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.2009年5月13日；29(19):6296-307.
doi:10.1523/JNEUROSCI.5943-08.2009。

神经分泌表型的其余抑制由BHC80负调控，BHC80是BRAF/HDAC复合物的蛋白

安德里贾纳·卡拉金 1, 卡梅洛·费莱, 劳拉·斯图奇, 伊利亚·普拉达, 保拉·波迪尼, 塔达希·巴巴, 马里亚诺·罗奇, 雅各波·梅尔多莱西, 罗莎尔巴·达莱斯桑德罗
附属公司

神经分泌表型的其余抑制由BHC80负调控，BHC80是BRAF/HDAC复合物的蛋白

安德里贾纳·卡拉金等。 神经科学. .

摘要

神经细胞表达神经分泌需要转录抑制因子-1沉默转录因子（REST）的水平非常低。然而，当神经分泌缺陷的PC12细胞的高REST克隆与其他高REST、非神经分泌细胞融合时，一些神经分泌被恢复。为了阐明这种恢复的机制，我们将缺陷PC12细胞与人类淋巴细胞融合。细胞遗传学分析显示，所有恢复神经分泌的杂交克隆都包含11号染色体的一个片段，包括编码BHC80的基因，BHC80是一种介导REST抑制的复合物蛋白。在这些克隆中，REST水平与缺陷PC12中的水平一样高，而位于细胞核中的BHC80则高出4-5倍。用不同数量的BHC80 cDNA瞬时转染缺陷PC12诱导（1）缺陷PC12，仅神经分泌mRNA的再表达；（2） 在与REST阴性结构DNA-结合域共同转染的缺陷PC12中，恢复微弱但完整的神经分泌表型，包括致密核颗粒及其调节的胞吐。染色质免疫沉淀和免疫耗竭分析显示，BHC80与两种神经分泌蛋白（嗜铬粒蛋白B和SNAP25）基因上的REST有广泛的关联，但仅在低REST PC12中，而在高REST缺陷PC12中没有明显的关联。在转染BHC80的缺陷PC12中，重新建立了一些关联。因此，融合/转染缺陷PC12后观察到的神经分泌恢复取决于BHC80和REST的相互作用水平，BHC80是REST抑制的负调节剂。这种作用可能具有细胞生理和病理重要性。

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数字

图1。
图1。
神经分泌标记物和DCV样细胞器在缺陷PC12/h淋巴细胞杂种中的表达。A–F共聚焦免疫荧光显示DAPI染色的wt PC12中两个神经分泌标记ChgB和Syt1的表达(A类,D类)，有缺陷的PC12-Trk(B类,电子)和神经分泌标记阳性的PC12-Trk/h-淋巴细胞杂交克隆F5c(C类,F类).克，两个相邻的wt PC12细胞的超微结构显示大量DCV（箭头）优先沿着质膜轮廓排列（箭头）；H（H）F5c克隆杂种细胞的高尔基体区（GC），相邻细胞质中聚集着几个密度不同的DCV样细胞器（箭头）。我,J型、F5c杂交克隆细胞中不同密度的离散DCV样囊泡（箭头）的抗鼠ChgB和抗Syt1免疫金标记。注意，分泌蛋白ChgB的金颗粒集中在高尔基体区两个小泡的核心，而膜蛋白Syt1的金颗粒则主要排列在内质网（ER）池包围的小泡周围。比例尺：（英寸B类)A–F，10微米；（英寸H（H）)H（H）,克0.30微米；（英寸J型)J型,我0.15微米。
图2。
图2。
中期FISH和BAC分析。A类,B类分别用阳性杂交F5c克隆DNA中的Alu-PCR产物作为探针，对一只大鼠和一只人类中期进行杂交。箭头在A类表示杂交克隆中存在的h染色体片段B类指向人类中期的11号染色体。C类总结了10个克隆的FISH结果，6个神经分泌标记阳性，4个阴性。请注意，所有阳性克隆都显示了h染色体11短臂的着丝粒周围片段（如箭头所示B类; 以粗体显示C类)缺少所有阴性克隆。D类,电子，利用11号染色体着丝粒周围片段中的两个BAC定位，两个中期杂交（箭头；插图中放大）。F类列出了最相关的阳性（粗体和下划线）和阴性BAC，用于界定标记阳性杂种中保留的染色体11p片段（用红色标记）。
图3。
图3。
BHC80基因的表达和蛋白质在wt和缺陷PC12、PC12-Trk/h-淋巴细胞杂种和其他细胞类型中的分布。A类显示了两个缺陷PC12克隆（PC12-27和PC12-TrkA）中REST mRNA相对于wt PC12的更高水平，以及阳性杂交克隆PC12-Trk/h-淋巴细胞F5c中REST高水平的持续存在；B类BHC80 mRNA水平，wt PC12高于缺陷PC12-Trk和阴性杂交克隆G4c，阳性克隆F5c高于缺陷克隆40%；C类PCR扩增h-BHC80 cDNA片段，证明h-BHC80mRNA在阳性杂交克隆F5c中表达，而在wt PC12、缺陷PC12-Trk和阴性克隆G4c中不表达。D类,电子显示BHC80蛋白在各种细胞类型中的表达，在wt PC12和另一种神经分泌细胞系胰岛素释放INS-1E系中以较小的剪接形式BHC80–4为主(D类); 以及较大形式的BHC80–6在两个有缺陷的PC12–27和PC12 Trk中的优势(D类). 在两个阳性杂交克隆F5c和F4a中(电子)，主要形式也是BHC80-6，其水平明显高于来源细胞、PC12-Trk和人类淋巴细胞（淋巴）（分别为4-5倍和10倍以上）。另一种非神经分泌细胞系，肌肉L6(D类)，也显示BHC80–6，但其水平远低于PC12克隆的水平。BHC80总水平的相对定量，显示在D类,电子，是至少三个实验的平均值。F类显示亚细胞分馏结果，证明在wt和缺陷PC12中，BHC80与组蛋白H2B一起定位在细胞核中，而不是与β-微管蛋白（β-tub）一起定位在细胞质中。用DAPI标记的BHC80-6在PC12-27细胞核中的定位也被免疫荧光证实(克). 比例尺，（in克)3微米。
图4。
图4。
转染后BHC80在缺陷PC12-27中的表达。A类在转染的PC12–27/DBD细胞中，BHC80–4水平的增加取决于cDNA的使用量：0.07μg转染的细胞中不明显，0.4μg几乎不明显，4μg明显可见。在所有转染细胞中，REST水平保持不变。B类PC12–27和PC12–27/DBD细胞中转染的h-BHC80–4标记物的水平，由抗标记抗体单独显示（左），以及由抗BHC80抗体显示的内源性BHC80-6水平（右）。在后者中注意到，内源性和转染的BHC80的水平大致相同。C类,D类，转染的BHC80-4标记定位于细胞核中（与内源性BHC80-6一起，图3F类,克)亚细胞分馏结果表明C类通过免疫荧光D类（DAPI标记的细胞核）显示同一单层的两个PC12–27/DBD细胞，只有一个（左下）转染，另一个（右上）BHC80–4标记为阴性。结果，如C类,D类也通过转染PC12-27获得（数据未显示）。所示的定量结果是至少三个实验的平均值±标准偏差。比例尺，（inC类)3微米。
图5。
图5。
与h-BHC80-4-flag和GFP的cDNA共转染的PC12-27和PC12-27/DBD细胞中神经分泌标记物的恢复。A类,B类、与h-BHC80-4-flag和GFP cDNA（各4μg）共转染并经FACS富集的PC12-27和PC12-27/DBD细胞制备过程中神经分泌基因mRNA的增加。在PC12–27中(A类)转染的效果在基因之间是可变的。面板中显示的显著增加的mRNA是由对REST不太敏感的基因编码的。其他mRNA的轻微增加未显示。在PC12–27/DBD细胞中(B类)，通过转染BHC80–4-flag/GFP，所研究的神经分泌mRNA均显著增加（从0.5倍增加到10倍）。仅GFP无效（数据未显示）。C类,D类，显著增加（如C类并通过D类)通过BHC80转染PC12–27/DBD细胞也在蛋白质水平上诱导。请注意，即使是未转染细胞中微不足道的ChgB，也达到了很小但很容易检测到的水平(C类,D类)，足以通过免疫荧光显示为离散的细胞质斑点，在未转染的中不明显(Ea公司)在BHC80–4鞭毛阳性细胞中非常明显，细胞核被DAPI标记(欧洲银行).F类用BHC80 cDNA转染PC12-27/DBD细胞后，两种神经分泌标记物SNAP25和ChgB表达的差异依赖性。SNAP25，在未转染的PC12–27/DBD细胞中已经明显存在（另见C类,D类)在转染0.4μg cDNA的细胞中已加倍，在4μg时进一步增加；ChgB仅在转染4μg cDNA的细胞中明显可见。所示的定量结果是至少三个实验±SD的平均值A类,B类,D类是由于结果的高度一致性造成的。比例尺：（inEa公司)Ea公司,欧洲银行，3微米。
图6。
图6。
ChIP显示，在wt和缺陷PC12细胞克隆中，REST和BHC80与RE-1基因相互作用。A类指wt PC12并显示更改B和按扣25基因ChIP结果。注意，抗REST和抗BHC80的免疫沉淀诱导了这两个基因的大量富集（19.3倍和23.5倍更改B基因；9.6倍和14倍国民账户体系25基因），远高于用对照抗体、抗uPAR获得的抗体。A类对，另一个基因的无关区域，即NSE公司三个Abs。B类、ChIP结果更改B和按扣25缺陷PC12-27细胞的基因。注意，抗REST诱导了这两个基因的大量富集（72.3倍和43.5倍），而抗BHC80未能诱导任何明显的沉淀，证明这两个因子在更改B和国民账户体系25基因。对照Ab anti-uPAR与NSE无关区(B类)没有明显的降水。C类比较BHC80 ChIP结果ChgB公司和按扣25来自wt和缺陷PC12的基因，以及从瞬时转染BHC80的缺陷PC12细胞中获得的基因。注意，BHC80转染在PC12-27和PC12-27/DBD细胞中诱导了与这两个基因相关的BHC80的显著富集，相反，两者之间没有显著差异。BHC80转染细胞获得的完整ChIP和免疫缺失结果如补充图2和3所示，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料。
图7。
图7。
转染BHC80的PC12-27/DBD细胞通过调节性胞吐发生ChgB释放。在A类在4个6 cm培养皿中瞬时转染BHC80（4μg cDNA）的wt PC12和PC12–27/DBD细胞单层在37°C下与环己酰亚胺（20μg/ml）平行培养6 h，以阻止蛋白质合成，而不施加任何刺激。在指定的时间点，去除单个培养皿，将单层膜溶解并通过Western blotting进行处理。通过定量特定带确定ChgB的数量。请注意，在这些静息状态下，wt和PC12–27/DBD/BHC80细胞的ChgB水平（表示为0时间wt PC12水平的百分比）在培养过程中保持不变，即，两个细胞单层中没有明显的成分释放。所示数据是三个实验±SD的平均值。B类，在KRH缓冲液中悬浮wt PC12和暂时转染BHC80的PC12–27/DBD细胞，如上所述，仅在添加溶剂（DMSO，1.5μl）或含有Ca的溶剂后培养15分钟2+离子载体，离子霉素（2μ米). 注意到在两种细胞悬浮液中，药物诱导的ChgB大量减少，这是一种调节释放反应。所示数据以暴露于二甲基亚砜的样品百分比表示，是三个实验±SD的平均值。C类,D类，两个PC12–27/DBD/BHC80单层细胞的ChgB表面免疫标记，一个暴露于二甲基亚砜(C类)另一种是离子霉素B类然而，持续2分钟(D类). 请注意，受刺激细胞沿其表面（箭头）显示出清晰的标签，而静止细胞几乎完全为表面阴性。比例尺：（inC类)C类,D类，3微米。
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