公共科学图书馆-遗传学。2012年10月;8(10):e1002966。
中的突变序号4基因导致Bronx Waltzer小鼠选择性剪接缺陷和耳聋
,1,2 ,三 ,1 ,1 ,4 ,1 ,4 ,1 ,三和1,2,4,5,*
中野洋子
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院解剖与细胞生物学系
2美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院炎症项目
伊斯拉特·贾汗
三美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学文理学院生物系
格雷戈里·邦德
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孙兴申
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迈克尔·希尔德布兰德
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约翰·恩格哈特
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理查德·史密斯
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罗伯特·A·康奈尔
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院解剖与细胞生物学系
伯恩德·弗里茨奇
三美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学文理学院生物系
博通·班菲
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5美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院内科
Gregory S.Barsh,编辑器
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美国斯坦福大学医学院
提交人声明不存在相互竞争的利益。
构思并设计实验:YN RAC BF BB。执行实验:YN-IJ GB XS MSH。分析数据:YN IJ GB MSH BF JFE RJHS RAC BB。撰写论文:YN BB。
2012年2月18日收到;2012年8月8日验收。
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- 补充资料
图S1:
现场野生型小鼠感觉内耳区与阴性对照探针的杂交。(A–C)野生型小鼠的耳蜗(A)、椭圆黄斑(B)、壶腹嵴(B)和囊状黄斑(C)缺乏信号(P0)就地用感测Srrm4探针杂交。OC:Corti器官;U: 胞果;AC:前嵴;LC:侧嵴。比例尺:100µm。(PDF格式)
GUID:EB0EF6C6-FD7D-48C5-994E-A7715F6E4358
图S2:
现场野生型感觉内耳区杂交,bv/bv、和Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv带有与编码区相对应的反义探针的小鼠序号4第13外显子。(A–C)野生型小鼠(P0)对序号4外显子13在耳蜗(A)、椭圆囊黄斑(B)、壶腹嵴(B)和囊状黄斑(C)中的表达。(D–F)bv/bv鼠标(P0)为阴性Srrm4型外显子13在耳蜗(D)、椭圆黄斑(E)、壶腹嵴(E)和囊状黄斑(F)中的表达。(G-I)Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv小鼠(P0)阳性序号4外显子13在耳蜗IHC(G)、椭圆黄斑(H)、壶腹嵴(H)和囊状黄斑(I)中表达,但在OHC(G)中表达为阴性;缺乏转基因Myo7a公司在一些人中观察到OHC的启动子活性Myo7a-GFP转基因小鼠系[32].OC:Corti器官;U: 胞果;AC:前嵴;LC:侧嵴;IHC:内毛细胞。比例尺:100µm。(PDF格式)
GUID:81EE9859-CD37-42D8-BA94-BCA6D802BDD3
图S3:创始人基于鼠标的ABR数据分解和平衡测试结果.(A)ABR阈值bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bvP21–28上的小鼠。(B) 坠落前在固定水平杆上花费的时间bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bvP70-80小鼠。从转基因创始小鼠的后代获得的数据用相同类型的符号表示。每个符号表示单个鼠标的值。用于ABR和平衡测试的小鼠来自于成对的bv公司/+:Tg和bv/bv老鼠。(PDF格式)
GUID:D6BB435B-0F25-45CA-A23E-1C0D32D57D71
图S4:的影响Myo7a-Srrm4型转基因对小鼠感觉毛细胞丢失的影响bv/bv老鼠。(A–B)纤毛(A)囊毛细胞(HCs)和(B)耳蜗IHCs的计数bv型/+,bv/bv、和Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv(bv/bv:Tg)小鼠(P5)。每个符号表示单个小鼠的心室HC或IHC计数(单向方差分析,P(P)<0.0001,事后Tukey测试:*P(P)<0.01, **P(P)<0.001). (C) Corti器官制剂bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bv(bv/bv:Tg)小鼠(P28)用柱状肽-Alexa Fluor 488染色,以可视化富含肌动蛋白的结构,包括静纤毛。箭头表示IHC行。比例尺:20µm。(PDF格式)
GUID:041FB94D-D1E5-424D-906D-AE0E564AF456
图S5:前庭黄斑区神经元特异性外显子剪接的差异bv/bv公司和bv公司/+老鼠。激光捕获前庭黄斑区RNA样品选择性剪接的(A–B)RT-PCR分析bv/bv和bv公司/+小鼠(E16.5)。(A) 显示了两种基因型之间的差异导致的扩增外显子P(P)<0.05,每个外显子至少有两个MJAY探针组。RT-PCR引物被设计成退火到构成外显子(白盒),位于被测盒外显子的两侧(红盒)。在非盒外显子的情况下,箭头指示用于测试剪接的引物的位置。(B) RT-PCR扩增了两种基因型差异导致的神经元特异性外显子P(P)<0.05,每个外显子设置一个MJAY探针。Cacna1b转录本两个互斥外显子上方的数字表示外显子的长度,单位为bp。(C) RT-PCR检测前庭黄斑区13个随机选择的Srrm4依赖性剪接事件的组织特异性。小脑(ce)和脾脏(sp)RNA样本作为神经和非神经RNA样本进行分析。(D–E)RT-PCR检测所示基因型小鼠前庭黄斑(vm)、小脑(ce)和脾脏(sp)中(D)nPTB外显子10和(E)Rest外显子4的剪接。其余外显子4,而非nPTB外显子10,在bv/bv和bv型/+小鼠(E16.5)。(PDF格式)
GUID:19AC18D6-ED03-4786-9AAD-A8A24FA303BE
图S6:前庭黄斑区基因表达的折叠差异bv型/+和bv/bvE16.5小鼠。(A) 微阵列数据显示,在前庭黄斑区表达增加或减少至少1.5倍的基因bv/bv老鼠与。控制(ctrl;即bv/+)室友。错误发现率(FDR)的截止值为0.15。绿色阴影表示已知受Rest调节的基因。(B)验证bv/bv和控制(ctrl;即bv/+)通过实时定量RT-PCR检测前庭黄斑。从图A所示的列表中选择6个测试基因。18S rRNA用于标准化目的。(PDF格式)
GUID:537C1357-F951-4382-944D-04537A118F5C
图S7:小脑组织学和选择性剪接的评估bv/bv和bv型/+老鼠。(A) 上图:RT-PCR结果显示小脑(ce)中Srrm4mRNA的数量高于激光捕获的前庭黄斑(vm)。下部面板:RT-PCR结果表明参考转录物的水平(即肌动蛋白mRNA)在两个样本中具有可比性。(B) Nissl染色的小脑矢状旁切片bv型/+(上部面板)和bv/bv鼠标(下部面板)。左侧面板:低倍图像显示小脑叶的整体形态在bv/bv鼠标。右侧面板:高倍图像显示,细胞内分子、神经节和颗粒细胞层的整体组织完整bv/bv鼠标。比例尺:100µm。(C) 根据对来自bv/bv和bv型/+老鼠。纳入标准是,每个外显子至少有2个探针组(用括号连接)表明,4个bv型/+和4bv/bv小鼠显著。左边的点表示外显子跳跃探针组生成的数据。(D) RT-PCR实验测试面板C中显示的18个MJAY“点击”中的15个的有效性;该分析表明,这些点击是误报。未显示其余3个MJAY点击的RT-PCR结果,因为这些反应未生成PCR产物。RT-PCR引物被设计成退火到构成外显子(白盒),位于被测盒外显子的两侧(红盒)。在非盒外显子的情况下,箭头指示用于测试剪接的引物的位置。Stx转录本的两个可选外显子上方的数字表示外显子的长度,单位为bp。(E) 大鼠小脑20个外显子剪接的RT-PCR分析bv/bv和bv型/+老鼠。测试外显子是从前庭黄斑区Srrm4调节的外显子中随机选择的。(PDF格式)
GUID:f29af-15E8-4E76-8DD1-E44A75215DE6操作
图S8:用RT-PCR方法评价大鼠大脑皮层10个外显子的选择性剪接bv/bv公司和bv型/+老鼠。(A) 大鼠大脑皮层外显子内含率的RT-PCR分析bv/bv和bv型/+小鼠(P15),根据前庭黄斑区包含率的降低选择8个外显子bv/bv中显示的老鼠RT-PCR引物被设计成退火到构成外显子(白盒),位于被测替代外显子的两侧(红盒)。(B) 大鼠大脑皮层外显子内含率的RT-PCR分析bv/bv和bv型/+从先前确定的Srrm4调节外显子中随机选择2个外显子的小鼠(P15)[28].(PDF格式)
GUID:E45A0C32-D4D7-410B-92A0-12D3026B262A
图S9:脑组织学评估bv/bvP15上的野生型小鼠。(A) 展示用于分析+/+和bv/bv老鼠。水平线旁边的大写字母表示准备冠状切片的区域。(B–Q)左侧面板:Nissl染色冠状切片的低倍图像+/+(B–I)和bv/bv小鼠(J–Q)。标有“m”和“r”的矩形表示放大倍率较高的区域(即10×物镜)。中间面板:+/+和bv/bv鼠标代表左侧面板中显示的“m”区域。右侧面板:+/+和bv/bv代表左侧面板中所示“r”区域的小鼠。(PDF格式)
GUID:0220FECE-6354-4FD1-B296-5EA60990AF24
图S10:Srrm4的功能分析重量和Srrm4bv型在HEK293细胞和斑马鱼中。(A) 用RT-PCR检测转染小基因和蛋白编码表达载体的HEK293细胞的选择性剪接。表达载体编码Srrm4重量,序号4bv型、Srsf1或无蛋白(载体控制)。每个小基因包含一个可选外显子(红框)、相邻的内含子序列(每个约300 bp)和两端的组成外显子。显示了小基因盒的启动子和多聚腺苷化位点(pA)。RT-PCR引物(箭头)被设计为退火到构成外显子。显示了使用12个微基因获得的结果。(B–C)以下各组(B)mGFP阳性神经肥大和(C)FM1–43染色毛细胞(HCs)数量的统计分析克劳丁B-mGFP转基因斑马鱼(ZF;72 hpf):未注射(对照,n = 20) ,zSrrm4 MO注入(n = 25)、zSrrm4 MO-和zSrrm 4bv型-注入(n = 9) 、Srrm4 MO-和zSrrm5重量-注入(n = 16) (单向方差分析,P(P)<0.0001,事后Bonferroni测试:*P(P)<0.01, **P(P)<0.001; NS:无显著性)。(PDF格式)
GUID:A7E267BF-5E0F-4B5C-B03A-569CAA028376
图S11:外显子和内含子突变对Srrm4依赖的选择性外显子纳入成熟mRNA的影响。(A)对照(WT)和突变(M)Dtna外显子11选择性剪接的RT-PCR测试。对于RT-PCR测试,从HEK293细胞中提取RNA,该细胞转染了两种Srrm4构建物(重量,+;或空pcDNA3.1载体,−)和含有Dtna外显子11的小基因(对照,WT;或突变体,M)。替代外显子的序列用蓝色字符突出显示;突变的核苷酸用粗体表示。小基因还包含外显子侧翼内含子序列(300–300 bp),来自德纳(B–C)选定UGC序列突变对Srrm4依赖剪接的影响。用RT-PCR检测两种Srrm4构建物(Srrm4+)转染的HEK293细胞的选择性剪接重量, +; 或空pcDNA3.1载体,−)和由外显子和内含子组成的小基因。对照(WT)微基因不包含突变,而突变微基因(M或M1-3)包含碱基替换。显示了每个编码前mRNA的相关序列片段。加粗表示碱基突变;连字符表示内含子-外显子边界;外显子包含水平以百分比表示。编码前mRNA中的G-to-A(B,C)和C-to-U(C)替换被设计用于改变选定的GC基序。(D) 位于Srrm4调节的选择性外显子上游的内含子区域的核苷酸保守性。红色柱的高度表示由PhyloP计算的脊椎动物基础保护得分[67]正数表示守恒,负数表示加速进化。下划线的GC基序包含对Srrm4依赖剪接很重要的G核苷酸。(PDF格式)
GUID:44690B5E-E886-4E85-8F71-925901758BC2
表S1:基因组序列接近序号4野生型和bv/bv老鼠。(XLS)
GUID:E22141D0-B8CB-4E4F-A9B7-EBF05AEE5175
表S2:外显子显示前庭黄斑区异常低的包涵率bv/bv老鼠。(XLS)
GUID:4C740E2A-D91C-4F21-B613-85B0D116352B
表S3:描述由Srrm4调节的mRNA编码的蛋白质的亚细胞定位和相互作用的出版物。(XLS)
GUID:3CE2A0EE-62A2-416E-B619-8ABD62361E20
表S4:用于扩增候选基因编码的转录物的引物bv型轨迹。(XLS)
GUID:3A8C7266-9456-4E7D-9D72-F6CF03796B29
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表S6:前庭黄斑区(vm)、小脑和大脑皮层替代外显子的包含率bv型/+和bv/bv小鼠百分比。(XLS)
GUID:4E9A1F30-7116-4E49-BBAE-ACF6EA96D7B2
表S7:用于RT-PCR验证微阵列数据的引物。(XLS)
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摘要
感觉毛细胞对听力和平衡至关重要。它们从上皮前体发育而来,在转录调控方面有广泛的特征,但在转录后影响方面没有。在这里,我们报道了一种替代性剪接调控因子的鉴定和功能表征,该调控因子的失活是导致自发突变Bronx waltzer(bv)小鼠毛细胞发育缺陷、耳聋和平衡受损的原因。我们使用定位克隆和转基因拯救来定位bv型剪接因子编码基因的突变Ser/Arg重复矩阵4(序号4). 对胚胎内耳感觉斑中前mRNA剪接的转录组全分析显示,bv小鼠中特定的替代外显子被跳过的比率异常高。异源表达系统中的小基因实验证实,这些跳过的外显子需要Srrm4才能包含到成熟的mRNA中。序列分析和突变实验表明,受影响的转录物共享一个新的基序,这是Srrm4-依赖的选择性剪接所必需的。功能注释和蛋白质-蛋白质相互作用数据表明,编码的蛋白质聚集在分泌和神经传递途径中。此外,一些转录调控因子的剪接被发现是Srrm4依赖性的,已知这些调控因子靶向的几个基因在bv小鼠中的表达水平降低。虽然在神经组织和毛细胞中检测到Srrm4的表达,但对bv小鼠小脑和新皮质的分析未能检测到剪接缺陷。我们的数据表明,Srrm4功能对听力和平衡器官至关重要,但并非对所有神经组织都至关重要。Srrm4是第一个与听力相关的替代性分裂调节因子,对bv小鼠的分析为毛细胞发育提供了外显子水平的见解。
作者摘要
新的致聋突变的鉴定有助于揭示内耳声音和重力敏感毛细胞发育所需的意外机制。Bronx waltzer(bv)小鼠的特征是毛细胞发育缺陷,以及耳聋和平衡能力受损。在这里,我们报告了我们在Ser/Arg重复矩阵4(Srrm4型)基因是这些缺陷的来源。编码蛋白Srrm4属于一个RNA剪接因子家族,它调节将某些遗传信息(即选择性外显子)包含到转录的RNA中。我们通过比较bv小鼠和对照小鼠内耳RNA的外显子组成来分析Srrm5的分子功能。这种方法表明,在bv小鼠中,蛋白质编码RNA中省略了特定的替代外显子。受影响的转录物具有两个特征:它们包含Srrm4依赖性剪接所需的短序列基序,并且它们编码的蛋白质主要与分泌和神经传递有关。此外,一些基因表达调控因子的RNA含有Srrm4调控的外显子。我们的数据表明,Srrm4依赖的选择性剪接对毛细胞的发育程序有着深远的影响。
介绍
听觉和平衡器官的毛细胞是专门的机械感受器,将机械刺激转换为电信号。这些信号通过连接传入神经元传递到中枢神经系统。听觉器官的毛细胞进一步分化为内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)。IHC是主要的听觉受体,而电动OHC(及其神经反馈回路)是机械刺激的放大器[1]在小鼠中,毛细胞在胚胎第17天(E)和出生后第4天(P)之间对机械刺激产生反应[2],[3]在此期间,毛细胞的机械感应静纤毛束生长并组织成越来越高的行[4]立体纤毛形成或传入突触发生的缺陷会导致耳聋和平衡受损[5]——[8].
感觉毛细胞的发育受几个已知的转录因子控制。例如,Sox2、Eya1和Notch效应器Hes1和Hey1/2是规范化过程的关键转录调节器,引导未分化耳囊细胞走向前驱性命运[9]根据细胞内是否存在基本的螺旋-环-螺旋转录因子Atoh1,原感觉细胞可以分化为毛细胞或支持细胞。的基因缺失Atoh1号机组导致毛细胞完全缺失[10]而Atoh1在支持细胞中的异位表达可以诱导静纤毛束的形成和毛细胞标记物的表达[11]——[13].Atoh1还诱导至少2种其他转录因子的表达(即毛细胞终末分化所需的Pou4f3和Gfi1)[14]——[17].
正确的毛细胞分化也被证明依赖于microRNA-96(miR-96),这是基因表达的转录后调节器。中的突变miR-96型人类和小鼠的基因都与耳聋有关[18],[19]对含有这种突变的小鼠的分析表明,这种miR是静纤毛束成熟以及建立听觉神经连接所必需的[20]此外,对内耳中缺少miR-processing蛋白Dicer1的敲除小鼠的分析支持了miR-依赖性基因表达调控在毛细胞分化中起关键作用的观点[21],[22].
为了确定毛细胞发育所必需的其他调节机制,我们分析了bv小鼠系,其内耳病理学表明bv型突变破坏了大多数毛细胞类型分化的关键基因[23]——[26]虽然纯合子bv的毛细胞(bv/bv)在E17.5之前,小鼠的形态学是完整的,听力器官中的IHC和平衡器官中的前庭毛细胞(VHC)都没有超出这一点。具体而言,IHC和VHC不能与传入神经元形成突触,表现出延迟的静纤毛束生长,并且在P3-5时趋于退化[25]——[27]这些毛细胞缺陷与这些动物的耳聋和平衡受损有关。这个bv/bv在失聪小鼠模型中,小鼠是独一无二的,因为IHC退化不会伴随OHC的丢失[23],[27].
在这项研究中,我们将bv小鼠系引起耳聋的基因缺陷定位于剪接因子编码基因Srrm4型(也称为nSR100元
[28]). 由于Srrm4在神经组织中广泛表达,我们使用组织选择性转基因拯救技术来检测内耳内外Srrm4s的生物学重要性。这些拯救实验的结果表明,特异性在毛细胞中的Srrm4功能缺陷是bv表型的主要原因,如果不是唯一原因的话。我们使用转录组宽的方法评估了Srrm4的分子功能,发现在内耳发育中的感觉斑片中需要类似神经元的选择性剪接,而在我们检测的其他Srrm4-表达组织中则不需要。大多数受影响的前mRNA编码蛋白具有与神经传递和分泌相关的功能,证实了选择性剪接因子可以选择性地改变细胞中的特定功能模块的概念。此外,毛细胞中Srrm4依赖性剪接影响转录调控因子,这些转录调控因子已知可控制神经组织中的细胞分化和突触前小泡处理。因此,我们对bv小鼠系的分析表明,选择性外显子选择的Srrm4依赖性调节对感觉毛细胞的分化程序具有深远的影响。
结果
Bronx waltzer鼠系在序号4基因
虽然基因受到bv型在以前的研究中没有发现突变,它被映射到5号染色体上的一个4兆碱基对(bp)区间[29]。我们检查了在此区间内定位的所有63个基因的组织表达谱和假定功能,并选择12个进行进一步分析(). 在扩增这12个基因的转录本时,我们发现其中一个编码剪接因子Srrm4的基因在bv/bv老鼠(). 序列分析表明,缩短的Srrm4转录本缺少数百个核苷酸,并保留了一个内含子序列()而其他扩增的转录本不包含任何突变(数据未显示)。3′端的排序序号4中的基因bv/bv小鼠发现2710-bp的缺失,删除了最后一个内含子的一部分和最后一个外显子的整个编码区,但保留了多聚腺苷化位点的完整性(和表S1). 受影响的最后外显子序号4编码Srrm4蛋白的潜在重要结构域,包括C末端SR重复序列和一个在Srm4及其最近的副序列Srrm3之间高度保守的区域(). 我们使用Western blotting检测野生型Srrm4的表达重量)蛋白和bv小鼠基因组编码的突变形式的蛋白(Srrm4bv型). 在Srrm4生成的核芯块中重量-转染HEK293细胞和来自平衡器官的感觉区(即前庭黄斑)在野生型小鼠中,该蛋白被检测为82至115kDa之间的多条带(). 相反,在Srrm4生成的核芯块中bv型-转染HEK293细胞和前庭黄斑bv/bv小鼠,在~82 kDa时仅检测到一条微弱的条带(). 因此bv型突变不仅会截断Srrm4蛋白,还会干扰截断蛋白的稳定性或合成。
中的缺失突变序号4bv小鼠的基因。(A) 所选候选基因在4兆碱基对(Mbp)区间的基因组位置示意图bv型已绘制突变图。(B) 左:基于RT-PCR的内耳异常短Srrm4转录物检测bv/bv鼠标。右:野生型(WT)和bv Srrm4转录物的示意图,显示RT-PCR引物(箭头)的位置、翻译和非翻译区域(分别为黑色和白色方框)以及bv/bv鼠标(灰色框)。(C) 比较序号4野生型和bv/bv老鼠。水平线代表内含子,黑色和白色方框分别代表外显子的编码区和非编码区。这个序号4的基因bv/bv小鼠缺少最后一个内含子和外显子的部分。色谱图突出了WT和bv/bv老鼠与序号4缺失位点附近的序列(从下部色谱的垂直线开始)。(D) Srrm4蛋白的示意图。括号表示最后一个编码的蛋白质部分序号4野生型小鼠的外显子bv/bv老鼠。还显示了富含Ser/Arg(SR)的区域、推测的核定位信号(NLS)以及Srrm4与其最近的副logue(Srrm3)之间高度保守的区域(Srrm 4中的氨基酸478-525)(红色)。(E) 上面板:转染HEK293细胞和前庭黄斑区(vm)Srrm4表达的免疫印迹分析bv/bv和+/+E16.5上的小鼠。如面板所示,HEK293细胞被Srrm4转染重量,序号4bv型,或空的表达载体。下图:所有样品中存在的层粘连蛋白B1信号证明了可比较的蛋白质负载量。箭头和数字(单位:kDa)表示MW标准的位置。
Bronx waltzer表型是由毛细胞中Srrm4功能缺陷引起的
接下来,我们使用就地杂交检测野生型Srrm4在内耳中的表达模式,发现在听力和平衡器官的所有感觉区域都检测到Srrm4mRNA(). 在耳蜗中,反义Srrm4探针标记IHC、OHC和螺旋神经节(). 在胞果中,感觉黄斑周围的染色最强烈()VHC密度最高[30]在壶腹嵴中,VHC区呈强阳性,而非感觉隔十字(位于前嵴,但不位于外嵴[31]),未标记(,星号)。阴性对照Srrm4感觉探针没有与内耳的任何感觉区域杂交(图S1). 这些数据表明,Srrm4在感觉毛细胞和螺旋神经节中表达。RT-PCR实验表明,Srrm4 mRNA也存在于大脑中,但不存在于肾脏、肝脏或脾脏中(数据未显示),这与之前报道的Srrm4mRNA的神经表达模式一致[28].
现场用反义Srrm4探针杂交小鼠内耳。(A) 整体安装就地内耳杂交显示每个平衡器官中Srrm4的检测(即壶腹嵴、球囊和胞囊)、皮质器官(OC)和螺旋神经节(SG)。(B) 在耳蜗中,反义Srrm4探针标记了所有三排OHC、一排IHC和螺旋神经节(SG)。(C) 在椭圆黄斑区,Srrm4信号贯穿始终,但在中央较弱(即条纹状)区域,而不是边缘。虚线表示条纹的估计中心。(D) 在amupllaris嵴中,感觉细胞层存在Srrm4信号。显示前嵴(A)和外侧嵴(L)。星号表示前嵴的未染色、无感觉的中隔十字韧带。图中还显示了椭圆黄斑的邻近部分。比例尺:100µm。
虽然Srrm4在神经组织中广泛表达,但我们假设毛细胞中的Srrm 4缺陷是bv表型的原因。我们通过转基因拯救测试了这种可能性。具体来说Myo7a-Srrm4型转基因()是由毛细胞特异性启动子Myo7a公司
[32]控制野生型Srrm4的转录。转基因创始小鼠是通过原核注射肌肉7a-肌肉4转基因,并培育成bv/bv行。现场内耳样本与对应于编码区的探针杂交Srrm4型外显子13证明Myo7a-Srrm4型转基因在转基因的平衡器官和IHC中表达bv/bv老鼠(图S2). 相反bv/bv小鼠未与Srrm4外显子13探针杂交(图S2),确认第13外显子在bv/bv老鼠。我们评估了Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv小鼠与非转基因bv/bv通过使用宽带声音在P21–28上测量这些动物的听觉脑干反应(ABR),与室友进行交流。ABR测量证实bv/bv小鼠听力严重受损(),而几个Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv小鼠处于野生型水平(). 然而,个人听力恢复的程度Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv小鼠不同()通过转基因谱系(图S3)可能反映了转基因插入位点或拷贝数的差异。
bv表型通过毛细胞靶向表达Srrm4型转基因。(A) 的示意图序号4为拯救实验而设计的转基因(Tg)。它由一只老鼠组成Myo7a公司启动子、Srrm4编码序列和聚腺苷酸化(pA)位点。(B) 典型ABR波形bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bv老鼠(bv/bv:Tg). 在指定的声压级(SPL)应用宽带点击刺激。(C) ABR阈值的统计分析bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bv老鼠;每个符号表示单个鼠标的值(单向方差分析,P(P)<0.0001,事后Tukey测试:*P(P)<0.01). (D) 坠落前在固定水平杆上花费的时间bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bvP70–80的小鼠。试验的最长持续时间为60 s(单向方差分析,P(P)<0.0001,事后Tukey测试:*P(P)<0.01). (E) 前庭黄斑准备bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bv小鼠(P5)用指骨肽-Alexa Fluor 488染色,以可视化富含肌动蛋白的结构,包括静纤毛。(F) Corti制剂的中期器官bv型/+,bv/bv公司、和Srrm4型-转基因bv/bv用抗Myo7a抗体染色的小鼠(P5),该抗体专门标记IHC(箭头)和OHC(括号)。只有IHC行受bv型突变。比例尺:50µm。
我们还评估了转基因的平衡性bv/bv动物,通过测量它们在水平杆上停留的时间长度。The performance of theMyo7a-Srrm4型转基因bv/bv小鼠与bv型/+在试验期间(60 s)能够留在杆上的动物;相比之下,大多数bv/bv小鼠在10秒内倒下()。
接下来我们分析了Myo7a-Srrm4型转基因对小鼠毛细胞存活的影响bv/bv老鼠。从动物的平衡器官上解剖了感觉区bv型/+,bv/bv、和Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv使用荧光标记的卵磷脂观察P5小鼠和富含肌动蛋白的VHC静纤毛束。查看的平衡器官bv/bv和Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv我们发现,绝大多数静纤毛束在前者中不存在,而在后者中几乎以正常密度存在(参见和定量分析图S4A). 在…的耳蜗里bv/bv小鼠静纤毛肌动蛋白染色和毛细胞蛋白Myo7a的免疫荧光显示均表明,71%的IHC在P5上缺失。相反,在Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv公司此时有63%的IHC存在于小鼠体内(和图S4). 这些结果表明序号4突变是导致bv小鼠系毛细胞丢失、耳聋和平衡缺陷的原因。我们的数据也支持这样一种观点,即bv/bv小鼠是由毛细胞而非神经元的缺陷引起的。
Bronx waltzer小鼠内耳有选择性剪接缺陷,但小脑没有
Srrm4属于SR相关蛋白家族,作为选择性前mRNA剪接的调节器[33],[34]因此,我们检测了胚胎毛细胞中的选择性剪接是否发生改变bv/bv小鼠,采用转录组方法。具体来说,胚胎毛细胞(和邻近的支持细胞)是从bv/bv和bv型/+小鼠,通过激光捕获显微切割,在E16.5上,即~毛细胞变性开始前1天。使用新的Affymatrix芯片“小鼠外显子连接阵列”(MJAY,). MJAY包含50多万个外显子和外显子-外显子连接探针集(参见),并查询UCSC/Ensembl数据库中小鼠EST/mRNA证据支持的所有剪接事件。MJAY数据的处理主要在Partek Genomics Suite中进行(详见方法),基于之前描述的用于分析人类外显子连接阵列数据的概念[35]。替代剪接事件的频率被认为在bv/bv和bv型/+样本,如果每个剪接事件至少有两个探针集的归一化强度差异()导致P(P)-值小于0.05。通过RT-PCR,使用与替代外显子上游和下游构成外显子退火的引物,发现并进一步测试了76个候选选择性剪接事件。这些反应证实了24种选择性剪接事件在bv/bv老鼠(和图S5A). 值得注意的是,对这些拼接缺陷的检查表明bv/bv某些替代外显子以较低的频率剪接到成熟的mRNA中,或完全跳过。受影响外显子的共同特征包括脊椎动物之间的保守性(数据未显示),以及除Add1外显子15外的神经元特异性包含模式(图S5C). 因此,我们使用“保守性”和“神经元特异性剪接”(基于EST证据)作为新标准,以仔细检查单个探针组提示异常剪接的外显子列表bv/bv公司老鼠。RT-PCR显示,在283个新的候选外显子中,有30个在bv/bv样品(图S5B). 因此,总的来说,RT-PCR证实了bv/bv鼠标(请参见表S2). 我们使用了DAVID软件[36]分析编码蛋白的基因本体(GO)注释,发现与“神经冲动传递”相关的P值最低(Benjamini-Hochberg修正P(P)-价值 = 0.00047),'细胞分泌'(P(P)-价值 = 0.0064),以及其他密切相关的GO术语(例如“细胞间信号”)。
bv/bv小鼠内耳有拼接缺陷,但小脑没有。(A) 分析前庭黄斑区前mRNA剪接的工作流程示意图bv/bv和bv型/+老鼠。通过激光捕获显微切割(LCM)分离前庭黄斑,并使用小鼠外显子连接微阵列(MJAYs)分析捕获组织中的RNA样本。(B) 盒式外显子MJAY探针组的设计。通常,4个MJAY探针组(黑盒)用于测量一个盒外显子的拼接(红盒);探针对盒外显子本身、上游和下游外显子-外显子连接以及跳跃连接进行退火。(C) 归一化探针信号的微阵列热图。探针组信号显示,每个可选外显子至少有两个探针组(通过括号连接)导致对前庭黄斑区剪接率的评估存在显著差异bv型/+和bv/bv老鼠。左边的点表示外显子跳跃探针组生成的数据。(D) RT-PCR验证前庭黄斑区8种剪接差异bv型/+和bv/bv小鼠(其他RT-PCR数据如图S5). RT-PCR引物被设计为退火至构成外显子(白盒),外显子侧翼为测试的替代外显子。(E) 归一化探针强度比(我
规范)来自前庭黄斑bv型/+和bv/bv将小鼠与来自bv公司/+和bv/bv老鼠。只有指示前庭黄斑区拼接差异的探针组才包括在图中(皮尔逊相关检验,第页 = 0.1,P(P) = 0.3). (F) RT-PCR证实bv/bv小鼠缺乏在同一小鼠系的前庭黄斑区观察到的剪接缺陷。
我们发现的大多数拼接缺陷位于bv/bv在早期一项检测Neuro2A细胞系中Srrm4功能的研究中,没有报告过小鼠(81%)[28]相反,尽管发现nPTB(外显子10)是Neuro2A细胞中Srrm4的关键靶点[28],它在前庭黄斑区正常拼接bv/bv老鼠(图S5D). 然而,也有明显的重叠情况。例如,RE1沉默转录因子(Rest,外显子4)被报道为Neuro2A细胞中Srrm4的靶点[37],RT-PCR显示相同的Rest外显子在小鼠内耳中的剪接方式不同bv/bv和bv型/+老鼠(图S5E). 此外,研究表明,Rest的Srrm4依赖性剪接影响了Neuro2A细胞中众多Rest调节基因的表达[37],我们对MJAY数据的分析表明,Rest调节基因[38]在前庭黄斑区表达减少的患者中bv/bv小鼠(χ2测试P(P)<0.0001,图S6). 值得注意的是,我们的数据显示,Phf21a/Bhc80 mRNA编码Rest-dependent转录调控的负调节剂[39]——[41],在前庭黄斑区也有不同的拼接bv/bv和bv型/+老鼠(). 这些结果支持了Srrm4可能通过特定转录调控因子的选择性剪接来修改毛细胞基因表达的观点。
我们还想测试bv型突变导致除内耳外Srrm4表达组织的剪接改变。根据我们的RT-PCR分析,我们将重点放在小脑上,结果表明Srrm4转录本在该组织中高度表达(图S7A)、和就地艾伦脑图谱中的杂交数据[42]这表明小脑富含神经元的层含有大量的Srrm4 mRNA。值得注意的是,尽管MJAY数据分析确定了18个选择性外显子在小脑中的潜在不同拼接bv/bv公司和bv公司/+P15小鼠的RT-PCR分析未能验证这种结果(图S7C和S7D). 此外,MJAY和RT-PCR数据均显示,在bv小鼠系中,前庭黄斑异常剪接的替代外显子在小脑中的包含率没有改变(和图S7E). 鉴于Srrm4 mRNA在新皮质中高度表达[28],我们使用RT-PCR来测试该组织中10个Srrm4调节外显子的包含率。我们再次发现,在被调查的大脑区域中,受试的替代外显子的包含率没有变化bv/bv老鼠(图S8). 这些发现得到小脑和大脑新皮质缺乏明显组织学改变的支持bv/bv老鼠(图S7B和图S9). 总之bv型突变不会导致这些表达Srrm4的组织出现明显缺陷。
Srrm4依赖的选择性剪接需要Srrm4C末端区域和靶前mRNA中的新序列基序
接下来,我们使用一个重建系统来评估Srrm4bv型蛋白质保留分子功能。具体而言,将Srrm4转染HEK293细胞bv型,序号4重量或与由外显子和内含子组成的各种小基因一起的空载体(对照)。每个微基因结构都包含一个外显子,该外显子在bv/bv小鼠、侧翼内含子序列(~300bp)和两个组成外显子(). 在54个备选外显子中,其包含率在bv/bv随机选择12只小鼠进行微基因实验。基于RT-PCR的前mRNA剪接评估表明,所有12个外显子都需要Srrm4重量用于转染细胞中的选择性剪接,以及Srrm4bv型无法促进这种拼接(和图S10A). 当微基因与编码SR蛋白而非Srrm4的构建物共同转染时(即Srsf1),替代外显子的纳入率没有超过背景水平(图S10A). 因此,小基因实验证实,被测外显子的剪接依赖于Srrm4重量,也表明bv截短阻止了功能性Srrm4蛋白在转染的HEK293细胞中的表达。
Srrm4依赖性剪接需要Srrm4C末端区域和前mRNA中的新基序。(A) 基于RT-PCR的HEK293细胞选择性剪接检测与Srrm4-编码结构(Srrm4重量,序号4bv型或空表达载体)以及由外显子和内含子组成的小基因(图)。每个小基因都包含一个可选外显子(红盒)和相邻的内含子序列,这些序列位于两个组成外显子之间(白盒)。指出了小基因的启动子和多聚腺苷酸化位点(pA)。箭头指示RT-PCR引物的位置。显示了4个小基因编码mRNA的RT-PCR结果。注射zSrrm4 MO、MO不敏感zSrrm 4不同组合的斑马鱼(B–E)毛细胞存活率重量mRNA和MO不敏感zSrrm4bv型mRNA,如图所示。上面的面板显示了每个治疗组斑马鱼(72 hpf)的典型亮场图像。在用FM1–43染料(强绿色信号)可视化毛细胞后,下部面板显示了每个治疗组的神经肥大的代表性荧光图像。细胞-细胞连接处微弱的绿色信号是由于斑马鱼神经肥大细胞膜锚定GFP的转基因表达。比例尺:200µm。(F) Srrm4调节外显子上游的一致序列模体的序列缺失表示。检测到的共有基序包括一个聚嘧啶域、一个UGC基序和一个AG基序。(G) 转染Ergic3小基因野生型(WT)或突变型(M1-4)版本以及Srrm4的HEK293细胞选择性剪接的RT-PCR测试结果重量(+)或空表达式向量(−),如图所示。图中显示了WT和突变序列(M1–4)。突变碱基以粗体显示。(H) 使用生物素化RNA寡核苷酸或控制空链霉亲和素珠(−),RNA从转染HEK293细胞的全细胞裂解物(裂解物)中拉下标记的Srrm4。野生型RNA寡核苷酸(WT)序列包含来自Srrm4调节外显子之前内含子的35个核苷酸和来自外显子的5个核苷酸。内含子和外显子之间的边界用连字符表示。在突变的RNA寡核苷酸(M)中,GC基序被AU(粗体字符)取代。使用抗标记抗体和Western blotting评估细胞裂解液和洗涤珠上的标记-Srrm4数量。
我们还测试了Srrm4的功能状态bv型
体内以斑马鱼为动物模型。通过注射先前描述的zSrrm4吗啉(MO),斑马鱼内源性Srrm4mRNA被敲除[28]变成鱼卵。其中一些卵子还注射了编码MO不敏感野生型zSrrm4(zSrrm 4)的mRNA重量)或斑马鱼版本的MO不敏感Srrm4bv型(zSrrm4)bv型). 三天后,用荧光染料FM1–43在斑马鱼幼虫的侧线上观察到毛细胞[43],[44]。我们发现,在注射zSrrm4 MO的鱼中,体轴异常弯曲(对,上部面板)。此前曾描述过Srrm4击倒斑马鱼的身体轴畸形,并将其归因于神经元缺陷[28]此外,我们发现zSrrm4 MO注射鱼的毛细胞数量显著减少(对、下部面板和定量分析图S10B和S10C) ●●●●。zSrrm4的共注入重量含MO的mRNA修复了体轴畸形和毛细胞丢失(),而zSrrm4的联合注入bv型mRNA没有(和中的统计分析图S5B和S5C). 这些数据表明Srrm4bv型不起作用,无论表达式系统如何。此外,我们的数据表明,尽管Srrm4功能的丧失对斑马鱼的表型影响比小鼠更大,但Srrm5对两种动物的毛细胞发育都至关重要。
我们假设一个独特的序列基序可以标记Srrm4调节的外显子进行剪接。最初,我们专注于外显子序列,测试一个9核苷酸长的外显子,我们发现其剪接受Srrm4调节(即Dtna外显子11)。然而,9核苷酸外显子中5个连续核苷酸的随机突变并不影响其Srrm4依赖性剪接()。接下来,我们使用MEME软件[45]在Srrm4调节的外显子(n = 54)和与这些外显子直接相邻的50核苷酸长的内含子部分。MEME确定了3个具有P(P)-值小于0.05,包括一个新的UGC基序和2个剪接因子的已知结合序列(即U2af1和U1小核糖核蛋白)。UGC基序上游和下游内含子序列的比对表明,它位于聚嘧啶束的3′端附近(). 为了测试UGC是否通常发生在外显子上游(即,不考虑Srrm4依赖的选择性剪接),我们评估了Cacna1d和Ergic3前mRNAs(n = 60). MEME没有检测到UGC是这些序列中的常见基序。因此,UGC对于特定的Srrm4依赖拼接可能很重要。
接下来,我们使用G-to-A点突变来破坏从需要Srrm4进行选择性剪接的小基因中随机选择的6个小基因中的选定UGC基序。在所有情况下,突变抑制了Srrm4依赖的外显子内含子(,图S11B——S11C型). 还进行了突变实验,以测试UGC基序中其他两个核苷酸的重要性。我们发现C-to-U替换(和图S11C),但不是U-to-C/G/A突变(数据未显示)抑制了Srrm4依赖性外显子的包含。因此,尽管U核苷酸通常位于功能相关的GC基序之前,但Srrm4依赖的选择性剪接只需要GC核苷酸。
Blast搜索显示,功能相关的GC基序在脊椎动物物种中是保守的(图S11D). 为了测试这些基序是否与Srrm4相互作用,我们使用两种生物素标记的RNA寡核苷酸进行了链霉亲和素下拉分析。“野生型”RNA寡核苷酸与Ergic3前mRNA中Srrm4调节外显子剪接受体位点周围的40-核苷酸长序列完全对应,而“突变型”RNA少核苷酸包含GC-AU替换(). 对转染了Srrm4标记的HEK293细胞制备的细胞裂解物进行Western blot分析,结果表明只有“野生型”RNA能有效地抑制Srrm5标记的细胞(). 这些结果表明,Srrm4调控外显子剪接受体位点上游的保守GC基序对于Srrm4+pre-mRNA之间的相互作用是必要的。
讨论
在本研究中,我们发现bv/bv小鼠是由序号4基因。利用bv鼠系和全基因组筛选方法分析Srrm4的分子功能体内,我们确定Srrm4是内耳前mRNA剪接的关键调节因子。此外,我们发现Srrm4是一组特定外显子的选择性剪接所必需的,这些外显子在多嘧啶束3′端附近以GC基序标记。这个序号4中的突变bv/bv小鼠还影响内耳感觉区的基因表达,表明Srrm4控制转录组修饰事件的级联。基于对bv小鼠系的分析,我们认为Srrm4调节的选择性剪接对除OHC外的所有感觉毛细胞类型的分化至关重要。
虽然Srrm4在神经组织中广泛表达,但我们没有检测到P15小脑和新皮质的剪接缺陷bv/bv老鼠。此外,如果神经发生受损bv/bv小鼠胚胎,这种缺陷的后果不容易通过P15的尼塞尔染色检测出来。然而,我们不能排除前mRNA剪接在其他时间点或在这些动物的其他脑区受到影响的可能性。值得注意的是,最近的一项研究表明,用编码Srrm4靶向shRNA的载体电穿孔心室区的神经祖细胞后,E13/14野生型小鼠的神经发生受损[37]此外,在检查bv小鼠的大脑时,Matsuda及其同事观察到基于免疫荧光的表达小分子白蛋白的GABA能中间神经元可视化[46]在听觉皮层、体感皮层和前扣带回检测到异常少的小白蛋白表达细胞,而视觉皮层和杏仁核复合体则未受影响。对这些数据的一种可能解释是bv/bv小鼠直接影响某些脑区中间神经元的分化。或者,在表达小白蛋白的细胞数量上观察到的一些变化可能是继发于bv/bv老鼠。这种可能性与先天性耳聋被证明可以阻止GABA能在听觉皮层的成熟传递这一事实是一致的[47],[48]感觉性听力损失与上橄榄复合体中微小阳性细胞数量的减少有关[49]此外,据报道,前庭输入的缺乏会导致前庭内侧核内各种钙结合蛋白(包括小白蛋白)的表达减少[50]因此,有必要进行额外的研究,以确定某些脑区GABA能中间神经元密度改变的病因bv/bv公司老鼠。
在斑马鱼中,MO介导的Srrm4敲除对两种神经分化都有明显影响[28]和毛细胞发育(). 为什么Srrm4缺乏对斑马鱼神经分化的影响比小鼠大得多?一种可能的解释是,Srrm4以外的剪接蛋白在小鼠大脑中具有Srrm4-like功能,但在斑马鱼大脑中没有。然而,两项发现提出了更复杂的解释。首先,虽然bv小鼠中大约70%的IHC在E18和P5之间死亡,但在P5之后这种趋势不会继续[27]第二,幸存的国际控股公司最有可能发挥作用,因为bv/bv老鼠并不是完全聋的。这些数据表明,在发育的关键阶段后,内耳不需要Srrm4。剪接抑制物聚嘧啶束结合蛋白1(PTBP1)的基因表达谱支持这一“关键期”假说,该蛋白已被证明抑制Neuro2A细胞中至少一些Srrm4调节外显子的构成性内含[28]PTBP1仅在分化的早期阶段在神经细胞中表达[51]因此,当神经细胞不再含有PTBP1时,在发育的后期可能不需要Srrm4。我们推测,尽管Srrm4缺乏可能会导致小鼠和斑马鱼早期发育过程中神经元的剪接缺陷,但Srrm4-独立的调控机制足以支持小鼠的神经元分化,直至关键期结束,但斑马鱼则不然。
我们的发现是,Srrm4依赖的外显子包含需要在多嘧啶束的3′端附近存在GC基序,这表明该基序是一个顺式-Srrm4相关拼接的调节元件。Cis公司-调控元件是招募RNA结合蛋白的短序列基序[52]; 它们可以增强或抑制外显子内含子,这取决于招募的剪接因子以及在某些情况下外显子的位置顺式-与外显子相关的调控元件[53],[54].由相同RNA-结合蛋白共同调节的前mRNA通常包含相同的顺式-监管要素。因此,Srrm4突变小鼠中几乎每个受影响外显子旁边都存在相同的基序,这表明这些外显子纳入mRNA受到相同的Srrm4-依赖机制的调节。
我们的RNA下拉实验表明,GC基序对于Srrm4和RNA之间的相互作用是必要的。这种相互作用是直接的还是通过其他蛋白质介导的,尚待确定。值得注意的是,GC基序并不是前mRNA中对Srrm4依赖性剪接事件的调控非常重要的唯一序列。以前的一项研究表明,富含嘧啶基序通常存在于Srrm4调节外显子侧面的内含子中[28]这些富含嘧啶的基序是PTBP1的结合位点[28]由于GC基序位于多嘧啶序列的3′端附近,因此很容易推测Srrm4或Srrm4-结合蛋白对前mRNA的招募可能会干扰PTBP1的结合。
Srrm4调节的外显子在用GO术语“神经冲动的传递”和“细胞分泌”注释的蛋白质转录本中比在随机蛋白质组的转录本中更常见,这一事实表明,Srrm4-调节的前mRNA的蛋白质产物在功能上是相连的。我们通过收集PubMed关于受影响蛋白质的亚细胞定位和相互作用的数据来探索这种可能性;考虑到我们希望最大限度地收集信息量,我们没有将PubMed搜索限制在与头发细胞相关的出版物上。根据收集到的信息,我们在毛细胞基底外侧部分的示意模型上绘制了受影响蛋白质的可能亚细胞定位图(). 该模型表明,Srrm4调节转录物编码的大多数蛋白质可能与突触小泡和突触前质膜有关。值得注意的是,该模型中42%的蛋白质由Srrm4调节的前mRNA编码,并在PubMed数据库中具有已知的蛋白-蛋白质结合伙伴,这些蛋白质相互作用(参见表S3). 因此,GO注释分析和蛋白质相互作用模式都表明,Srrm4依赖性修饰主要集中在蛋白质组的单个功能模块中,该模块负责突触突触前侧的分泌和神经传递。该分析还表明,Srrm4调节的蛋白质具有非特征化的分子功能(例如与其他生物过程相比,Plekha6、6330403A02Rik和C230096C10Rik)更可能参与分泌或神经传递。
图示由验证的Srrm4-regulated mRNA编码的蛋白质的已知和预测亚细胞定位。由Srrm4依赖性剪接的经验证的mRNA靶标编码的蛋白质显示为蓝色。蛋白质定位和相互作用数据的参考文献列于表S3对于由Srrm4调节的mRNA编码的8种蛋白质,亚细胞定位要么位于所描述的区域之外,要么未知。已知不受Srrm4调节但将Srrm4-regulated蛋白质相互连接或膜连接的蛋白质显示为绿色。箭头指示每个传输事件的方向。
IHC和VHC向各自神经传入的持续高速神经传递需要特殊的突触前结构,称为突触带。大多数OHC仅在分化过程中暂时含有突触带;突触带唯一存在的OHC是最顶端的OHC[55]。有趣的是,在bv/bv小鼠OHC是唯一保持完整的毛细胞,许多有剪接缺陷的蛋白质定位于突触带(即Cacna1d、Cask、Erc2、Rims2、Snap91和Syncj1[56]). 因此,突触发生缺陷的细胞类型特异性似乎是由于缺乏形成突触带所需的蛋白亚型。或者,支持Srrm4调节的外显子包含在小脑和大脑新皮质的机制可能是bv/bv小鼠还可以保护OHC免受退化。这些假设可以通过分析胚胎OHC中的前mRNA剪接来验证bv/bv和对照小鼠。然而,由于发育中内耳中OHC和IHC的物理邻近性,从胚胎OHC中选择性收集RNA在技术上具有挑战性。因此,对卵巢癌组织中前mRNA剪接的分析bv/bv老鼠尚未被执行。
虽然我们发现bv小鼠系中的大多数剪接缺陷与分泌和突触装置有关,但至少两个睫状体蛋白编码mRNA的选择性剪接(即Bbs9和Wdr35)也发生了改变。此外序号4突变导致受体样肌醇磷酸酶Ptprq表达减少,这是耳蜗中静纤毛束发育所必需的[57]Srrm4依赖性剪接也影响编码核蛋白的至少3个mRNA(即Rest、Bhc80和Mef2d)。其中两个(即Rest和Bhc80)已被证明对基因表达有相反的影响,并有报道通过翻译调节控制囊泡加工和胞吐[41],[58],[59]我们发现,Rest和Bhc80调节的基因(而非Mef2d调节的基因)在44个前庭黄斑区表达量减少最多的患者中过度表达bv/bv老鼠。因此,Rest和Bhc80前mRNAs的Srrm4依赖性剪接支持我们的假设,即Srm4在毛细胞调节分泌器官的成熟中起作用。先前在受到RNA干扰的Neuro2A细胞中描述了在Srrm4功能降低的情况下,Rest mRNA的剪接改变和Rest靶基因的表达降低[37]因此,两者体内和在体外数据表明,Srrm4功能的丧失导致转录组级联改变,影响前mRNA剪接和基因表达。进一步研究确定单个Srrm4调节外显子在毛细胞发育中的重要性,将使我们能够阐明毛细胞退化的详细发病机制bv/bv公司老鼠。
总之,在分析bv小鼠系时,我们确定Srrm4是听觉和平衡器官毛细胞分化所需的选择性剪接的调节器。我们提出,转录组修饰事件的Srrm4调节级联调节分化毛细胞的蛋白质组,使其具有神经元样功能。我们的研究将选择性剪接添加到对毛细胞分化至关重要的机制列表中。已知一些致聋突变定位于替代外显子(即R643X英寸PCDH15型
[60]和R500X英寸特里克
[61])了解内耳选择性外显子选择的调控,有望为耳聋的预防创造治疗机会。
方法
bv鼠系的遗传分析
通过胞质内精子注射从冷冻保存的精子样本(从欧洲突变小鼠档案馆获得)中回收bv小鼠株。所有实验和程序均由爱荷华大学动物护理和使用委员会批准。为了进行突变分析,从bv/bv和野生型小鼠(E16.5),使用Trizol试剂。使用RT-PCR从RNA样本中扩增候选mRNA的编码区(参见表S4),并对PCR产物进行测序。扩增和测序与缺失位点相邻的基因组bv/bv使用基于PCR-的genome-Walker Universal试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.)和一个基因特异性引物进行小鼠“基因组行走”,该引物退火为序号4(5′-ACGGGACCTAAAGTAGGTGAAAG-3′). 对于基因分型,是否存在bv型使用尾部DNA提取物和2组引物对(野生型等位基因:5′-GGGAAGAGGTGAGTGTTG-3′和5′-CCTCGTGCTGGCATAGCTTTC-3′; bv等位基因:5′-GAAGAACCAGCCCCGAGAA-3′和5′-CTGGGCAGGAGGGTACTTCTCATAC-3)。
Srrm4转基因小鼠的制备与分析
这个Myo7a-Srrm4型通过亚克隆小鼠Srrm4编码cDNA下游的小鼠构建转基因Myo7a公司pSTEC-1载体中SV40多聚腺苷化位点的启动子和上游,使用标准PCR和亚克隆方法(参见表S5). 通过限制性消化从pSTEC-1中分离出Myo7a-Srrm4表达盒,并送往Xenogen Corp.生产转基因小鼠。使用先前描述的开放场系统和宽带点击刺激,在P21-28测量小鼠的ABR阈值[62]。在两次训练试验后,通过测量每只小鼠在固定水平杆(直径1.8厘米)上停留的时间来评估小鼠的平衡能力(P70-80)。如前所述,对PFA固定耳蜗和前庭组织的全套制剂进行肌动蛋白和Myo7a染色[63],使用以下试剂和抗体:Alexa-488标记的卵磷脂(Invitrogen Corp.)、兔抗Myo7a抗体(Proteus Biosciences,Inc.)和Alexa-594标记的抗兔IgG(Invit罗gen Corp)。
现场杂交
地高辛标记的反义外显子13探针(Srrm4中的编码核苷酸1521–1827)、有义和反义Srrm4核糖探针(编码核苷酸23–188)使用DIG RNA标记混合物(Roche)产生,并与不同基因型小鼠的内耳样本杂交,如前所述[17].
用于微阵列分析的激光捕获显微切割和RNA提取
将小鼠胚胎(E16.5)的内耳嵌入Tissue-Tek O.C.T.复合物(Sakura Finetech,Inc.)中,在液氮中冷冻,然后冷冻切片。使用Arcturus Histogene冷冻切片染色试剂盒(Applied Biosystems)对切片进行进一步处理,以进行激光捕获显微切割。修改了制造商的染色方案,将RNA酶抑制剂(ProtectRNA,Sigma)添加到试剂盒中含有5%以上水的每种溶液中。使用激光捕获显微解剖系统(加利福尼亚州山景城Pixell II Arcturus)从内耳切片上捕获前庭黄斑。使用PicoPure RNA分离试剂盒从捕获的组织中分离RNA。还使用Trizol试剂(Invitrogen)从P15小鼠小脑提取RNA。小脑RNA用DNase处理,并使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)进一步纯化。
微阵列分析
使用NuGEN WT-Ovation Pico RNA扩增系统、NuGEN WT-Ovation Exon模块和NuGEN FL-Ovation-cDNA生物素模块处理用于微阵列分析的RNA样本。样品与小鼠外显子结合微阵列杂交(MJAY,Affymetrix Inc.)。使用Affymetrix Model 7G升级扫描仪对MJAY进行扫描,并使用GeneChip操作软件收集数据。将原始微阵列CEL文件导入Partek Genomics Suite(Partek,Inc.)。使用鲁棒多芯片平均背景校正对探针组的信号强度进行分位数归一化和中值抛光。外显子探针组的信号强度用于计算MJAY中表示的每个基因的总体表达水平。归一化探针集强度(我
规范)通过将外显子和外显子连接探针组的背景校正信号强度除以相应基因的背景校正基因表达信号来计算。这个我
规范在中bv/bv和bv型/+样本由双尾学生分析t吨-测试。具有显著差异的探针组我
规范(P(P)使用简单的Visual Basic for Application脚本,针对Affymetrix注释地图文件(其中包含每个测量拼接事件的替代/构成注释)进行查询,并过滤出测量构成事件的探针集。其余探针组在UCSC基因组浏览器中根据“SIB Alt-Splicing track”进行查询,以识别并排除那些与多个基因的同源性超过50%或测量替代启动子活性的探针组。根据小鼠基因组查询其余探针组的序列,以确定那些测量相同剪接事件的探针组。我们要求针对竞争亚型的探针组具有相反的功能我
规范趋势。
RT-PCR和基于小基因的MJAY数据验证
基本上如前所述进行RT-PCR[64]我们将替代外显子定义为“不同拼接”bv/bv和bv型/+如果RT-PCR数据表明外显子的包含率在比较样品之间至少相差1.5倍(表S6包含根据RT-PCR数据计算的纳入率,如,图S4,第7部分、和第8节)。表S7列出了用于生成中所示数据的所有引物,图S4,第7部分、和第8节.
为了对Srrm4依赖性剪接事件进行基于小基因的验证,对替代外显子和相邻的~300bp内含子序列进行PCR扩增,并将其亚克隆到外显子陷阱pET-01载体中(Mobitec,见表S5). 鼠标Srrm4重量和Srrm4bv型通过RT-PCR扩增(参见表S5)从内耳RNA亚克隆到pcDNA3.1表达载体。Srsf1表达结构(Addgene质粒17990)已在前面描述[65]使用Lipofectamine LTX和PLUS试剂(Invitrogen)将minigines、Srrm4编码结构体和Srsf1编码质粒转染到HEK293细胞中,24小时后使用RNeasy mini kit(Qiagen)从细胞中提取RNA。用上标III逆转录RNA,并使用退火到构成外显子的引物(引物:5′-CACTTGGTGGAAGCTCTCTACC-3′和5′-CCACCTCCAGTGCCAAGGTC-3′). 利用重叠延伸PCR对微小基因进行定点突变。
斑马鱼的Srrm4击倒和救援实验
Srrm4敲除实验是在Haas和Gilmour开发的转基因斑马鱼系中进行的[66]在这些转基因斑马鱼的神经肥大中,claudin B启动子驱动膜栓系GFP(Tg[CldnB-mGFP])的表达。通过向转基因斑马鱼(2细胞期)注射先前描述的zSrrm4 MO,zSrrm 4表达被抑制[28](5′-TTCTCCCAAAAGTACCAGCCATG-3′来自Gene Tools,Philomath,OR;5 ng zSrrm4吗啉/胚胎)。由于注射5 ng zSrrm4 MO导致非特异性毒性,p53靶向MO(5′-GCGCATTGCTTTGCAAGAATTG-3′来自Gene Tools;5 ng/胚胎)共同注射。注射后3天,用3µM FM1–43染料孵育斑马鱼幼虫30秒,以标记神经桅杆中的机械感应毛细胞。FM1–43染色导致亮绿色信号,比GFP信号强烈得多氯化物B-mGFP转基因。在用FM1–43染色后,将斑马鱼冲洗、麻醉(0.02%3-氨基苯甲酸乙酯),装在3%甲基纤维素中,并拍照。zSrrm4重量和zSrrm4bv型用于救援实验的mRNA是使用mMessage mMachine试剂盒(Ambion)和含有zSrrm4的CS2+质粒生成的重量和zSrrm4bv型cDNA(参见中的克隆引物表S5). zSrrm4重量和zSrrm4bv型将mRNAs注射到先前注射有靶向zSrrm4和p53的MOs的斑马鱼胚胎(4细胞期,10ng-mRNA/胚胎)中。胚胎保存3天后,使用上述FM1–43染料对机械感觉毛细胞进行染色。
蛋白质印迹
从44个野生型和44个前庭黄斑分离出核部分bv/bv公司E16.5上的小鼠,根据制造商的说明使用核复合物Co-IP试剂盒(Active Motif)。用酶切鸡尾酒(活性Motif)处理获得的核组分,并在4°C下在16000 g下离心15分钟。将小球溶解在SDS样品缓冲液中,煮沸3分钟,通过SDS-PAGE进行解析,并在硝化纤维素膜上进行电印迹。在阻断培养步骤后,将羊抗Srrm4抗体(来自Santa Cruz Biotechnology Inc.的sc-139291)稀释1∶200或兔抗拉明B1抗体(来自Abcam的ab16048)稀释1比5000添加到膜中14小时。经过多次清洗步骤后,将膜与HRP结合的二级抗体(抗羊IgG和抗兔IgG)孵育。使用增强化学发光检测系统(Pierce Biotechnology)可视化免疫印迹信号。
RNA下拉分析
将标记的Srrm4亚克隆到pcDNA3.1表达载体中,并转染到HEK293细胞中。转染24小时后,收集细胞并将其重新悬浮在缓冲液DG中(含有80 mM谷氨酸钾、0.1 mM EDTA、10%甘油、0.01%NP40、0.1 mM-PMSF、1 mM DTT、16µg/ml凝乳抑素、10µl/ml蛋白酶抑制剂混合物[来自Sigma]和20 mM Hepes-KOH,pH 7.9)。然后对细胞进行声波处理,在冰上培养15分钟,并在4°C下在16000 g下离心15分钟。收集上清液,并在补充有2.2 mM MgCl的缓冲液DG中稀释至5倍2,0.1 mg/ml tRNA(Invitrogen)和1 U/ml RNase OUT。将生物素化RNA寡核苷酸(4µg)和NutrAvidin琼脂糖树脂(Pierce Biotechnology的~45µl)的混合物添加到细胞裂解液中。在4°C下培养1.5小时后,用缓冲液DG(补充2.2 mM MgCl)清洗树脂6次2,0.1 mg/ml tRNA和1 U/ml RNase OUT),重新悬浮在45µl的2×SDS样品缓冲液中,并煮沸5分钟。短暂离心后,通过SDS-PAGE解析上清液部分,并将蛋白质电印在硝化纤维素膜上。将膜封闭,并用1∶1000稀释的单克隆抗标记抗体(Sigma)孵育14小时。经过多次清洗步骤,用HRP结合的二级抗体(抗鼠IgG)培养膜。信号通过增强化学发光检测系统可视化。
支持信息
图S1
现场野生型小鼠感觉内耳区与阴性对照探针的杂交。(A–C)野生型小鼠的耳蜗(A)、椭圆黄斑(B)、壶腹嵴(B)和囊状黄斑(C)缺乏信号(P0)就地用感测Srrm4探针杂交。OC:Corti器官;U: 胞果;AC:前嵴;LC:侧嵴。比例尺:100µm。
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图S2
现场野生型感觉内耳区杂交,bv/bv、和Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv公司具有与中的编码区相对应的反义探针的小鼠序号4第13外显子。(A–C)野生型小鼠(P0)对序号4外显子13在耳蜗(A)、椭圆黄斑(B)、壶腹嵴(B)和囊状黄斑(C)中的表达。(D–F)bv/bv鼠标(P0)为阴性序号4外显子13在耳蜗(D)、椭圆黄斑(E)、壶腹嵴(E)和囊状黄斑(F)中的表达。(G-I)Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv小鼠(P0)阳性序号4外显子13在耳蜗IHC(G)、椭圆黄斑(H)、壶腹嵴(H)和囊状黄斑(I)中表达,但在OHC(G)中表达为阴性;缺乏转基因Myo7a公司在一些人中观察到OHC的启动子活性Myo7a-GFP转基因小鼠系[32].OC:Corti器官;U: 胞果;AC:前嵴;LC:侧嵴;IHC:内毛细胞。比例尺:100µm。
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图S3
创始人基于鼠标的ABR数据分解和平衡测试结果.(A)ABR阈值bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bvP21–28上的小鼠。(B) 坠落前在固定水平杆上花费的时间bv型/+,bv/bv公司、和Srrm4型-转基因bv/bvP70–80小鼠。从转基因创始小鼠的后代获得的数据用相同类型的符号表示。每个符号表示单个鼠标的值。用于ABR和平衡测试的小鼠来自于成对的bv型/+:Tg和bv/bv老鼠。
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图S4
的影响Myo7a-Srrm4型转基因对小鼠感觉毛细胞丢失的影响bv/bv老鼠。(A–B)纤毛(A)囊毛细胞(HCs)和(B)耳蜗IHCs的计数bv型/+,bv/bv、和Myo7a-Srrm4型转基因bv/bv(bv/bv:Tg)小鼠(P5)。每个符号表示单个小鼠的心室HC或IHC计数(单向方差分析,P(P)<0.0001,事后Tukey测试:*P(P)<0.01, **P(P)<0.001). (C) Corti器官制剂bv型/+,bv/bv、和序号4-转基因bv/bv(bv/bv:Tg)小鼠(P28)用柱状肽-Alexa Fluor 488染色,以可视化富含肌动蛋白的结构,包括静纤毛。箭头表示IHC行。比例尺:20µm。
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图S5
前庭黄斑区神经元特异性外显子剪接的差异bv/bv和bv型/+老鼠。激光捕获前庭黄斑区RNA样品选择性剪接的(A–B)RT-PCR分析bv/bv公司和bv公司/+小鼠(E16.5)。(A) 显示了两种基因型之间的差异导致的扩增外显子P(P)对于每个外显子至少两个MJAY探针组,<0.05。RT-PCR引物被设计成退火到构成外显子(白盒),位于被测盒外显子的两侧(红盒)。在非盒外显子的情况下,箭头指示用于测试剪接的引物的位置。(B) RT-PCR扩增了两种基因型差异导致的神经元特异性外显子P(P)<0.05,每个外显子设置一个MJAY探针。Cacna1b转录本两个互斥外显子上方的数字表示外显子的长度,单位为bp。(C) RT-PCR检测前庭黄斑区13个随机选择的Srrm4依赖性剪接事件的组织特异性。小脑(ce)和脾脏(sp)RNA样本作为神经和非神经RNA样本进行分析。(D–E)RT-PCR检测所示基因型小鼠前庭黄斑(vm)、小脑(ce)和脾脏(sp)中(D)nPTB外显子10和(E)Rest外显子4的剪接。其余外显子4,而非nPTB外显子10,在bv/bv和bv型/+小鼠(E16.5)。
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图S6
前庭黄斑区基因表达的折叠差异bv型/+和bv/bvE16.5小鼠。(A) 微阵列数据显示,在前庭黄斑区表达增加或减少至少1.5倍的基因bv/bv老鼠与。控制(ctrl;即bv/+)室友。错误发现率(FDR)的截止值为0.15。绿色阴影表示已知受Rest调节的基因。(B)验证bv/bv和控制(ctrl;即bv/+)实时定量RT-PCR检测前庭黄斑。6个测试基因从面板A所示的列表中选择。18S rRNA用于标准化目的。
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图S7
小脑组织学和选择性剪接的评估bv/bv和bv型/+老鼠。(A) 上图:RT-PCR结果显示,小脑(ce)中Srrm4mRNA的量高于激光捕获的前庭黄斑(vm)中的Srrm4mRNA的量。下图:RT-PCR结果表明参考转录物的水平(即肌动蛋白mRNA)在两个样本中具有可比性。(B) Nissl染色的小脑矢状旁切片bv公司/+(上部面板)和bv/bv鼠标(下部面板)。左侧面板:低倍图像显示小脑叶的整体形态在bv/bv鼠标。右侧面板:高倍图像显示,细胞内分子、神经节和颗粒细胞层的整体组织完整bv/bv鼠标。比例尺:100µm。(C) 根据对来自bv/bv和bv型/+老鼠。纳入标准是,每个外显子至少有2个探针组(用括号连接)表明,4个bv型/+和4bv/bv小鼠显著。左边的点表示外显子跳跃探针组生成的数据。(D) RT-PCR实验测试面板C中显示的18个MJAY“点击”中的15个的有效性;该分析表明,这些点击是误报。未显示其余3个MJAY点击的RT-PCR结果,因为这些反应未生成PCR产物。RT-PCR引物被设计成退火到构成外显子(白盒),位于被测盒外显子的两侧(红盒)。在非盒外显子的情况下,箭头指示用于测试剪接的引物的位置。Stx转录本的两个可选外显子上方的数字表示外显子的长度,单位为bp。(E) 大鼠小脑20个外显子剪接的RT-PCR分析bv/bv和bv型/+老鼠。测试外显子是从前庭黄斑区Srrm4调节的外显子中随机选择的。
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图S8
用RT-PCR方法评价大鼠大脑皮层10个外显子的选择性剪接bv/bv和bv型/+老鼠。(A) 大鼠大脑皮层外显子内含率的RT-PCR分析bv/bv和bv型/+小鼠(P15),根据前庭黄斑区包涵率降低选择8个外显子bv/bv公司小鼠显示在RT-PCR引物被设计成退火到构成外显子(白盒),位于被测替代外显子的两侧(红盒)。(B) 大鼠大脑皮层外显子内含率的RT-PCR分析bv/bv公司和bv型/+从先前确定的Srrm4调节外显子中随机选择2个外显子的小鼠(P15)[28].
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图S9
脑组织学评估bv/bvP15上的野生型小鼠。(A) 展示用于分析+/+和bv/bv老鼠。水平线旁边的大写字母表示准备冠状切片的区域。(B–Q)左侧面板:Nissl染色冠状切片的低倍图像+/+(B–I)和bv/bv小鼠(J–Q)。标有“m”和“r”的矩形表示放大倍率较高的区域(即10×物镜)。中间面板:+/+和bv/bv鼠标代表左侧面板中显示的“m”区域。右侧面板:+/+和bv/bv代表左侧面板中所示“r”区域的老鼠。
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图S10
Srrm4的功能分析重量和Srrm4bv型在HEK293细胞和斑马鱼中。(A) 用RT-PCR检测转染小基因和蛋白编码表达载体的HEK293细胞的选择性剪接。表达载体编码Srrm4重量,序号4bv型、Srsf1或无蛋白(载体控制)。每个小基因包含一个可选外显子(红框)、相邻的内含子序列(每个约300 bp)和两端的组成外显子。显示了小基因盒的启动子和多聚腺苷化位点(pA)。RT-PCR引物(箭头)被设计为退火到构成外显子。显示了用12个小基因获得的结果。(B–C)以下各组中(B)mGFP阳性神经瘤和(C)FM1–43染色毛细胞(HC)数量的统计分析克劳丁B-mGFP转基因斑马鱼(ZF;72 hpf):未注射(对照,n = 20) ,注入zSrrm4 MO(n = 25)、zSrrm4 MO-和zSrrm 4bv型-注入(n = 9) 、Srrm4 MO-和zSrrm5重量-注入(n = 16) (单向方差分析,P(P)<0.0001,事后Bonferroni测试:*P(P)<0.01, **P(P)<0.001; NS:无显著性)。
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图S11
外显子和内含子突变对Srrm4依赖的选择性外显子纳入成熟mRNA的影响。(A)对照(WT)和突变(M)Dtna外显子11选择性剪接的RT-PCR测试。对于RT-PCR测试,从HEK293细胞中提取RNA,该细胞转染了两种Srrm4构建物(重量, +; 或空pcDNA3.1载体,−)和一个含有Dtna外显子11的小基因(对照,WT;或突变,M)。替代外显子的序列用蓝色字符突出显示;突变的核苷酸用粗体表示。微基因还包含来自德纳(B–C)选定UGC序列突变对Srrm4依赖剪接的影响。用RT-PCR检测两种Srrm4构建物(Srrm4+)转染的HEK293细胞的选择性剪接重量, +; 或空pcDNA3.1载体,−)和由外显子和内含子组成的小基因。对照(WT)微基因不包含突变,而突变微基因(M或M1-3)包含碱基替换。显示了每个编码前mRNA的相关序列片段。加粗表示碱基突变;连字符表示内含子-外显子边界;外显子包含水平以百分比表示。编码前mRNA中的G-to-A(B,C)和C-to-U(C)替换被设计用于改变选定的GC基序。(D) 位于Srrm4调节的选择性外显子上游的内含子区域的核苷酸保守性。红色柱的高度表示由PhyloP计算的脊椎动物基础保护得分[67]正数表示守恒,负值表示加速进化。下划线的GC基序包含G核苷酸,这些核苷酸被发现对Srrm4依赖性剪接很重要。
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表S1
基因组序列接近序号4野生型和bv/bv老鼠。
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表S2
外显子显示前庭黄斑区异常低的包涵率bv/bv老鼠。
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表S3
描述由Srrm4调节的mRNA编码的蛋白质的亚细胞定位和相互作用的出版物。
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表S4
用于扩增由候选基因编码的转录物的引物bv型轨迹。
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表S6
前庭黄斑区(vm)、小脑和大脑皮层替代外显子的包含率bv型/+和bv/bv小鼠百分比。
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表S7
用于RT-PCR验证微阵列数据的引物。
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致谢
我们感谢Yi Xing博士对微阵列数据分析进行了有益的讨论,Kathy Walters博士提供了激光捕获显微切割的培训,爱荷华州大学中央显微镜研究设施提供了Pixell II的访问,Mary Boes博士提供了微阵列杂交。Christine Blaumueller负责对手稿进行批判性审查,Dennis Dunnwald负责协助.
资金报表
该项目得到了NIH(R01DC010152至BB,R01GM067841至RAC,R01 DC005590至BF)、Dimes基金会(FY08-412至RAC)和爱荷华大学囊性纤维化基因治疗中心(NIH P30 DK-54759至JFE)的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
工具书类
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