过线粒体内部的质子泄漏的催化作用薄膜(图6和7)[17]在牛主动脉内皮细胞分离的线粒体中，MitoQ以浓度和时间依赖性的方式诱导复合物I的超氧物、凋亡和氧化还原循环[32]根据我们的研究结果，这些影响中的大多数可能归因于TPP的非特异性影响⁺细胞生物能量学小组。

重要的是，TPP在细胞培养中实现了对氧化磷酸化的抑制⁺在新陈代谢和药物清除最小的条件下，口服给药在动物模型或人类受试者中极不可能出现共轭化合物。TPP的影响⁺化合物也可能取决于细胞类型，因为细胞的生物能量学根据线粒体的数量和调节显示出广泛的反应[30]在细胞培养系统中，线粒体靶向抗氧化剂的某些生物能量和氧化还原效应更可能是由于连接剂组的作用，并且仅在治疗剂量未达到的浓度下才明显。

作者贡献

维克多·达利-乌斯玛和迈克尔·墨菲设计了这项研究。科林·赖利（Colin Reily）、巴鲁·K·查科（Balu K.Chacko）和格洛丽亚·贝纳维德斯（Gloria Benavides）进行了海马实验和数据分析；迈克尔·墨菲（Michael P.Murphy）、塔内西亚·米切尔（Tanecia Mitchell）、科林·赖利（Colin Reilly）和维克托·达利（Victor Darley-Usmar）撰写了手稿，并收到了所有作者对手稿的反馈。

基金

这项工作得到了NIH拨款的支持：DK007545（TM）和AA13395、DK079337和DK075865（VDU）。

潜在利益冲突的披露

VDU是Seahorse Biosciences科学咨询委员会的成员。

致谢

脚注

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