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.2003年1月至4月；9(1-2):37-45.

高迁移率组box 1促炎细胞因子活性的结构基础

李建华 1, Riikka Kokkola公司, Siamak Tabibzadeh公司, 杨润宽, 马亨达尔·奥查尼, 小玲强, 海伦娜·E·哈里斯, 克里斯托弗·J·库拉, 王海超（Haichao Wang）, 路易斯·乌略亚, 王宏（Hong Wang）, H肖·沃伦, Lyle L Moldawer公司, 米切尔·芬克, 乌尔夫·安德森, 凯文·J·特蕾西, 欢阳
附属公司

高迁移率族1促炎细胞因子活性的结构基础

李建华等。 分子医学. 2003年1月至4月.

摘要

高迁移率族蛋白盒1（HMGB）是一种普遍存在的DNA结合蛋白，被认为是一种致炎细胞因子和致死性内毒素血症的晚期介质。HMGB1由活化的巨噬细胞释放。它通过诱导细胞因子释放和介导急性肺损伤、厌食症和组织坏死的炎症反应来放大和扩大炎症反应。HMGB1释放动力学为内毒素血症提供了一个广阔的治疗窗口，因为HMGB1的细胞外水平在暴露于炎症刺激后12至24小时开始增加。在这里，我们证明HMGB1的DNA结合域，即B盒，概括了全长HMGB1细胞因子活性，并有效激活巨噬细胞释放肿瘤坏死因子（TNF）和其他促炎细胞因子。截断B盒显示，TNF刺激活性定位于20个氨基酸（HMGB1氨基酸89至108）。用B盒抗体对小鼠进行被动免疫，可显著预防盲肠穿孔引起的致死性内毒素血症或败血症。这些结果表明HMGB1的一个促炎性结构域映射到高度保守的DNA-结合B盒，使该初级序列成为治疗药物设计的合适靶点。

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数字

图1
图1
HMGB1蛋白和肽的TNF刺激活性。24孔培养板中的小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞用HMGB1或B盒以1μg/mL或合成肽以10μg/mL处理8 h；通过小鼠成纤维细胞L929细胞毒性生物测定测定上清液中TNF的释放。所示数据为平均值±SEM，n个=3到10个单独的实验；每种方法重复进行，并使用3批不同的合成肽进行验证。
图2
图2
B盒在体外刺激细胞因子释放。A： B盒刺激巨噬细胞培养物中TNF、IL-6和IL-1β的释放。用0～10μg/mL的B盒刺激24孔培养皿中的RAW 264.7细胞10 h；收集条件培养基进行细胞因子分析。B盒刺激TNF、IL-1β和IL-6（但不是IL-10）的释放呈剂量依赖性。所示数据为平均值±SEM，n个=5个独立实验。B： B盒以时间依赖的方式刺激TNF和TNF mRNA。用B盒或GST载体（10μg/mL）刺激RAW 264.7细胞的上清液0至24小时，通过L929细胞毒性试验分析TNF水平。与载体蛋白相比，B盒以时间依赖的方式诱导TNF释放。n个=3到5个独立实验。从RAW 264.7细胞中分离出总RNA，如材料和方法中所述，仅用B盒或载体刺激。采用RNase保护试验（材料和方法）测定TNF mRNA水平。数据代表了3个单独的实验。C： 抗B盒抗体特异性抑制HMGB1和B盒依赖的TNF刺激。用HMGB1（1μg/mL）或B盒（10μg/mL。TNF诱导活性表示为单独刺激所获得活性的百分比，其他蛋白的活性表示为HMGB1或B盒单独刺激所达到的百分比。仅HMGB1的TNF释放量（1μg/mL）=10592±3210 pg/mL，B盒的TNF排放量（10μg/mL）=7828±3953 pg/mL。n个=3到5个单独的实验。
图3
图3
B盒在体内有毒。A： 用B盒治疗的小鼠血清IL-6和IL-1β水平升高。Balb/C小鼠腹腔注射20 mgd日-每只小鼠的半乳糖胺-HCL（在200μL PBS中）和1 mg B盒或载体蛋白（在200µL PBS内）。7小时后采血；用ELISA法分析血清中的TNF、IL-1β和IL-6(n个=每组4至7只小鼠）*P（P）与对照组相比<0.05。B： B盒处理的Balb/C小鼠的组织病理学。小鼠（每组3只）d日-半乳糖胺（20 mg/小鼠）加上B盒或载体（1 mg/小鼠，腹腔注射）。7小时后将小鼠斩首处死。组织被采集并固定在10%的缓冲甲醛中。制备石蜡包埋组织切片，并用苏木精和伊红染色以进行组织学评估（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市标准公司）。与对照组小鼠相比，B盒治疗导致心肌缺血改变和心肌纤维横纹丢失（箭头所示）。如急性活动性肝炎所示，B盒对肝脏的损害最大。可见凋亡肝细胞被多形核白细胞包围（箭头所示）。
图4
图4
抗-B盒抗体可保护小鼠免受LPS致死。雄性Balb/C小鼠（每组10至18只）接受LD治疗75LPS剂量（15 mg/kg，腹腔注射）。在LPS给药后的第0、12和24小时给予IgY纯化的抗B盒抗体或非免疫IgY（每次60或600μg/小鼠，腹腔注射）*P（P）与Fisher精确试验测试的对照组相比，<0.05。
图5
图5
B盒介导细胞因子释放的信号转导途径。A： HMGB1和B盒对激酶活化的影响。用B-box或HMGB1（10μg/mL）刺激C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬细胞（6 cm培养皿中2×106/孔），刺激时间为指定时间。分析细胞裂解液中的激酶（材料和方法）。所示数据代表了3个单独的实验。B： B盒对NF-κB活化的影响。将RAW 264.7细胞置于6 cm培养皿中，用对照培养基或含有1μg/mL B盒的培养基培养不同时间。孵育后，制备核蛋白并进行电泳迁移率变化分析。B盒孵育增加了NF-κB DNA结合。所示结果来自重复3次的典型实验。B盒刺激的RAW 264.7细胞的核提取物通过超移分析使用32P标记的NF-κB。在使用放射性标记探针和EMSA进行（抗体）或同时（寡核苷酸）检测前1 h，添加针对NF-κB亚单位p65或p50（2μg/mL）的IgG，未标记HIF-1（低氧诱导因子1）的100倍摩尔过量量，或NFκB。结果代表了3个单独的实验。
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