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.2003年10月15日；22（20）：5551-60。
doi:10.1093/emboj/cdg516。

单核细胞超乙酰化染色质蛋白HMGB1引导其分泌

蒂齐亚娜·博纳尔迪 1, 法比奥·塔拉莫, 保拉·斯卡菲迪, 丹尼斯·费雷拉, 安娜丽莎·波尔图, 安吉拉·巴奇, 安娜·鲁巴特利, 亚历山德拉·阿格雷斯蒂, 马可·比安奇
附属公司

单核细胞超乙酰化染色质蛋白HMGB1引导其分泌

蒂齐亚娜·博纳尔迪等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

高迁移率组1蛋白（HMGB1）是一种染色质成分，当坏死细胞泄漏时，会引发炎症。HMGB1也可由活化的单核细胞和巨噬细胞分泌，并作为炎症的晚期介质发挥作用。核蛋白的分泌需要严格控制的迁移计划。我们在这里显示，在所有细胞中，HMGB1活跃地穿梭于细胞核和细胞质之间。脂多糖激活后，单核细胞和巨噬细胞广泛乙酰化HMGB1；此外，休眠巨噬细胞中HMGB1的强制过乙酰化导致其重新定位到胞浆中。然后，默认情况下，细胞质HMGB1被浓缩到分泌溶酶体中，并在单核细胞接收到适当的第二信号时分泌。

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数字

无
图1。HMGB1在胸腺和活化的单核细胞中被多重乙酰化。(A类)从小牛胸腺纯化的HMGB1在一维凝胶（SDS–PAGE，考马斯染色，右图）上出现两条带（箭头）。次要带含有ADP-核糖基HMGB1。对50微克HMGB1的同一样品进行2D凝胶电泳（银染，左图）；来自Bio-Read的2D蛋白质标记与HMGB1一起加载，生成右侧所列分子量的斑点矩阵。(B类)小鼠胸腺中含有许多HMGB1亚型。将来自胸腺总提取物（来自17天龄小鼠胚胎）的约300µg蛋白质加载到双2D凝胶上；顶部显示的凝胶是银染的，而底部的凝胶是印迹的，并用抗HMGB1抗体进行分析。(C类)LPS激活人单核细胞高乙酰化HMGB1并将其积聚在细胞质小泡中。从外周血中纯化的单核细胞在有或没有LPS的情况下培养过夜。然后固定活化和对照单核细胞的等分样品，并用抗HMGB1抗体（红色）进行免疫染色。HMGB1在非刺激性单核细胞中是核的，而在LPS激活的单核细胞则是核+泡状的。Bar表示7µm。将未经处理的和LPS激活的单核细胞等分试样冻融，并将约400µg总蛋白提取物加载到2D凝胶上，进行印迹，并用抗HMGB1进行免疫检测。请注意活化单核细胞中主要的额外HMGB1斑点。
无
图2。多重修饰HMGB1的2D/MALDI-MS分析策略。(A类)从2D凝胶中切下斑点，用MALDI-TOF进行蛋白质水解和分析。混合物中的每个肽都有一个质量；与预测的肽相对应的质量生物信息学被选为‘锚’，我们在复谱中搜索对应于锚质量加上42倍（乙酰基的分子量）的其他峰。对两种肽进行了分析；对所有肽重复该程序。我们还挖掘了光谱，寻找磷酸化、甲基化和糖基化的证据，但没有发现任何证据。(B类)为在HMGB1中指定乙酰化位点而开发的多步骤消化策略的示例。2D凝胶中的斑点在含有蛋白酶Asp-N的凝胶中消化。一份等分样品用MALDI-TOF分析：箭头标识对应于未修饰片段的峰。然后我们寻找未修饰片段的分子量加上42倍的峰值。因此，确定了每个片段上乙酰基部分的最大数目。用CNBr进一步消化另一等分的Asp-N消化HMGB1，并对产物进行类似分析。我们继续进行进一步的裂解，直到我们能够获得所有赖氨酸都乙酰化或没有乙酰化的可识别片段。
无
图3。HMGB1具有两个具有NLS活性的片段和两个NES。(A类)HMGB1序列乙酰化位点的最终归属。标记为红色的赖氨酸（43种中有8种）经常被修改；蓝色赖氨酸从未被修饰（20/43）；以低频率修饰绿色（9/43）中的赖氨酸；紫色（6/43）中的赖氨酸没有特征，因为在光谱中没有发现含有赖氨酸的肽。HMG框以蓝色突出显示，酸性尾部以红色突出显示(B类)具有NLS活性的肽的鉴定。HMGB1的氨基酸27–43与二分NLS完全匹配。这种假定的二分NLS与GFP融合并在小鼠成纤维细胞中表达：虽然NLS1–GFP融合主要是核融合，但GFP本身是广泛扩散的。HMGB1–GFP的赖氨酸（K）27、28和29突变为丙氨酸（KKK→AAA-1）不会改变核定位。HMGB1的序列片段随后被导入PredictNLS数据库：178–184个片段与19个蛋白质匹配，其中17个为核蛋白。这构成了潜在NLS的一个很好的指示，我们将其命名为NLS2。其与GFP的融合（NLS2–GFP）显示出主要的核分布。HMGB1–GFP的赖氨酸181、182和183突变为丙氨酸（KKK→AAA-2）不会改变荧光蛋白的核定位。将两个簇中的所有六种赖氨酸突变为丙氨酸（2×KKK→AAA）或谷氨酰胺作为乙酰赖氨酸（2×KKK）的模拟物→QQQ）引起部分细胞溶质定位。六种赖氨酸突变为精氨酸（2×KKK→RRR）没有改变核定位。Bar表示10µm。(C类)HMGB1从细胞核迅速扩散到细胞质。通过融合表达HMGB1的HeLa细胞（人类）和嗯1–/–小鼠胚胎成纤维细胞。人细胞角蛋白和HMGB1分别呈红色和绿色；细胞核被Hoechst 33342染成蓝色。人细胞角蛋白染色的细胞和两个细胞核被认为是异核体，其中一个细胞核具有小鼠细胞特有的明亮的Hoechst阳性异色斑点。最初，只有异核体中的人类细胞核含有HMGB1(t吨= 0). 37°C孵育4小时后(t吨=4 h），HMGB1从人细胞核到小鼠细胞核重新平衡。(D类)HMGB1通过被动和主动运输离开核。瘦霉素B显著减少但不消除HMGB1在人和小鼠异核体细胞核之间的转移。对于每个处理（钩端霉素和对照），评估了150个异核体；50%的水平相当于完全平衡。(E类)两个HMG盒都与CRM1 exportin直接交互。将标记的CRM1蛋白与固定在谷胱甘肽-Sepharose或BSA上的带有GST–NS2的珠粒、无尾HMGB1（BoxA+B）或与Sepharose共价连接的单个盒混合。对代表输入材料（In）、第四次洗涤（W4）、五次洗涤后仍与珠子结合的材料（结合，B）和未结合材料（输出，O）的等分试样进行电泳和自动射线照相。CRM1与除阴性对照BSA外的所有珠子结合。在结合缓冲液中加入0.4µM钩体霉素B可防止CRM1同时与GST–NS2和HMG盒中的NES结合（通道18–23）。
无
图4。TSA处理后HMGB1移向细胞质。(A类)小鼠成纤维细胞暴露于10 ng/ml TSA中1 h，导致HMGB1–GFP显著迁移至细胞质；没有可识别的小泡。6种赖氨酸突变为精氨酸（2×KKK→RRR）可阻止HMGB1-GFP的细胞质积累，即使在TSA处理后也是如此。(B类)U937.12细胞在添加或不添加LPS或钩端霉素B的情况下培养3h。然后固定细胞并用HMGB1抗体（红色）进行免疫染色。HMGB1在静止的U937.12细胞中是唯一的核，而在LPS激活的细胞中主要是囊泡。莱博霉素阻断细胞核输出，从而导致囊泡积聚。休眠U937.12细胞的细胞质和小泡中含有大量HMGB1，这些细胞在4°C下孵育3小时，以促进低乙酰化HMGB1向细胞质的被动扩散，并在37°C下重新加热5分钟，以恢复主动运输（“冷却和复温”）。同样，当U937.12细胞进入M期时，HMGB1的重要部分包含在细胞质和囊泡中，而在核膜破裂（“中期”）后，HMGB2游离低乙酰化进入细胞质。(C类)小鼠腹腔巨噬细胞的细胞核中含有HMGB1，但经LPS刺激后，HMGB1的一部分转移到细胞质小泡。在没有LPS的情况下，用TSA孵育也会导致HMGB1转移到囊泡。
无
图5。HMGB1由组蛋白乙酰转移酶乙酰化。(A类)将所示纯化蛋白与谷胱甘肽–Sepharose结合的GST–PCAF（+）或对照谷胱甘蛋白–Sepharo（-）孵育，以及[14C] 乙酰辅酶A。培养后，将上清液中的反应产物从珠子中分离出来并进行电泳。凝胶经考马斯染色（左）、干燥并放射自显影（右）。(B类)从小鼠3T3成纤维细胞免疫沉淀天然PCAF，并与重组组蛋白H3和H4、重组全长HMGB1及其无尾衍生物HMGB1ΔC孵育。[14C] 将乙酰辅酶A添加到通道2、4和6的反应混合物中。(C类)U937细胞与LPS孵育指定时间，细胞提取物用抗乙酰H3抗体进行免疫印迹分析。为了进行比较，还显示了与TSA孵育后H3乙酰化的程度。直方图显示了三个独立实验的平均误差和标准误差（LPS治疗后的差异显著，P（P）< 0.05).
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图6。专业炎症细胞HMGB1分泌的控制。在所有细胞中，包括静止的炎性细胞，HMGB1在细胞核和细胞质之间穿梭；核输入是活跃的，蛋白质通过被动扩散和CRM1介导的主动输出迁移回细胞质。当HMGB1乙酰化不足时，核输入速率超过再扩散加输出速率，蛋白质主要或仅为核。当炎症细胞通过IL-1β、TNF-α、LPS或HMGB1自身与自身受体的结合而被激活时，NF-κB和MAP激酶（MAPK）途径被激活。磷酸化MAPK迁移到细胞核，直接或通过衔接蛋白激活组蛋白乙酰化酶或抑制去乙酰化酶。这反过来促进HMGB1的乙酰化。输出的乙酰基-HMGB1不能返回核。髓样细胞配有分泌性溶酶体，这是一种在适当刺激下可以分泌的溶酶体类型，可能通过溶酶体膜中嵌入的特定转运体积累IL-1β或HMGB1。当LPC（一种炎性脂质）与其自身受体结合后，携带HMGB1的分泌性溶酶体与质膜融合并分泌其货物。
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