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.2011年2月17日；6（2）：e16992。
doi:10.1371/journal.pone.0016992。

原肠胚形成前胚胎发育需要PTBP1

雅各布·苏卡莱 1, 奥利维娅·温玲, 吉米·马什库尔, 梅兰妮·贾格尔, 卡拉·穆斯特, 康斯坦蒂诺斯·阿纳斯塔西亚迪斯, 弗朗西斯·斯图尔特, 米歇尔·索利梅纳
附属公司

原肠胚形成前胚胎发育需要PTBP1

雅各布·苏卡莱等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

聚嘧啶结合蛋白1（PTBP1）是信使RNA的重要细胞调节因子，影响细胞的选择性剪接图谱及其mRNA的稳定性、定位和翻译。此外，它被一些病毒转移，以促进其复制。在这里，我们使用了一种新型的PTBP1敲除小鼠来分析PTBP1的组织表达模式以及在发育过程中完全去除它的影响。我们发现PTBP1在胚胎干细胞和整个胚胎发育过程中都有强烈表达，尤其是在发育中的大脑和脊髓、嗅觉和听觉系统、心脏、肝脏、肾脏、棕色脂肪和软骨原基中。这种广泛分布表明PTBP1在胚胎发育过程中发挥作用。经PCR和免疫荧光鉴定的纯合子后代能够植入，但生长受阻或迟缓。在胚胎发育第7.5天（E7.5），空突变体大约比对照窝友小5倍，并且随着时间的推移，身体尺寸的差距扩大。在妊娠中期，所有纯合子胚胎都被吸收/降解。在E12和断奶年龄时未对纯合子小鼠进行基因分型。缺乏PTBP1的胚胎没有分化为3个胚层和外胚层空化，这是原肠胚形成的标志。此外，纯合子突变体显示出畸形的外胎盘锥体和卵黄囊，这两种都是胚胎本身的早期支持结构。我们的结论是，PTBP1在受精卵最早的等体积分裂和分化步骤中并不需要，直到胚泡形成。然而，进一步的植入后发育需要PTBP1和纯合性缺失动物的停滞期，这些动物的表型大大缩小，胚胎和胚外结构也发生了畸变。

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数字

图1
图1。含有新型多用途鼠标的一代PTBP1型等位基因。
我们生成了一个多用途PTBP1型等位基因并将其靶向小鼠。A） 野生型基因座（蓝色）通过在胚胎干细胞中插入停止/检测盒（红色）进行修改。可以使用FLP重组酶结构或菌株翻转盒带。此外，外显子3至7已被构建成loxP位点，用于Cre重组酶的条件删除。该图显示了南方策略以及用于验证构建和基因分型的引物的位置。B） 显示了长程PCR的结果，以验证靶向载体与野生型同源重组产生的5′连接PTBP1型轨迹。C） Southern blot验证突变等位基因中的正确3′连接。
图2
图2。PTBP1型在胚胎发育过程中表达。
图1所示的LacZ报告器在这里用作PTBP1型杂合胚胎干细胞（ESCs）和不同发育阶段胚胎中的启动子活性。PTBP1型ESCs高表达。受精后6.5天的胚胎（E6.5），PTBP1型尤其在外胚层表达，但也在胚胎周围的内脏内胚层表达。E7.5的表达模式相似，其中母体的激活PTBP1型可见于胚胎尖端周围的蜕膜。野生型（wt）窝鼠（小入口）未观察到LacZ染色。在E8.5几乎所有细胞和E9的大多数细胞中都表达报告基因，而只有未来头部顶部、心脏原始心室和尾部的一些结构似乎很少或没有表达PTBP1型在E12.5胚胎中，大多数发育中的组织和器官表达了报告者的观点，最显著的是位于脑室、脊髓、垂体和心脏的细胞。E16.5胚胎中的类似器官也被染色，此外还有鼻腔、内耳和胚胎背面的棕色脂肪垫。PTBP1型在腹肋软骨中较高，但在已经显示中央腔的背肋骨中较低。虽然在E12.5时没有非特异性染色，但在E16.5时肠道和胃显示出X-gal信号，这不是由于PTBP1型记者。信号来自内源性β-半乳糖苷酶。E12和E16处的完整LacZ见图S3。
图3
图3。胚胎来自PTBP1型KO杂合子父母可分为两种大小类型。
对2窝幼崽的苏木精和伊红染色蜕膜切片进行表面积和结构组织分析。胚胎按发育阶段分组（左），发育最远的胚胎已达到神经板阶段，但大多数胚胎处于原始条纹阶段。用斐济图像软件测量中间部分胚胎的表面积，并根据大小排序，结果相当于阶段（右）。假定的敲除物（红色）明显小于野生型或杂合对照，并且呈现出大致为3∶10的孟德尔比率（比率0.3比预期的0.25）。小胚胎的大小甚至可能被高估了，因为在这些植入物中很难识别胚胎。我们还发现2个蜕膜没有可见的胚胎结构。
图4
图4。PTBP1基因敲除胚胎植入，但严重生长迟缓。
通过PCR和免疫荧光鉴定杂合杂交的小类胚胎为PTBP1基因敲除胚胎。A） 用于停止盒和PTBP1型内含子2在琼脂糖凝胶上分离，并进行盲法评分。五分之五的小胚胎被基因分型为纯合子。由于内含子PCR效率较低，15/17个大型对照胚胎被分为杂合型或野生型，有2个假阴性。B） E7.5胚胎的连续石蜡切片用苏木精和伊红染色（左柱）或用DAPI（中柱）和PTBP1抗体标记（右柱）。顶行显示了一个大胚胎（斜切面），胚胎本身和周围组织的核PTBP1染色很强（虚线）。这两个小胚胎的特征都是缺乏核PTBP1信号，而周围的细胞（很可能是母细胞）中显示核PTBP1。解释图和胚胎切片面积的量化显示在右侧。
图5
图5。PTBP1基因缺失的胚胎显示卵黄囊和胎盘发育缺陷。
该图比较了敲除胚胎和对照胚胎中的卵黄囊和胎盘结构。A） 一个E5.5野生型胚胎的苏木精和伊红染色石蜡切片，其大小与空白突变体相当，一个E7.5卵黄囊（左）分别与突变体E7.5胚胎和突变体卵黄囊并列（右）。突变体在这个阶段缺乏正常胚胎的典型结构。如果完全可以辨认的话，它们缺乏一个典型的卵黄囊，在靠近滋养层巨细胞和蜕膜的地方有一层薄的Reichert膜。B） 对照E7.5胚胎切片上胶原蛋白4的免疫荧光显示在纯合子胚胎的类似图像旁边。对照胚胎显示来自几个基底膜的胶原蛋白4信号，包括卵黄囊的Reichert膜。另一方面，空突变体显示出高胶原蛋白4的异常延伸区域，不像膜。胶原免疫显微镜的单独通道如图S4所示。
图6
图6。删除PTBP1型导致缺少T/支流.
该图比较了正常胚胎和突变胚胎的RT-PCR结果，以确定是否存在原肠胚形成标记和对照。从大（L）和小（S）胚胎中纯化的RNA用作模板，用于原始条纹标记的逆转录酶（RT）PCR扩增T/支流以及LacZ对照以确保成功的RNA纯化。小PTBP1 KO纯合子胚胎均未出现T mRNA，而对照RT-PCR呈阳性。
图7
图7。PTBP1在正常和突变胚胎中的表达。
比较E7.5时对照和PTBP1 KO胚胎中PTBP1及其副产物PTBP2的免疫荧光。顶行显示了一个正常大小的对照胚胎的连续冰冻切片，其中PTBP1（左）和PTBP2（右）被染色。PTBP1在大多数胚胎细胞中表达，尤其是内脏内胚层和外胚层，与图2中的LacZ报告染色相比较。蜕膜核内也观察到较强的PTBP1信号。对照组PTBP2主要在外胚层表达，在大多数蜕膜细胞核中不表达。PTBP1空胚（底部）未显示PTBP1或PTBP2信号，此处显示与DAPI信号合并以显示胚胎（虚线）。胚胎周围的大多数细胞再次显示出核PTBP1信号，而只有极少数细胞显示出弱核PTBP2信号（箭头所示）。
图8
图8。突变胚胎中的细胞分裂和凋亡。
图中显示了E7.5免疫标记的BrdU对照组和Ptbp1空白胚胎切片（顶行），并由TUNEL处理（底行）。前者是一种细胞分裂分析，用于测量核苷酸类似物溴脱氧尿苷（BrdU）的整合。后者是基于末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）的凋亡检测。对照胚胎（1标准柱）显示出强烈的BrdU信号，尤其是在外胚层、卵黄囊区和外胎盘锥体，而TUNEL为阴性。杂合蜕膜通常在外周被BrdU标记最强烈，仅在KO中可见1并在控制中裁剪1和KO2纯合子突变胚胎较少（KO1)至无BrdU标记（KO2)随胚胎和切片的不同而变化。大多数分析的空突变体显示出一定程度的TUNEL（以KO为例三和KO4). 胚胎的最长直径显示在每个面板下方，面板的相对尺寸用虚线表示。
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