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.2012年8月27日；209(9):1519-28.
doi:10.1084/jem.20120189。 Epub 2012年8月6日。

HMGB1相互排斥的氧化还原形式促进细胞招募或促炎性细胞因子释放

艾米莉·维内罗 1, 毛拉·卡萨尔格兰迪, 米莲娜·席拉迪, 丹尼尔·安托万, 安吉拉·卡特内奥, 弗朗西斯科·德马奇斯, 杰伦·刘, 安东内拉·安东内利, 亚历山德罗·普雷蒂, 洛伦佐·雷利, 萨拉·萨马迪·沙姆斯, 欢阳, 卢卡·瓦拉尼, 乌尔夫·安德森, 凯文·J·特蕾西, 安吉拉·巴奇, 马里亚格拉齐亚·乌古奇奥尼, 马可·比安奇
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HMGB1相互排斥的氧化还原形式促进细胞招募或促炎性细胞因子释放

埃米莉·维尼劳等。 实验医学杂志. .

摘要

组织损伤通过招募白细胞并激活它们释放促炎介质而引起炎症。我们发现高迁移率族蛋白B1（HMGB1）通过在互斥氧化还原状态之间切换来协调这两个过程。半胱氨酸的减少使HMGB1成为一种化学引诱剂，而二硫键使其成为一种促炎细胞因子，活性氧进一步将半胱氨酸氧化为磺酸盐，这两种活性都被抵消。我们发现白细胞的募集和激活是可以分开的。丝氨酸取代所有半胱氨酸（3S-HMGB1）的非氧化HMGB1突变体并不促进细胞因子的产生，但在体内招募白细胞方面比野生型HMGB1更有效。HMGB1抑制剂BoxA干扰白细胞募集，但不影响活化。我们在体外检测了损伤肌肉中HMGB1的不同氧化还原形式。HMGB1首先完全还原，然后二硫键合。因此，HMGB1通过采用相互排斥的氧化还原状态，协调无菌炎症、白细胞募集及其诱导分泌炎性细胞因子的关键事件。

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数字

图1。
图1。
HMGB1氧化还原状态的表征。（A） 用DTT（顶部）或不使用DTT（底部）纯化HMGB1的质谱表征。C23的表征：含有氨基酸13–24的肽的MS-MS示踪，碘乙酰胺加合物表明C23（顶部）减少，或二硫键DTT减少后具有NEM加合物（底部）。C45的表征：含有氨基酸45-48的肽的MS-MS示踪，碘乙酰胺加合物表明C45（顶部）减少，或二硫键DTT减少后具有NEM加合物（底部）。C106的表征：含有氨基酸97–112的肽与碘乙酰胺加合物的MS-MS痕迹表明C106还原（顶部）；二硫化物-HMGB1的MS-MS示踪是相同的，没有描述。（B） 在存在（+DTT）或不存在DTT（−DTT）的情况下制备的重组HMGB1的电泳迁移率。在存在（+）或不存在（-）350 mMβ-巯基乙醇（β-me）的情况下加热样品，将其加载到12%的SDS-PA凝胶上，并通过考马斯染色（左）或使用单克隆抗体或单克隆抗体对HMGB1进行蛋白质印迹（右）显示。（C） 通过共焦显微镜观察暴露于80 nM二硫或全硫醇HMGB1 30分钟的活体小鼠胚胎成纤维细胞中p65-GFP的核移位（用白色箭头表示）。数据是三个独立实验的代表。（D） 将人巨噬细胞暴露于0.4µM的二硫化物或全硫HMGB1中4小时。通过实时PCR测定TNF、IL-6和IL-8 mRNA的水平，并表示为与未刺激巨噬细胞相比增加了一倍（*，P<0.05，Student’st吨测试）。误差线表示标准偏差。数据是对来自无关健康个体的巨噬细胞进行的三项实验的代表性数据。
图2。
图2。
HMGB1的细胞因子刺激和化学吸引活性是相互排斥的。（A） 混合ELISA检测HMGB1/CXCL12杂合物。将所有硫醇或二硫化物-HMGB1（7.5 ng）与指示量的CXCL12在37°C下预孵育15分钟。通过混合ELISA（抗CXCL12捕获抗体和抗HMGB1检测抗体）检测杂合物的形成。结果表示为450 nm处的吸光度(*，P<0.05，方差分析）。（B） 在存在或不存在300 nM全硫醇或二硫化物-HMGB1的情况下，人类单核细胞迁移对CXCL12浓度增加的反应（*，P<0.01与仅CXCL12；双向方差分析）。（C） 小鼠3T3成纤维细胞向暴露于5 mM DTT下30分钟的二硫基-HMGB1或全硫基-HMB1或二硫基-HMB1迁移（新的全硫基HMGB1；*，P<0.05 vs.二硫基-HMGB1，ANOVA）。（D） 在二硫基-HMGB1浓度增加的情况下，3T3成纤维细胞向全硫基HMGB1迁移，在全硫基-HMGB1浓度增加的条件下，二硫基-HMGB1刺激人类巨噬细胞4h后，TNF的表达（与未刺激的巨噬细胞相比增加了一倍）。HMGB1竞争形式的影响在统计学上不显著（ANOVA）。（E和F）小鼠3T3成纤维细胞向之前暴露于升高浓度H的WT全硫醇HMGB1的迁移2O（运行）2持续1小时（E；*，P<0.05与。未经H处理的全硫醇HMGB12O（运行）2，方差分析），并朝向WT全硫醇HMGB1或在DTT存在下纯化的E106突变体（F；*，P<0.05与。未经处理的对照）。（G） 用WT二硫醚-HMGB1或在没有DTT的情况下制备的E106突变体（0.4µM）刺激人类巨噬细胞4小时。通过实时PCR测定TNF、MIP-2和IL-8的表达，并表示为与未刺激巨噬细胞相比增加了一倍（*，P<0.05 vs.二硫基-HMGB1；Student’st吨测试）。在所有面板中，数据代表至少三个独立实验，条形代表三份样品的平均值±SD（如果不可见，则属于符号范围）。
图3。
图3。
BoxA和单克隆抗体DPH1.1可阻止HMGB1诱导的细胞迁移，但不能阻止细胞因子的表达。（A和C）在有无BoxA（A）或F（ab'）的情况下，小鼠3T3成纤维细胞向WT全硫醇HMGB1的迁移2DPH1.1抗HMGB1单克隆抗体（C）的片段。（B和D）在BoxA（B）或DPH1.1 F（ab'）存在的情况下，用二硫-HMGB1（0.4µM）刺激人类巨噬细胞4小时2片段（D）。通过实时PCR检测TNF的表达，并表示为与未刺激巨噬细胞相比的倍数增加。在所有面板中，数据代表至少三个独立实验，条形代表三份样品的平均值±SD（*，与对照组相比P<0.05；方差分析）。
图4。
图4。
HMGB1半胱氨酸对于促进细胞因子/趋化因子的产生是必需的，但对于趋化性不是必需的。（A） 重组WT HMGB1和在没有DTT（0.4µM）的情况下制备的突变体的电泳迁移率，如图1 B的图例所示进行测定。通过实时PCR测定TNF表达（*，与对照组相比P<0.05，ANOVA）。（C和D）3T3成纤维细胞向1 nM HMGB1突变体迁移，暴露或不暴露1 h至5 mM DTT（C）或100 mM h2O（运行）2（D） ●●●●。条形代表三份样品的平均值±SD（*，与对照组相比，P<0.05，ANOVA）。
图5。
图5。
氧化调节HMGB1在体内的活性.（A） 注射CTX后在指定时间采集的胫骨前肌HMGB1的电泳迁移率。样品在有（+）或无（-）350 mMβ-巯基乙醇（β-me）的情况下加热，加载到12%的SDS-PAGE凝胶上，并使用HMGB1的多克隆抗体通过Western blotting显示。添加胫前肌总溶解物作为对照（L）。（B–D）3S-HMGB1在体内诱导白细胞募集。通过背部皮下注射空气在小鼠体内形成气囊。第6天，向空气袋注射200µl含有10 pmol CXCL12和/或300 pmol HMGB1（WT或3S）的PBS。（C） 或者，在空气袋中注入200µl含有或不含有1或10 nmol HMGB1（WT或3S；C）的PBS，或在不含或不含N个-乙酰半胱氨酸（NAC；100 nmol/g；D）。6 h后，从气囊中收集细胞，用抗Ly6C和抗CD11b抗体染色，并用流式细胞仪进行分析（WBC，白细胞；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，ANOVA加Dunnett后验）。
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参考文献

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