CD40在动脉损伤后TRAF蛋白和NF-KappaB依赖性炎症前基因表达上调中的作用

摘要

介绍

CD40/CD40L系统与一些心血管疾病有关，如动脉粥样硬化、缺血性心脏病和中风[1],[2]越来越多的证据表明，CD40信号主要通过肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs）介导[3],[4]TRAFs是TNF/白细胞介素-1/类Toll受体超家族的细胞质衔接蛋白。该家族的配体包含多种促炎细胞因子，如CD40L、TNF-α和白细胞介素-1β。TRAF作为连接CD40和下游信号通路的适配器分子。不同的TRAF具有特定的生物学功能[5]–[7]单个TRAF在激活不同CD40依赖信号通路中的作用尚未完全确定[7]确定这些作用的重要性和相互作用将有助于更全面地理解CD40介导的免疫系统激活的重要机制，并将揭示开发治疗剂的新靶点[7].

CD40的细胞质域包含2个独立的膜TRAF结合域：一个近端区域结合TRAF6，一个独特的远端区域结合TRAF-1/2/3/5[4]CD40-TRAFs信号转导级联是多重复杂的。不同的TRAF与CD40结合可触发不同的信号通路，导致不同的功能结果，这取决于所涉及的细胞类型[8]例如，在单核细胞和巨噬细胞中，TRAF6是通过NF-κB和Src/ERK1/2通路激活CD40激活的促炎途径的重要介质[9]而在内皮细胞中，炎症主要通过CD40-TRAF2相互作用介导[10]然而，目前还没有关于体外证明的这种CD40介导的促炎机制是否也在体内对血管损伤起反应的数据。

虽然CD40L在动脉粥样硬化形成中的关键作用已被广泛证实[1],[3],[11],[12]，只有少数报告研究了血管损伤背景下CD40-TRAF依赖性功能。Miyahara等人[13]据报道，在兔颈动脉支架植入模型中，TRAF6主要参与炎症反应和支架内病变形成过程。最近，Donners等人[14]据报道，在小鼠颈动脉结扎模型中，骨髓衍生细胞中的CD40-TRAF6在新生内膜形成和动脉重塑中起主导作用。然而，有明确证据表明，在小鼠颈动脉结扎模型中，骨髓源性细胞对新生内膜形成的作用相当有限。

在本研究中，我们研究了CD40在血管损伤反应中调节其适配器蛋白TRAFs和NF-kB依赖性促炎基因的作用。众所周知，新生内膜的形成可能因损伤类型的不同而有显著差异[14],[15]此外，相同基因（如CD40L、整合素β3）的缺失可能对不同损伤模型中新生内膜的形成产生不同甚至相反的影响[15],[16]因此，必须确定CD40介导的对新生组织形成的影响是否具有模型特异性。因此，我们使用两种不同的损伤模型，即导丝诱导的股动脉剥脱和颈动脉结扎，检测并比较了CD40缺乏对新生内膜形成和动脉重塑的影响。

方法

结果

CD40缺乏抑制TRAF上调对血管损伤的反应

CD40及其衔接蛋白TRAF在颈动脉结扎后形成的动脉粥样硬化斑块和发展中的新生内膜病变（28天）中过度表达[14],[23]使用免疫组织化学方法，我们检测了颈动脉结扎后不同时间点动脉壁CD40和TRAFs的表达模式和变化。我们的数据显示，WT小鼠早期（3d，7d）和晚期（21d）CD40表达均显著增加(图1A)CD40的增加伴随着TRAFs的平行增加，包括TRAF6(图1C)和TRAF1/2/3/5(图S2). 实时RT-PCR测定的mRNA水平证实了损伤动脉壁中CD40的表达增加(图1B). 相反，在损伤后的所有时间点，CD40缺陷小鼠中所有TRAF的损伤诱导表达几乎完全消失。我们的数据首次表明，CD40对TRAF蛋白上调对血管损伤的反应至关重要。

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图1

结扎损伤后颈动脉壁CD40和TRAFs的表达。

(A类)WT和CD40颈动脉CD40免疫染色的代表性图像^−/−小鼠（n = 每组5人）。比例尺：20µm或100µm。(B类)WT颈动脉CD40表达的定量RT-PCR分析（n = 每组5人）。mRNA水平标准化为GAPDH。数据表示为平均值±SEM。* P（P）<0.05和** P（P）与未受伤（未受伤）对照组相比，<0.01。(C类)WT和CD40颈动脉TRAF6免疫染色的代表性图像^−/−小鼠（n = 每组5人）。比例尺：20µm。箭头表示内部弹性层。

CD40缺乏抑制促炎基因表达和白细胞募集

循环白细胞向受损动脉壁的募集被证明是第一步，在血管炎症反应和新生内膜形成中起着关键作用[24]以前的数据表明，CD40缺乏减少了炎症细胞的浸润，包括CD45+总白细胞和CD3+T细胞在发育（28天）的新生内膜病变中的浸润[14]但其潜在机制基本上仍不清楚。在本研究中，我们通过免疫组织化学检测了CD40缺乏在不同时间点对白细胞募集的影响，并探讨了相关的分子机制。

在野生型小鼠中，颈动脉损伤后第3天中性粒细胞浸润显著增加，在外膜和管腔表面明显可见，但在中层中等(图2). 然而，损伤后7天，中性粒细胞浸润在培养基中变得非常明显(图2A). Mac-2+单核细胞/巨噬细胞在3天时受到限制（数据未显示），但在培养基（7天）和发育中的新生内膜（21天）中变得明显(图2B). 在CD40中^−/−在颈动脉结扎后的所有指定时间点，缺乏CD40的小鼠显著减少了浸润的中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞的数量(图2). 此外，我们观察到，在CD40缺乏小鼠中，巯基乙酸诱导的腹膜炎模型中的中性粒细胞募集受损(图2C). CD40损伤血管壁和腹腔白细胞募集减少^−/−小鼠并不是因为血白细胞水平较低，因为完整的血细胞计数结果显示CD40之间的总白细胞水平或特定白细胞亚型没有可检测的差异^−/−和WT小鼠(表S1).

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图2

CD40缺乏抑制结扎损伤后白细胞向颈动脉壁的募集，以及巯基乙酸诱导的腹膜白细胞募集。

中性粒细胞（抗PMN单克隆抗体）免疫染色的代表性图像(A类)以及Mac-2阳性单核细胞/巨噬细胞(B类)来自WT和CD40的颈动脉^−/−小鼠（n = 每组5人）。阳性染色细胞的定量如方法箭头表示内部弹性薄板。比例尺：20µm。数据表示为平均值±SEM。** P（P）与相应的WT相比，<0.01(C类)在CD40缺乏小鼠中，巯基乙酸诱导的腹膜炎模型中的中性粒细胞募集受损。用2ml 3%巯基乙酸盐或同等体积的等渗盐水对小鼠进行腹腔注射。5小时后，中性粒细胞总数（×10⁶)腹腔内计数。n个 = 5只小鼠/组。

为了阐明CD40介导的白细胞募集效应的分子机制，我们检测了结扎颈动脉中促炎基因的表达。免疫组织化学染色显示，野生型小鼠损伤后3天和7天，粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）和趋化因子MCP-1的表达显著增加(图3，A到C)但CD40中所有这些促炎介质的增加均被明显阻断^−/−所有时间点的老鼠(图3，A到C). 与免疫染色结果一致，实时RT-PCR分析证实，与损伤后3天和7天的WT动脉相比，CD40阴性颈动脉中ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的mRNA表达显著降低(图3D). 此外，实时RT-PCR分析表明，损伤后3天和7天，WT颈动脉中促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-6和IL-1β）的mRNA水平显著升高，而CD40的mRNA则显著降低^−/−老鼠(图3D). 已知这些细胞因子能在体内外有效刺激血管细胞和白细胞中各种粘附分子和趋化因子的表达[25]CD40−/−小鼠的血浆MCP-1和可溶性VCAM-1水平低于WT对照组，但未达到统计学意义(图S5).

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图3

CD40缺乏抑制结扎损伤后颈动脉壁促炎介质的表达。

颈动脉ICAM-1免疫染色的代表性横断面(A类)，VCAM-1(B类)和MCP-1(C类)以及它们的定量分析，在WT和CD40中^−/−小鼠（n = 每组5人）。箭头表示内部弹性层。比例尺：20µm。数据表示为平均值±SEM。** P（P）<0.01与相应的WT(D类)定量RT-PCR分析WT和CD40中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达^−/−WT和CD40的颈动脉^−/−小鼠（n = 每组5人）。mRNA水平标准化为GAPDH。数据表示为平均值±SEM。* P（P）<0.05和** P（P）<0.01与相应的WT。

CD40缺乏抑制血管损伤和白细胞对动脉壁NF-κB活化的反应

体外数据显示，CD40-TRAF相互作用触发NF-κB的激活，NF-κB是一种调节许多不同促炎基因表达的主要转录因子[26],[27]包括我们上面检测的那些基因。然而，没有体内数据表明CD40在血管损伤后是否/如何通过NF-kB依赖机制介导血管炎症。我们通过对受损颈动脉中总NF-kB p65及其磷酸化p65活化形式的免疫染色来检测NF-kB的活化。在野生型小鼠中，颈动脉结扎后第3天和第7天，p65和磷p65的免疫染色均显著增加(图4，A和B)，发现与以前的研究基本一致[28]–[30]在CD40中^−/−小鼠，在这两个时间点，损伤诱导的p65和磷p65的上调受到了很大程度的抑制(图4，A和B).

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图4

CD40缺乏抑制结扎损伤后颈动脉壁NF-κB的活化。

颈动脉总NF-κB p65免疫染色的代表性横断面(A类)和活化磷-65（Ser536）(B类)以及它们的定量分析，在WT和CD40中^−/−小鼠（n = 每组5人）。箭头表示内部弹性层。比例尺：20µm。数据表示为平均值±SEM。** P（P）<0.01与相应的WT。

因为以前的数据表明，白细胞CD40在颈动脉结扎后新生内膜的形成中起主要作用[14]，我们进一步研究了CD40L诱导白细胞NF-κB通路激活是否需要CD40。细胞质NF-κB p65转位到细胞核是激活NFκB途径的关键步骤[26],[27]通过免疫荧光染色，我们证明CD40L刺激可诱导野生型中性粒细胞NF-kB p65从细胞质向细胞核移位，但在CD40缺乏的中性粒细胞中，这种作用受到很大抑制(图5).

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图5

CD40是CD40L诱导的中性粒细胞NF-κB通路活化所必需的。

(A类)用免疫荧光染色法检测野生型和CD40L（1.0µg/ml）暴露1h后CD40缺陷中性粒细胞中NF-κB p65（绿色）的核转位情况。用DAPI（蓝色）检测细胞核。比例尺：50µm。(B类)NF-κB核转位被评估并量化为p65核阳性染色细胞占总细胞的百分比。从三个独立的实验中也得到了类似的结果。数据表示为平均值±SEM。** P（P）<0.01与WT。

总之，我们的数据提供了第一个直接的体内证据，证明CD40可能通过激活NF-kB依赖机制在介导促炎基因表达和白细胞浸润中发挥关键作用。

CD40缺乏减少两种不同损伤模型中新生内膜的形成

由于新生内膜的形成可能因血管损伤的性质而异，我们使用两种不同的损伤模型检查并比较了CD40缺乏对新生内膜形成和动脉重塑的影响。在颈动脉结扎模型中，我们的结果重现了之前的观察结果[14]与野生型小鼠相比，CD40的新生内膜大小和内膜/中层比率显著降低^−/−小鼠，管腔狭窄显著减少(图S3). 与公布数据一致[14]，我们显示CD40^−/−小鼠颈动脉结扎后出现动脉重构受损，即CD40的总血管尺寸^−/−小鼠明显小于野生型小鼠(图S4A). 这不能用颈动脉几何形状的差异来解释，因为两种基因型之间的未受损颈动脉在管腔面积、中层面积和总血管面积方面没有差异(图S4B).

钢丝剥蚀损伤可在股动脉中诱导显著的新生内膜形成，尽管不同实验室的新生内膜损伤程度往往不同。我们研究中显示的C57BL/6背景下WT小鼠新生内膜形成的程度与其他实验室报告的相似[31],[32]在该模型中，我们证明CD40−/-小鼠的新生内膜大小、内膜/中层比率和管腔狭窄显著降低(图6)结果与颈动脉结扎模型的结果一致。值得注意的是，与颈动脉结扎模型不同，CD40中的血管重塑没有受损^−/−在股动脉剥脱后，小鼠与野生型小鼠相比，即两种小鼠的总血管尺寸相似(图S4A). 此外，两种基因型之间未受损股动脉的血管几何形状没有差异(图S4C).

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图6

CD40股动脉穿刺后新生内膜形成减少和管腔狭窄^−/−老鼠。

(A类)WT和CD40损伤21天后股动脉的典型弹性染色切片（3级）^−/−鼠标（左侧面板）。股动脉导丝损伤和组织切片示意图（右图）。箭头表示内部弹性层。比例尺：50µm。(B类)在7个横截面水平（120-µm间隔）测量内膜，并计算其平均内膜面积。Intima/media比率(C类)和管腔狭窄率(D类)在每个水平上以及它们的平均比率被确定。n个 = 每组10只小鼠。数据表示为平均值±SEM。* P（P）<0.05和** P（P）<0.01与相应的WT。

讨论

本研究阐明了参与血管损伤反应的CD40信号的细胞/分子机制：CD40及其适配器TRAF蛋白的表达增加，NF-kB依赖的促炎途径激活。我们观察到，CD40缺乏严重抑制TRAF蛋白的表达和NF-kB的激活，NF-kB涉及损伤动脉壁中促炎细胞因子和粘附分子的基因表达，因此，CD40信号通路在体内介导炎症反应和白细胞募集中起着关键作用。该结果也坚定地确立了CD40在两种不同血管损伤模型中新生内膜形成中的功能作用。

CD40和TRAFs（-1，-2，-3，-5，-6）在小鼠和人类动脉粥样硬化病变中过度表达[23],[33]有关于CD40在动脉粥样硬化形成中的作用的有意义的报道。虽然CD40的全部缺失并没有限制LDLr的动脉粥样硬化形成^−/−CD40型^−/−老鼠[34]CD40的全部缺失显著限制了载脂蛋白E的动脉粥样硬化形成^−/−CD40型^−/−老鼠[35]目前尚不清楚造成这种差异的确切原因。在血管损伤后发生的新生内膜病变中也观察到CD40和包括TRAF6在内的几个TRAF的表达增加[14]体外数据显示，CD40L和其他促炎细胞因子在内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞中对TRAF的调节不同[23]例如，CD40L结扎CD40可增强内皮细胞中TRAF-1、-2、-3和6的表达，但不增强TRAF-5的表达。IL-1β或TNF-α刺激可诱导内皮细胞和平滑肌细胞中TRAF-1、-3和-6的表达，而两种刺激均不影响TRAF-2或-5的表达[23]然而，CD40和TRAF在体内受损动脉壁中如何上调尚不清楚。在本研究中，我们使用CD40缺陷小鼠来确定颈动脉结扎后不同时间点损伤诱导TRAF表达是否需要CD40。我们观察到，CD40的缺失几乎完全消除了TRAF的诱导，表明CD40在血管损伤后TRAF蛋白的上调中起着重要作用。

据报道，不同的TRAF对动脉粥样硬化的发展有不同的贡献。Lutgens等人[32]据报道，白细胞中CD40-TRAF6信号缺失可预防载脂蛋白E基因敲除小鼠的动脉粥样硬化。相比之下，Stachon等人[36]据报道，TRAF6缺乏不会影响LDLR−/−小鼠的动脉粥样硬化形成。Missiou等人[37],[38]据报道，TRAF5缺乏会加速LDLR−/−小鼠的动脉粥样硬化形成，而TRAF1缺乏则会减弱其动脉粥样硬化形成。最近，Donners等人[14]表明骨髓源性白细胞CD40在颈动脉结扎后新生内膜形成中起主导作用，但非造血细胞（血管壁细胞）表达的CD40的作用未在本研究中检测到。

新的证据表明，TRAF信号的许多生物学效应似乎是通过转录因子NF-κB的激活介导的[7],[39]NF-κB在调节参与动脉粥样硬化和血管损伤后新生内膜形成的许多细胞因子和粘附分子的表达中起着关键作用。大鼠和小鼠动脉损伤后血管壁中NF-κB的激活已被多项报告证实，并与NF-κ的B依赖性促炎基因（如VCAM-1和MCP-1）的诱导表达相关[40]–[42]IκBα过度表达抑制损伤动脉中NF-κB活性[41]阻断IKKβ[42]或使用NF-κB诱饵[43]抑制血管炎症反应和新生内膜形成。然而，据我们所知，没有体内研究证明CD40在受伤/患病动脉中调节NF-kB活化和NF-kB-依赖性基因表达的作用。本研究观察到损伤后早期（3，7d）颈动脉壁NF-κB的强烈激活，伴随着细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、趋化因子MCP-1和粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）的表达增加，以及中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞的大量募集。在体外，目前的数据证实CD40缺乏抑制了CD40L诱导的中性粒细胞NF-kB核转位。值得注意的是，在CD40−/-小鼠中，NF-kB的激活和所有这些基因的表达增加以及白细胞募集都受到明显抑制。

促炎细胞因子、TNF-α、IL-1β和IL-6在介导黏附分子表达和免疫细胞激活中起着关键作用[24],[44]ICAM-1和VCAM-1是免疫球蛋白家族的粘附分子，负责白细胞的牢固阻滞和迁移到炎症部位[45]MCP-1是一种关键的趋化因子，可刺激病变血管中单核细胞的粘附和积聚[44]所有这些促炎介质都参与了血管损伤后新生内膜的形成过程[24]抑制细胞因子或粘附分子可减少血管损伤后新生内膜的形成[46],[47]因此，我们得出结论，CD40缺乏通过下调NF-κB的激活和NF-kB依赖性上调受损动脉壁中的多个促炎基因来减少白细胞募集和新生内膜的形成。

颈动脉结扎模型和股动脉钢丝剥脱模型被广泛用于研究血管损伤后新生内膜形成的病理生理学。在结扎模型中，动脉内皮、内部弹性层（IEL）和外部弹性层（EEL）通常是完整的(图S1B,S3A系列). 在导线损伤模型中，动脉内皮被去除(图S1A)，包括IEL在内的中间层部分受损，但EEL通常完好无损(图6A). 两种模型的新生内膜病变成分包括SMC样细胞、浸润白细胞和细胞外基质。但是，病变的确切细胞成分在不同模型之间可能存在显著差异[17],[18],[48]众所周知，新生内膜的形成可能因血管损伤的类型而异[16],[17]例如，整合素β3的基因缺失显著减少了颈动脉结扎后新生内膜的形成，但增加了股动脉钢丝损伤后新生内膜形成[16]同样，CD40L基因缺失显著增加颈动脉环损伤后新生内膜的形成[15]但颈动脉结扎后新生内膜形成减少[14]因此，利用不同的血管损伤模型确定CD40在新生内膜形成中的作用尤为重要。越来越多的证据表明，CD40L介导的效应不一定与CD40介导的作用相同[8]这是因为CD40不是CD40L的唯一受体，例如CD40L可以与其他受体结合，例如血小板中的GPIIb/IIIa和白细胞中的Mac-1[8]同样，CD40L并不是唯一与CD40相互作用的蛋白质，例如其他蛋白质如HSP70可以与CD40交互作用[49]本研究利用同一小鼠颈动脉结扎模型和导丝诱导的股动脉剥脱模型，确定了CD40缺乏在新生内膜形成中的作用。CD40的新生内膜病变和管腔狭窄持续减少^−/−两种模型中的小鼠。唯一不同的是，结扎的颈动脉中的动脉重塑受损，而CD40−/-小鼠的去核股动脉中的血管重塑未受损。目前机制尚不清楚。

本研究和未来研究的局限性：未来研究中仍有几个重要问题有待解决。例如，表达CD40和各自TRAF分子的两种不同损伤模型中的细胞类型是什么？哪些NF-kB通路被激活/阻止，是典型的还是非典型的，哪些TRAF参与新生内膜形成的典型/非典型途径？

总之，本研究的新颖之处在于，我们首次确定CD40在体内上调TRAF蛋白和NF-kB依赖性促炎基因中至关重要。同样重要的是，我们的研究确定了CD40在2种不同血管损伤模型中新生内膜形成中的作用。这些发现可能为开发新的血管再狭窄治疗干预措施提供有价值的信息。

支持信息

脚注

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