白细胞生物学杂志。2013年6月；93(6): 865–873.
HMGB1的多方面：炎症、凋亡和趋化性的分子结构-功能活性
,*,1 ,† ,‡和*
欢阳
*美国纽约曼哈塞特芬斯坦医学研究所生物医学科学实验室；
丹尼尔·安托万
†英国利物浦大学分子和临床药理学系药物安全科学医学研究委员会中心；和
乌尔夫·安德森
‡瑞典斯德哥尔摩卡罗琳斯卡研究院和卡罗琳斯卡纳大学医院妇幼健康部
凯文·J·特蕾西
*美国纽约曼哈塞特芬斯坦医学研究所生物医学科学实验室；
*美国纽约曼哈塞特芬斯坦医学研究所生物医学科学实验室；
†英国利物浦大学分子和临床药理学系药物安全科学医学研究委员会中心；和
‡瑞典斯德哥尔摩卡罗琳斯卡研究院和卡罗琳斯卡纳大学医院妇幼健康部
2012年12月31日收到；2013年2月5日修订；2013年2月10日验收。
综述了确定HMGB1作为细胞因子介体作用的翻译后修饰的最新进展。
关键词：细胞因子、氧化还原、半胱氨酸、乙酰化
摘要
HMGB1是一种普遍存在于几乎所有细胞类型中的核蛋白。除了其细胞内功能外，HMGB1还可以在细胞外释放，在那里它介导固有免疫反应的激活，包括趋化性和细胞因子释放。HMGB1含有三种保守的氧化还原敏感半胱氨酸（C23、C45和C106）；这些半胱氨酸的修饰决定了细胞外HMGB1的生物活性。首先，HMGB1的细胞因子刺激活性要求C23和C45处于二硫键，同时C106必须以硫醇的还原形式存在。这种独特的分子构象使HMGB1能够通过TLR4/MD-2复合物结合并发出信号，从而诱导巨噬细胞释放细胞因子。其次，HMGB1作为趋化介质，所有三种半胱氨酸都必须是还原形式。这种全硫醇HMGB1通过与CXCL12形成杂合物来发挥其趋化活性，从而引发炎症；该复合物仅与CXCR4结合以启动趋化性。第三，HMGB1和CXCR4或TLR4的结合被全半胱氨酸氧化完全阻止。此外，HMGB1的初始翻译后氧化还原修饰是可逆的过程，使HMGB1从作为趋化因子转变为作为细胞因子，反之亦然。最后，HMGB1的NLS中关键赖氨酸残基的翻译后乙酰化影响HMGB1促进炎症；HMGB1的超乙酰化将其平衡从主要的核位置转移到细胞溶质和随后的细胞外存在。因此，HMGB1的翻译后修饰决定了其在炎症和免疫中的作用。
关键词：细胞因子，氧化还原，半胱氨酸，乙酰化
介绍HMGB1最初被描述为一种核DNA结合蛋白。在进化上高度保守，在转录调节中作为核辅因子发挥作用[1,–4]。与许多其他核辅因子一样，HMGB1后来被发现具有另一种细胞间信使分子的作用，从各种细胞释放到细胞外环境中，作用于特定的细胞表面受体。在后一种作用中，HMGB1是一种促炎细胞因子，可能导致许多炎症疾病，包括败血症[5]。HMGB1通过与免疫细胞上的细胞表面受体结合，激活调节免疫细胞功能的细胞内级联，包括趋化性和免疫调节。
HMGB1作为核转录调节分子和细胞间信使的功能在过去十年中得到了稳步发展。HMGB1分子结构功能分析的最新发现表明，特定的翻译后修饰决定了该分子的生物活性。因此，在这里，我们对HMGB1在无菌和感染性炎症中的作用机制进行了简要综述。
HMGB1型
HMGB1是HMGB家族的第一个成员[4,–10]。HMGB系列包含HMGB1、-2和-3。（HMGB4最初被确定为该家族的新成员。后来发现它与HMGB3相同，因此更名为HMGB3[8,11].) 所有HMGB蛋白的结构在该家族中高度保守（>80%的序列一致性）。HMGB1的表达在几乎所有被检测的细胞类型中普遍存在，而HMGB2的表达仅限于成年动物的淋巴组织和睾丸；HMGB3的表达仅限于胚胎和造血干细胞[4,–8]。在三种HMGB蛋白中，HMGB1是最丰富的非组蛋白核蛋白，它在一定程度上也是细胞质表达的，因为它从细胞核来回穿梭[4,12]。HMGB1包含两个折叠的螺旋DNA结合基序，称为A盒和B盒，以及一个包含一串谷氨酸和天冬氨酸的酸性尾部。HMGB1有两个NLS，分别位于A框（aa 28–44）和B框（aa179–185）中(). NLS1中存在四个保守的赖氨酸残基，NLS2中存在五个。它们容易受到乙酰化修饰，导致核排斥和随后HMGB1的释放[12,13]。在细胞核中，HMGB1通过以非特异性序列方式结合DNA来支持染色质的结构，并参与基因的转录调控[4,14,–17] (). 最近证实HMGB1在细胞内参与自噬和PKR/炎症小体激活[13,–16,18,27,–30]。它也是活化血小板和早期神经元上的一种细胞表面、膜表达蛋白，在发育和神经再生过程中参与神经突起的生长[20,21] (). 细胞外HMGB1已成为该领域的焦点，因为它参与各种免疫反应，充当原型警报信号[13,22,–26,31,–33]。因此，HMGB1具有特定于分区的功能(). 结构功能研究表明HMGB1 B盒表达细胞因子活性，而A盒仅作为HMGB1的特异性拮抗剂，但其机制尚不明确[33,–35]。HMGB1在23、45和106位含有三个半胱氨酸残基，对氧化还原依赖性修饰敏感(). 最近的研究表明，氧化还原和乙酰基修饰直接控制HMGB1的细胞因子和趋化活性().
HMGB1的结构表征。HMGB1包含两个折叠的DNA结合基序，称为A盒和B盒。它的尾巴呈酸性，含有一串谷氨酸和天冬氨酸。HMGB1是一个高度保守的跨物种，小鼠和人类之间的序列同源性超过98%。HMGB1有三个半胱氨酸，其中两个位于A框中的23和45位，另一个位于B框中的106位。此外，HMGB1包含两个NLS，一个位于A框中（aa 28–44），另一个位于B框中（aa 179–185）。K、 高乙酰化目标赖氨酸。
表1。
HMGB1的隔室特定功能
| 核 | DNA结合：转录调控[14] |
| 稳定染色质[15] |
| 染色体组装[16] |
| 细胞复制[14] |
| DNA修复[17] |
| 细胞内 | PKR/炎症小体激活[13] |
| 自噬：自噬诱导需要C106[18] |
| 诱导自噬需要二硫键半胱氨酸[18] |
| 放行途中[1,5] |
| 囊泡形成[19] |
| 细胞外的 | 膜结合：神经突起生长[20] |
| 血小板活化[21] |
| 细胞外：促血管生成[22] |
| 抗菌剂[23] |
| 全半胱氨酸减少：炎症、趋化因子样、趋化性[24,25] |
| 氧化全半胱氨酸：非易燃[24,26] |
| 半胱氨酸，二硫键合：炎症性，细胞因子样，细胞因子诱导[三,26] |
| 赖氨酸高乙酰化：炎症，细胞因子诱导[13] |
HMGB1细胞因子活性
HMGB1是炎症性疾病发病机制中的细胞因子介质
作为先天免疫反应的一部分，HMGB1可由多种细胞类型积极分泌，包括巨噬细胞、单核细胞、NK细胞、树突状细胞、内皮细胞和血小板（参考文献[32]). HMGB1也可以从坏死或受损的细胞中被动释放；这两种机制都能释放大量细胞外HMGB1[36]。虽然与坏死细胞相比，凋亡细胞释放的HMGB1少得多，但巨噬细胞吞噬凋亡细胞可能会诱导HMGB1的显著活性释放[37,38]。焦下垂，即caspase-1诱导的程序性坏死细胞死亡，最近被证明是PKR和炎症小体驱动HMGB1活性释放的重要途径[13,27]。炎症介质驱动的caspase-1激活介导细胞凋亡和IL-1β、IL-18和HMGB1的释放[27,39].
正常动物服用HMGB1会产生全身炎症反应，包括发热、体重减轻、厌食、急性肺损伤、上皮屏障功能障碍、关节炎和死亡[31,32]。基于抗体、其他HMGB1特异性拮抗剂或药物的拮抗HMGB1治疗已在多种临床前炎症疾病模型中证明是成功的，从而降低了疾病的严重程度和致死率[1,5,9].
HMGB1是无菌和感染性炎症致死性的关键介质
无菌损伤或感染引起的侮辱也会引发类似的炎症反应。在感染期间，先天免疫被称为PAMPs的外来分子产物激活，其中包括LPS、dsRNA和CpG-DNA。在无菌损伤或缺血期间，暴露于内源性DAMP（包括热休克蛋白、尿酸、膜联蛋白和IL-1α等分子）会激活相同的细胞。DAMP和PAMP诱导相同的炎症级联反应、组织损伤和多器官衰竭[40]。HMGB1由活化的免疫细胞和受损或坏死的细胞释放，在宿主对这两种威胁的反应中起着重要作用；因此，在感染和无菌损伤期间发病率和死亡率的最终共同途径中，它是一个关键的调节剂(A类) [1,5,40].
HMGB1的氧化还原依赖性调节。（A） 细胞坏死、凋亡和凋亡诱导HMGB1释放、不同半胱氨酸氧化还原状态以及与细胞因子活性的关系的示意图概述。坏死和热解诱导的HMGB1（二硫键形式）在TLR4/MD-2复合物中直接与MD-2相互作用，引发炎症反应。半胱氨酸（HMGB1第23、45和106位）对这种结合相互作用和随后的细胞因子活性很重要。半胱氨酸全还原HMGB1不具有TLR4依赖性细胞因子活性，但与CXCL12结合。HMGB1-CXCL12复合物通过CXCR4发挥作用，诱导核细胞募集和趋化。半胱氨酸全氧化或C106氧化HMGB1（由凋亡细胞释放）阻止HMGB1具有细胞因子或趋化活性。（B） 氧化还原对HMGB1诱导的细胞因子释放的依赖性作用。由硫代汞C106的形成或C23、C45或C106突变为其他残基（丝氨酸或丙氨酸）而产生的非活性HMGB1可阻止HMGB1-TLR4依赖的细胞因子活性。SH，硫醇；S、 丝氨酸；A、 丙氨酸；S-S，二硫键；汞，汞；SO公司三H、 磺酸。
HMGBs是核素介导的先天免疫反应的通用哨兵
HMGB1及其家族成员（HMGB2和-3）是细胞溶质核酸的通用传感器[41,–43]。Tian等人[41]和Ivanov等人[44]同时得出相同的结论，即HMGB1通过TLR9参与含DNA的复合介导免疫反应。后来，Yanai等人[42]证实HMGB1与所有检测的免疫原性核酸结合，并通过刺激来自免疫细胞或小鼠胚胎成纤维细胞的1型IFN、IL-6和RANTES的转录来介导免疫应答。事实上，与WT对照组相比，HMGB1缺陷细胞在病毒样DNA或RNA刺激下表现出明显减弱的免疫反应。与单一HMGB1敲除相比，敲除所有三种HMGB蛋白质抑制了对病毒核酸刺激的反应，表明HMGB蛋白质具有相同的功能[42,43]。因此，HMGB蛋白在核酸激活的先天性免疫反应中作为通用哨兵发挥着重要作用，但其机制尚不明确。
调节HMGB1活性的受体
HMGB1受体家族
HMGB1一旦释放到细胞外环境中，就会与细胞表面受体结合，引发炎症反应。介导HMGB1信号的受体包括晚期糖基化终产物受体、TLR2、-4和-9、巨噬细胞抗原-1、syndecan-3、CD24-Siglec-10、CXCR4和T细胞Ig粘蛋白-3[5,24,25,32,41,43,45,46]; TLR4是促进巨噬细胞活化、细胞因子释放和组织损伤所需的主要受体[三]。除了直接的受体相互作用外，HMGB1还可以与其他分子形成杂合物，例如IL-1、CXCL12、DNA、RNA、组蛋白或LPS，与单个组分产生的反应相比，它们产生协同反应。这些复合物通过HMGB1部分分子的相互受体作为作用方式发出信号[1,25,32]。HMGB1自身或以杂合物形式发挥作用，启动固有免疫反应，包括趋化活性和释放促炎细胞因子，并导致发热、上皮屏障功能障碍以及急性和慢性炎症。
MD-2在HMGB1-TLR4信号中的作用
TLR4活性及其与配体的相互作用取决于与细胞外适配器蛋白MD-2的分子协作[47,48]。通过使用基于生物传感器的表面等离子体共振（Biacore，GE Healthcare，Piscataway，NJ），我们观察到HMGB1与LPS一样，以高亲和力结合MD-2（表观Kd=8 nM），而它不单独结合TLR4(A）[49]。由硫代汞C106形成、半胱氨酸取代或氧化还原修饰产生的非细胞因子诱导HMGB1不允许HMGB1与MD-2、TNF生成或NF-κB核转位相互作用。结果表明，HMGB1和LPS一样，需要与TLR4/MD-2复合物的MD-2组分结合以诱导细胞因子诱导，HMGB1-半胱氨酸的氧化还原状态控制这种结合作用(B） ●●●●。通过在巨噬细胞样RAW 264.7细胞或人类单核细胞THP-1细胞中转染靶向MD-2的特异性siRNA进行MD-2敲除实验。与转染对照siRNA的细胞相比，HMGB1刺激下的TNF释放和NF-κB激活显著减少，支持MD-2是巨噬细胞/单核细胞HMGB1信号传导模式所必需的[49]。获得功能实验证实，MD-2足以恢复HMGB1诱导的人类胚胎肾293细胞过度表达TLR4的IL-8释放（我们的未发表数据）。这些结果表明，MD-2对HMGB1诱导的TLR4应答至关重要，HMGB1中的所有半胱氨酸对MD-2相互作用的发生都很重要().
HMGB1的氧化还原状态和细胞因子活性
HMGB1可能会经历广泛的翻译后修饰，包括可逆和末端半胱氨酸氧化、乙酰化、甲基化、ADP核糖基化、糖基化和磷酸化[1,4,5]。其中一些修饰已被证明会影响DNA结合和稳定性、细胞定位以及HMGB1介导的转录调控[4]。最近的研究强调，三个保守半胱氨酸残基与HMGB1的氧化还原状态调节其受体结合能力和随后的生物结果[18,24,26,28,–30,50]。如下所述，在败血症和其他HMGB1介导的炎症性疾病的发病过程中，这些翻译后氧化还原机制将控制HMGB1的促炎活性。
HMGB1细胞因子活性需要C23和C45形成二硫键，C106以还原形式（二硫键HMGB1）存在
HMGB1细胞因子活性需要还原C106（硫醇）。
HMGB1的细胞因子诱导活性依赖于C106的氧化还原状态，位于HMGB1 B盒DNA结合域内[35]。表达巯基的C106对于HMGB1与TLR4/MD-2的结合是必需的。取代C106 HMGB1可防止其与TLR4/MD-2的结合作用以及随后刺激巨噬细胞释放细胞因子[三]。此外，含有C106的合成20聚体肽介导巨噬细胞中TNF的释放，而用丝氨酸残基取代C106则消除了这种能力[三] (). C106的其他改性，通过暴露于汞中形成硫代汞基团或H末端氧化为磺酸盐2O（运行）2消除HMGB1的细胞因子刺激活性(A和B）。综上所述，这些结果确定了C106在其还原状态下是HMGB1通过TLR4进行信号传递以刺激细胞因子释放和炎症所必需的。
HMGB1细胞因子活性还需要C23和C45之间的二硫键。
直到最近，C23和C45介导细胞因子诱导能力的结构-功能关系还不清楚。LC-MS/MS分析表明HMGB1诱导细胞因子需要C23和C45之间存在二硫键，与C106以硫醇形式表达一致[26]。通过暴露于还原剂DTT或使用H进一步氧化来还原C23–C45二硫键2O（运行）2生成磺酸基团完全阻止HMGB1的细胞因子活性(). 同样，用丝氨酸或丙氨酸取代C23或C45也会显著降低其细胞因子活性(B） ●●●●。先前的一份报告强调了C23和C45容易形成二硫键的情况，二硫键增加了全长HMGB1分子的稳定性[51]。因此，这些结果清楚地表明，特定的翻译后氧化还原机制控制HMGB1的细胞因子活性，HMGB1中所有三种半胱氨酸的氧化还原状态对HMGB1发挥细胞因子的作用至关重要。
体内研究支持正确的氧化还原状态对HMGB1细胞因子活性的重要性。
氧化还原修饰HMGB1的体内功能相关性已在实验动物模型中得到证实。APAP介导的肝毒性的炎症成分是HMGB1介导的过程，已用于这些研究[36,52,–54]。HMGB1特异性拮抗剂治疗可显著改善APAP诱导的肝毒性。在小鼠模型中，APAP中毒暴露主要导致肝细胞坏死死亡，伴随核HMGB1的大量全身释放，在疾病早期，HMGB1以还原形式表达所有三种半胱氨酸，介导趋化性。最初的组织损伤之后是炎症细胞募集的激活和由积聚的固有免疫细胞介导的二次细胞因子风暴，从而加重肝脏损伤。细胞激活是由二硫键合HMGB1激活TLR4/MD-2信号引起的。HMGB1的血清水平在损伤的溶解阶段也显著升高，此时分子被最终氧化，表达带有磺酸基的C106[52,53]。因此，HMGB1体内氧化还原变化过程的功能后果与体外研究确定的结果一致。
这些研究还证明了代谢、细胞死亡模式和HMGB1生物学之间的重要功能关系。在APAP过量之前禁食24小时的小鼠在炎症和组织修复阶段不能产生凋亡性肝细胞死亡，因为能量依赖性程序性细胞死亡驱动caspase-3激活所需的基础ATP耗竭[52]。与喂食充足的动物相比，禁食的小鼠在APAP过量服用后，疾病的致命性和严重性要大得多。喂食小鼠的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3驱动的细胞凋亡产生HMGB1末端氧化，无炎症能力或炎症能力低，这一过程在禁食小鼠的坏死过程中没有发生[52].
全硫醇HMGB1是一种有效的趋化介质
HMGB1诱导其强大的趋化活性以募集中性粒细胞和单核细胞到炎症部位的氧化还原状态要求最近已被阐明，与细胞因子诱导活性的要求明显不同[24]。为了使HMGB1发挥趋化作用，必须完全还原所有三种半胱氨酸。HMGB1的这种分子形式能够与趋化因子CXCL12（基质细胞衍生因子1）形成杂合物，该杂合物将通过CXCR4受体复合物以协同方式发出信号(A） ●●●●。活性氧对任何半胱氨酸的末端氧化都会完全消除趋化活性。半胱氨酸本身不需要趋化性，因为它们可以被丝氨酸取代，在白细胞募集方面性能保持甚至增强[24]。因此，这与细胞因子诱导的要求形成了鲜明对比。HMGB1增强趋化性的重要条件是没有半胱氨酸被氧化，原因需要进一步研究。
HMGB1的氧化还原状态及其细胞因子活性是一个可逆过程
DTT暴露的HMGB1表达全硫醇半胱氨酸不会刺激培养巨噬细胞中TNF的产生。然而，低浓度H的轻度氧化2O（运行）2暴露于DTT的HMGB1通过诱导a盒结构域C23和C45之间的二硫键桥（二硫键形式）恢复了TNF诱导活性，证明HMGB1的细胞因子活性是可逆的(). HMGB1的这一特征具有临床意义，因为在APAP诱导的肝损伤研究中，组织损伤期间HMGB1氧化还原状态发生了改变。APAP给药后，最初释放的HMGB1异构体是趋化的全硫醇形式，而后来，在严重肝脏炎症发作期间，血清HMGB1的主要形式是炎症（二硫键合）形式。随着肝脏炎症的消退，循环HMGB1的主要形式包含端氧化的C106[26]。因此，在APAP诱导的肝毒性期间，血清HMGB1的炎症形式与肝脏炎症相关。
HMGB1的氧化还原修饰是可逆的。DTT暴露的HMGB1不刺激TNF。经H处理的同一HMGB12O（运行）2（温和；50μM持续2小时）可使TNF诱导活性重新恢复。采用胰蛋白酶消化、LC-MS/MS检测HMGB1的性质[26].
HMGB1在细胞死亡和损伤过程中的氧化还原状态动力学
细胞内和细胞外HMGB1在细胞死亡和损伤中的氧化还原状态是动态的。研究表明，静息细胞中的细胞内HMGB1主要是全半胱氨酸还原形式，而分泌的HMGB1同时含有全硫醇和二硫键形式[24]。此外，我们发现二硫键合HMGB1主要存在于APAP诱导的肝毒性小鼠的血清中，这与疾病的严重程度相关[26,52]。H升高细胞内ROS水平2O（运行）2或SOD1（Cu，Zn-SOD）siRNA促进包括巨噬细胞在内的多种细胞中HMGB1的释放，表明ROS在诱导HMGB1释放或活性分泌中起着关键作用[28,55,–58]。天然或合成抗氧化剂可抑制细胞死亡和炎症反应，这些反应在几种疾病模型中已被证明可抑制HMGB1的释放[29]。总之，这些研究表明HMGB1的氧化还原状态是在动态微环境中调节的[59].
乙酰化与HMGB1细胞因子活性
过度乙酰化
HMGB1两个NLS位点内关键赖氨酸残基的乙酰化是HMGB1细胞内穿梭的决定性调节机制，导致HMGB1从活化的单核细胞和巨噬细胞中主动释放[12,13]也可能来自其他类型的细胞。NLS定位赖氨酸的过度乙酰化通过阻止HMGB1在细胞核和细胞质之间的连续穿梭中的核重入，将HMGB1的平衡从其主要核位置转移到细胞质积累().
巨噬细胞在炎症小体激活（MSU、ATP、ALU）或坏死（冷冻/解冻）时释放的HMGB1的乙酰化和氧化还原状态。MSU、ATP或ALU诱导的高温导致PKR/炎性小体激活，HMGB1从细胞核转移到胞浆/细胞外释放。MS分析表明，由此释放的HMGB1在NLS1和-2区域被乙酰化，而坏死（由反复冷冻/解冻诱导）诱导的HMGBI释放没有乙酰化。HMGB1三种半胱氨酸氧化还原状态的MS表征表明，由热解和坏死诱导的HMGB1含有刺激细胞因子（二硫键）和还原型（坏死）HMGB1[13].
乙酰化HMGB1在醋氨酚诱导的患者肝毒性中的血清水平已被证明是预测临床结果的敏感和特异的生物标志物[53]。小鼠肝脏缺血/再灌注后体内释放的HMGB1已被证明是高乙酰化的，体外暴露于氧化应激的肝细胞释放高乙酰化HMGB1[39]。这些影响表明是由于组蛋白脱乙酰酶活性降低，未能从赖氨酸残基中充分去除乙酰基所致。
在确定翻译后修饰对HMGB1结构-功能关系的影响时，需要注意的是，附近赖氨酸残基的乙酰化可能会改变静电势并影响半胱氨酸巯基的pKa；然而，HMGB1三维结构中硫醇基团的8°范围内不存在赖氨酸氨基，因此不太可能影响HMGB1促炎功能的调节[51].
Pyroposis和高乙酰化
Lu等人最近发表的研究结果[13]证明高乙酰化HMGB1是一种新的热解生物标记物(). 在受到ATP、MSU或ALU等典型危险信号刺激的原代小鼠巨噬细胞中，HMGB1通过激活PKR和炎症小体系统在细胞外释放[27,39]。MS/MS分析表明，由此释放的HMGB1在NLS1和-2区域高度乙酰化。相比之下，由冻融诱导坏死的巨噬细胞培养物释放的HMGB1在NLS中没有过乙酰化(). 三种半胱氨酸HMGB1的氧化还原状态显示，焦下垂释放的HMGB1可能含有活性（二硫键合）和末端氧化形式，而坏死过程中释放的HMGB1可能含有MD-2/TLR4结合或所有硫醇形式(). 因此，多项观察表明炎症小体激活期间释放的HMGB1被乙酰化[12,13,60]。炎症小体是一种多蛋白复合物，可促进促炎细胞因子IL-1β和IL-18的分泌以及细胞凋亡[27,39]。我们的数据进一步证明HMGB1是一种识别和量化热解的新工具，这是一个迄今为止缺乏合适生物标记物的中心生理过程。最近的一项研究表明，在细胞凋亡过程中，启动对巨噬细胞释放HMGB1的量没有太大影响，而各种细胞表面TLR激动剂的启动导致巨噬细胞释放的HMGB1从趋化性（半胱氨酸-全硫醇）形式转换为TLR4-促性腺激素形式（二硫键合）[61].
HMGB1的氧化还原改性与自噬
自噬是一种溶酶体介导的自噬过程，对应激期间的细胞生存至关重要[18,28,–30]。HMGB1是自噬的关键调节因子。增强活性氧的刺激也可以增加HMGB1从细胞核到胞浆的易位，从而增强自噬通量[28]。HMGB1半胱氨酸修饰改变其诱导自噬活性[18,28,–30]。HMGB1中C106的突变，而不是相邻的C23和C45，促进HMGB1的胞质易位和自噬。半胱氨酸全还原而非氧化处理HMGB1增加癌细胞的自噬[30]。此外，HMGB1的C23和C45之间的二硫键是其与Beclin 1结合以维持自噬过程所必需的[62]。因此，由翻译后氧化还原修饰调控的HMGB1在自噬中起着重要作用，自噬可以提高细胞对细胞应激的反应中的存活率。
HMGB1翻译后修饰的检测方法及其局限性
蛋白质MS分析的引入，结合分子技术和免疫学读数，有助于阐明与半胱氨酸残基的氧化还原依赖性修饰或HMGB1赖氨酸的乙酰化修饰相关的结构-功能关系。关于氧化还原，通过HMGB1在巯基差异烷基化后的酶裂解（随后是还原的和烷基化的二硫键），可以精确测定已发表的报告中的化学物种。然后用纳米液相色谱对这些肽混合物进行分馏，并用MS/MS进行分析。这种方法不仅可以测定特定的翻译后修饰，还可以精确定位修饰的氨基酸。然而，尽管MS对多肽翻译后修饰的定义具有准确性和敏感性，但仍存在一些局限性。首先，已发表的方法是低通量的，不适合高通量筛选。其次，这些方法价格昂贵，并且依赖于熟练、训练有素的分析员和可能并非所有研究人员都能获得的专业蛋白质组实验室。不幸的是，到目前为止，还没有特异性抗体来鉴定HMGB1的不同功能亚型，基于MS/MS的分析目前仍是准确鉴定的唯一选择。在开发基于ELISA的分析之前，将在分析速度和分析物鉴定精度之间进行权衡，因为ELISA提供了一种更容易获得和更高吞吐量的选择。第三，肽的差异电离也对跨样本集和关于HMGB1的不同肽（具有定义的氧化还原或乙酰基修饰）的绝对和相对鉴定提出了挑战。这是一个未满足需求的领域，也是当前已发表的报告未涉及的领域。然而，相对和绝对定量技术的等压标记的进展以及重标记肽标准的使用将进一步允许在未来的研究中进行此类分析。既然HMGB1或乙酰基修饰中氧化还原相关变化的精确化学表征可以与生物功能相关，那么研究的重点应该放在绝对定量方法上。目前，很少有报道描述了MS对翻译后修饰HMGB1亚型的准确定量[53]。这是转化研究的基础，因此基础研究结果可能产生临床影响，例如HMGB1功能亚型代表疾病特异性生物标记物的潜力。
总结
总之，HMGB1是一种分子，在炎症和细胞凋亡过程中，有许多表面显示出不同的活性，包括氧化还原修饰，有无过乙酰化。细胞因子刺激HMGB1是一种二硫键形式（C23和C45之间的二硫键，C106仍以还原的硫醇形式存在）。这种HMGB1与TLR4/MD-2复合物中的MD-2结合，并在培养的巨噬细胞中诱导TNF释放和NF-κB活化[26]。硫醇形式的HMGB1 C106对于这种TLR4/MD-2相互作用和随后的细胞因子刺激是必需的。通过形成硫代汞C106或将C106突变为另一氨基酸残基对C106进行修饰，可防止与TLR4/MD-2复合物发生相互作用并诱导细胞因子释放。此外，HMGB1的细胞因子活性需要C23–C45二硫键。C45或C23突变也会消除HMGB1的细胞因子活性[26]。因此，HMGB1同时需要还原硫醇形式的C106和二硫键形式的C23–C45与TLR4/MD-2结合，以便随后刺激细胞因子。此外，HMGB1的全硫醇形式仅起到趋化介质的作用。所有氧化的HMGB1都没有细胞因子刺激或趋化活性。焦中毒诱导的HMGB1是一种细胞因子刺激型HMGB1，含有二硫键形式，也是一种高乙酰化HMGB1。
本综述中讨论的数据表明，翻译后修饰对HMGB1在感染和无菌损伤过程中作为介质的功能至关重要(). 这些最新进展和基于MS的分析揭示了调节HMGB1活性的新机制，并表明HMGB1可能是炎症及其消退过程中氧化还原修饰的关键治疗靶点。这些信息对于深入了解HMGB1控制免疫反应的功能至关重要。
具有不同氧化还原或乙酰化状态的HMGB1的示意图以及相应的免疫反应。组织损伤诱导HMGB1的释放，所有半胱氨酸减少，而这种形式的HMGB1不刺激细胞因子的释放；它招募白细胞到损伤部位。在感染或损伤的后期，HMGB1被乙酰化或二硫键化，并刺激细胞因子的释放。
致谢
这项工作得到了NIGMS（给K.J.T.）和NIGMS的资助(GM098446号; 到纽约），以及瑞典医学研究委员会（到美国）。D.J.A.由Wellcome信托研究奖学金和医学研究理事会（英国）资助，批准号：G0700654号.
脚注
- 算术逻辑单元
- 辅助铝
- 亚太地区
- 对乙酰氨基酚
- C23/45/106号
- 半胱氨酸23/45/106
- DAMP公司
- 损伤相关分子模式
- H（H）2O（运行）2
- 过氧化氢
- HMGB1型
- 高移动性分组盒1
- 信用证
- 液相色谱法
- MD-2型
- 髓系分化蛋白2
- 质谱/质谱
- 串联质谱法
- 密歇根州立大学
- 尿酸单钠
- NIGMS公司
- 国家普通医学科学研究所
- 荷兰统计局
- 核定位序列
- 巴基斯坦卢比
- dsRNA-依赖性蛋白激酶
- 小干扰RNA
- 小干扰RNA
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